Utilidad del análisis de gota seca en hiperckemias

Tamaño: px

Comenzar la demostración a partir de la página:

Download "Utilidad del análisis de gota seca en hiperckemias"

María Rosario Fidalgo Maidana
hace 7 años
Vistas:

1 Utilidad del análisis de gota seca en hiperckemias Dr. Cristóbal Colón Mejeras Unidade de Diagnóstico e Tratamento das Enfermidades Conxénitas do Metabolismo Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela

2 Prevalencia conocida en cribado neonatal Un caso por cada x RN vivos Patología Prev. Hipotiroidismo Congénito (CH) Fibrosis Quística (CF) Fenilcetonuria (PKU) Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena media (MCAD) Leucinosis (MSUD) Acidemia Metilmalónica (MMA) Acidemia Glutárica Tipo I (GA I) Déficit de Biotinidasa (BIOT) Galactosemia (Def. gal-1-p-uridiltransferasa GALT) Patología Déficit 3-OH Acil-CoA Deshidrogenasa cadena larga (LCHAD) Prev Acidemia propiónica (PA) Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena muy larga (VLCAD) Tirosinemia tipo I (TYR I) Citrulinemia (CIT) Homocistinuria Clásica (HCY) Deficiencia Primaria de Carnitina (CUD) Déficit de 3-OH-3-Metilglutaril-CoA Liasa (HMG) Acidemia isovalérica (IVA)

3 Polímeros ramificados de glucosa Son la vía más antigua de almacenamiento universal de energía en las células y probablemente se sitúe ya en los albores del origen de la vida celular. Dos formas claramente diferenciadas: Glucógeno en animales. Almidón en plantas.

4 Glucógeno Es la principal vía de almacenamiento de carbohidratos pero no llega al 1% de la energía almacenada en nuestro organismo, ya que ésta es la función del tejido adiposo. Sin embargo, es la principal fuente de energía para los músculos. Y es crucial para la homeostasis, pues es determinante para el balance glucémico.

5 Dónde se encuentra el glucógeno Hígado en donde puede haber 400 g de glucógeno Músculo esquelético con 1200 g de glucógeno Cerebro, en los astrocitos Pulmones fetales, en los neumocitos tipo 2 (responsables de la producción de surfactante).

6 Glucogénesis Enzima ramificante que crea una nueva rama cada glucosas Glucogenina (GYG1 GYG2) que inicia la polimerización de la glucosa y se encuentra en el núcleo del polímero Glucógeno sintasa que une los monómeros de glucosa

7 Glucógeno Häggström, Mikael. "Medical gallery of Mikael Häggström 2014". Wikiversity Journal of Medicine 1 (2). DOI: /wjm/ ISSN

8 Glucogenolisis Glucógeno-fosforilasa α1-4 Transglicosilasa

9 Glucogenolisis α 1-6 glicosidasa

10 LISOSOMA α-1,4 y α-1,6 glucosidasa (GSD II) Enzima ramificante Enlaces α 1-6 (GSD IV) Glucógeno sintasa Enlaces α 1-4 (GSD 0) GLUCÓGENO Fosforilasa hepática (GSD VI) Fosforilasa muscular (GSD V) Enzima desramificante (GSD IIIa, b, c) Fosforilasa quinasa (GSD IXa1, a2, b, c, d) Glucosa-6-fosfatasa (GSD Ia) Transportador Glucosa-6-fosfato (GSD Ib, c, d) GLUCOSA-1-P GLUCOSA-6-P Fructosa-6-P Glicerato 2-P Gliceraldehido 3-P Fosfoglicerato mutasa 2 (GSD X) Dihidroxiacetona-P Glucosa Piruvato Lactato Lactato deshidrogenasa (GSD XI) Fosfofructoquinasa (GSD VII) Fructosa-1,6-BP Aldolasa A (GSD XII)

11 75 años de Enfermedad de Pompe 1932 Joannes Cassianus Pompe (Holanda) describe la enfermedad en un bebé de 7 meses que fallece por hipertrofia cardiaca idiopática 1955 Christian René de Duve (Bélgica) describe los lisosomas 1963 Henri-Géry Hers (Bélgica) describe la deficiencia de la enzima α-1,4 glucosidasa como causa de la enfermedad Frank T. Martiniuk (USA) y Arnold J.J. Reuser (Holanda), consiguen la estructura del gen que codifica el enzima y describen numerosas mutaciones CRIBADOS 2001 Néstor Chamoles describe técnica analítica en gota seca 2006 FDA aprueba Tratamiento enzimático sustitutorio

12 Retraso en el diagnóstico clínico en la Enfermedad de Pompe 5 4, Edad media (meses) Primeros síntomas Diagnóstico Edad media (años) n=168 niños 0 n=255 niños y adultos Kishnani et al. J Pediatr 2006; 148: Winkel et al. J Neurol 2005; 252:

13 Herramientas diagnósticas en Pompe Cardiacas Rx. RM EKG Eco Pulmonares Espirometría Rx, RM Pulsioximetría Estudios del sueño Musculares EMG Test de fuerza muscular

14 Diagnóstico Analítico de Pompe Creatina kinasa sérica (CK) Alanina, aspartato aminotransferasa (ALT/AST) y lactato deshidrogenasa (LDH) Glucosa tetrasacárido urinaria (Glc 4 ) Biopsia muscular: invasiva Técnicas moleculares: paneles genéticos Medición actividad α-glucosidasa

15 Medición de actividad α-glucosidasa Fibroblastos: Se requiere biopsia de piel. Los cultivos de fibroblastos tardan 4 semanas y hay que añadir el tiempo de 3 días para medir la actividad α- glucosidasa. Linfocitos. Los neutrófilos tienen una α-glucosidasa adicional (maltasa-glucoamilasa) y por eso no valen los leucocitos. Necesario procesar la muestra fresca y enviar en hielo o congelada los linfocitos aislados. Gota de sangre seca. Menos invasiva. Si urge, el resultado está en 2 días. Puede ser empleada para cribado neonatal.

17 Calidad de la muestra

18 Ejemplos de muestras inválidas

19 Estado de la Muestra 75% motivos de repetición Obtención: Mal impregnadas Sobreimpregnadas Empleo de alcohol Manipulación: No secar al sol ni con una fuente de calor* Efecto cromatográfico por secado inadecuado Contaminación con heces, bacterias, hongos etc. Retraso en el envío y/o recepción de las muestras en la Unidad *Waite, KV et al Clin. Chem. 33 (6):

20 2,10 Influencia de anticoagulante en gota seca de sangre impregnada en papel 2,05 sin aditivo 2,06 heparina 2,04 2,00 citrato 2,01 1,95 EDTA 1,93 1,90 1,85 alfa-galactosidasa

21 Reacción enzimática con sustrato marcado

22 Factores que afectan a la actividad enzimática Temperatura ph Concentración del sustrato (saturación) Concentración del enzima (defecto enzimático) Inhibición enzimática

23 Determinación directa La más fiable, mejor sobre leucocitos o fibroblastos. Ejemplo: Enf. de Fabry Más rápida sobre gota seca.

24 Enfermedad de Fabry Una enzima implicada: alfa-galactosidasa A. N-acetilgalactosamina como inhibidor de la alfa-galactosidasa B. Se intentan reproducir la condiciones fisiológicas a ph 4,4, 37ºC durante 20 horas. Se detiene la reacción cambiando a ph 10 y en donde la 4MU se vuelve fluorescente. Medición directa sobre una recta de 4MU

25 Ejemplo determinación enzimática Cont. Fluorescencia nmol pmol S , S , S , S , S , S , S , S , S , S , S , S , Muestra FluorescenciaFluor-blanco pmol umol/l/h LS ,39 5,2 LS ,5 171,09 2,7 LS ,5 2,68 0,0 C.LOW ,69 0,0 Concentración 4MU y = 56,089x ,2 R² = 0,

26 Determinación indirecta Cuando existe superposición de diversos enzimas. Ejemplo: Enf. de Pompe

27 Alfa-glucosidasas 4 enzimas glucosidasas implicadas: Alfa-glucosidasa lisosomal (GAA) que es la que nos interesa medir y se activa a ph 3,5-6,0. Residuo Trp Dos alfa-glucosidasas que se activan a ph 7,0-7,5. Maltasa-glucoamilasa (MGA) que se activa a ph 3,0-8,0 superponiéndose a todas las anteriores. Residuo Tyr Se intentan reproducir las condiciones fisiológicas trabajando a ph 3,9 y 6,5, incubando 24 h a 37 C. Se intenta inhibir la MGA con una molécula por la que tiene más apetencia que la GAA, la acarbosa. Medición compleja: 8 por muestra sobre recta de 4MU.

28 Resultados Pompe Una actividad glucosidasa total baja en medio ácido orienta hacia cualquiera de estas interpretaciones (no excluyentes): Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática, empleo de EDTA, leucopenia, ) Que estamos ante un posible caso de E. Pompe. Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamente normal. Una actividad glucosidasa neutra baja orienta hacia cualquiera de estas interpretaciones (no excluyentes): Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática, empleo de EDTA, leucopenia, ) Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamente normal. Una actividad glucosidasa ácida inhibida baja indica (no excluyentes): Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática, empleo de EDTA, leucopenia, ) Que estamos ante un posible caso de E. Pompe.

29 Interpretación Pompe

30 Resultados alfa-glucosidasa 0% 20% 40% 60% 80% 100% 70 Inicio infantil Inicio juvenil Inicio adulto

31 Muestras con Historial Clínico Pediátrico 0% 20% 40% 60% 80% 100% Hiper CKemia

33 Long-Term Prognosis of Patients with Infantile-Onset Pompe Disease Diagnosed by Newborn Screening and Treated since Birth Chien, Yin-Hsiu et al. The Journal of Pediatrics,2015. Volume 166, Issue 4, e2 Resultados motores y de supervivencia de los pacientes que fueron diagnosticados por NBS en comparación con los diagnosticados clínicamente. En rojo los casos del cribado (NBS); en verde los casos diagnosticados clínicamente tratados y en azul los casos no diagnosticados clínicamente y no tratados (historia natural). A, curva de supervivencia de Kaplan-Meier ajustada por edad. B, curva de supervivencia de Kaplan-Meier de pacientes sin soporte ventilatorio

34 Conclusiones ensayo en DBS Pompe Muestra: Fácil de obtener Transporte por correo y a temperatura ambiente (bajos costes de envío) Gran estabilidad de la muestra si es correcta y luego se conserva en nevera. Técnica analítica: Preparación sencilla en el laboratorio Técnica reproducible Requiere poca muestra y esto es importante en neonatos Muestra es menos infecciosa Coste relativamente barato Los casos graves son fácilmente detectables OJO! Las formas del adulto e intermedias pueden resultar falsos negativos.

35 Muchas gracias

Documentos relacionados

SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE GLUCÓGENO

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS FASE I, UNIDAD DIDÁCTICA: BIOQUÍMICA MÉDICA 2º AÑO CICLO ACADÉMICO 2,011 SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE GLUCÓGENO Dr. Mynor A. Leiva Enríquez