A CIRCUITOUS ROUTE TO NONCODING RNA

Transcripción

1 A CIRCUITOUS ROUTE TO NONCODING RNA Resumen del artículo de Jeremy E. Willusz y Phillip A. Sharp. Science 340, (2013) 1. Introducción 2. Biogénesis y características de los RNAs circulares 3. RNAs circulares, microrna y expresión génica 4. Ejemplos de metodología experimental relevante en el estudio del RNA circular 5. Conclusiones 6. Bibliografía Diego Martínez Alonso Genética Molecular Grado en Biología. Universidad Autónoma de Madrid

2 1. Introducción La mayor parte de la información genética se expresa mediante proteínas que, sin embargo, son codificadas por solo un 2-3% del genoma humano. El estudio del genoma mediante secuenciación masiva ha arrojado luz acerca del restante 98%, hasta ahora considerado DNA basura, determinando que codifica para numerosos RNAs. Dado que la transcripción juega un papel funcional en esta región del DNA, se ha puesto de manifiesto la necesidad de una búsqueda de funciones para estas moléculas. DNA no codi)icante 98% DNA codi)icante 2% Secuencias reguladoras 24% DNA repetitivo asociado a elementos móviles 44% DNA codi)icante 2% DNA repetitivo 15% DNA no repetitivo 15% Fig. 1. Proporción de las diferentes clases de DNA presentes en el genoma humano atendiendo a estructura/función Hace tan solo una década que se descubrió que el DNA que no codifica proteínas juega un papel regulatorio esencial sobre las regiones de DNA codificante. Estos RNAs no codificantes (ncrna) entre los que se incluyen los micrornas o los RNAs no codificantes intergénicos, varían en longitud, pero al igual que los codificantes, son moléculas lineales con extremos 5 y 3 que reflejan los lugares de comienzo y terminación de la RNA polimerasa sobre la plantilla de DNA. No obstante algunos de estos RNAs no son lineales: Los RNAs circulares poseen sus extremos unidos covalentemente. Estos RNAs se han encontrado en patógenos como viroides (virus-like infectious particles) y el virus de la hepatitis δ (HDV), el cual causa diversas patologías asociadas al hígado en humanos infectados con hepatitis B, y replica mediante un mecanismo de círculo rodante. Tras su secuenciación se ha comprobado que el RNA circular que constituye el genoma

3 del HDV precisamente tiene ciertas similitudes con los RNAs circulares de viroides de plantas [1]. También se han identificado RNAs circulares en genomas eucariotas, aunque su función no es del todo clara ya que se generan aparentemente por errores en la maquinaria de splicing [2]. Ejemplos de ello son el gen ETS, que codifica un factor de transcripción, y que puede originar transcritos de RNA circular, que fueron de los primeros identificados como RNAs circulares procedentes de genes eucariotas [3] y el gen Sry, que determina el sexo en mamíferos, está altamente conservado entre especies de los mismos, y cuyos transcritos en testículos adultos se han identificado como moléculas de RNA circular y son las mejor caracterizadas hasta el momento. Los RNAs circulares, compuestos por secuencias exónicas, representan una clase de RNA no codificante poco estudiada, descubierta hace más de 20 años [3, 4, 5], cuya estructura procede de modificaciones en el proceso de splicing o una estructura genómica inusual en los intrones circundantes. Fig. 2. Los extremos terminales de un RNA sometido a splicing canónico se alinean secuencialmente con el genoma (arriba) pero en orientación opuesta para el caso de un RNA circular. Modificado de S. Memczak et al., Nature 495, 333 (2013) Durante mucho tiempo se ha considerado estas moléculas carentes de función, pero recientemente se han encontrado evidencias que sugieren lo contrario, como las que relacionan los RNAs circulares con genes asociados al riesgo de aterosclerosis [2] [9], lo que ha suscitado interés en encontrar posibles funciones. La función atribuida por algunos autores a los RNAs circulares es la del control de la expresión génica. Parecen estar involucrados en secuestrar moléculas de microrna, de forma que constituyen un segundo nivel de regulación, entendiendo que el primer nivel lo constituyen los micrornas, sobre la expresión génica. La acción de estos ncrnas en el modelo sugerido es antagónica. En este resumen se tratarán los aspectos mencionados relacionados con la estructura, características y biogénesis de los RNAs circulares, la regulación que ejercen sobre los micrornas, el papel del balance entre ambos en la regulación de la expresión génica y otras posibles funciones.

4 2. Biogénesis y características de los RNAs circulares Métodos de secuenciación masiva combinados con nuevos algoritmos computacionales han permitido el hallazgo de cientos de miles de RNAs circulares desde arqueas hasta humanos, sugiriendo que los RNAs circulares son más abundantes de lo que se pensaba [11]. Solo los fibroblastos humanos contienen aproximadamente RNAs circulares [2]. Derivados del 15% de los genes transcritos activamente, contienen mayormente secuencias exónicas (normalmente entre uno y cinco exones). Grandes cantidades de RNAs circulares se acumulan en el citoplasma de las células, a veces excediendo la abundancia de sus equivalentes RNAs lineales por un factor 10. Esto es debido mayormente a que los RNAs circulares son resistentes a la degradación por muchas maquinarias celulares que reconocen las porciones finales del RNA lineal [2]. En las células, diferentes moléculas de RNA son unidas por reacciones de splicing (transsplicing), pero la unión covalente de los extremos terminales de una misma molécula de RNA para formar un RNA circular se ha considerado durante mucho tiempo un evento muy poco usual [11]. La maquinaria de splicing está claramente implicada en su biogénesis, ya que las señales de splicing canónicas generalmente flanquean su secuencia. No obstante, el mecanismo exacto por el que la maquinaria de splicing selecciona regiones en particular para su circularización no ha podido ser detallado todavía. Dado que los eucariotas tienen los genes divididos, sus mrnas precursores (pre-mrnas) deben ser modificados de forma que se eliminen los intrones y se unan los exones. En ciertos casos en los que se generan RNAs circulares, la maquinaria de splicing no une dos exones, y en lugar de ello, por ejemplo, une los extremos de un mismo exón. También se han reportado casos (arqueas) en los que se produce la unión de intrones en forma circular, dando lugar a moléculas de RNA circular menos estables pero para las que no se descarta función biológica [12]. En la biogénesis del RNA circular se da un mecanismo de splicing no canónico. En esta forma de splicing, un sitio de empalme huérfano en 3 corriente arriba del exón aceptor puede servir como el sitio aceptor para un sitio de empalme corriente abajo en 5 que no está apareado con su aceptor canónico de splicing, produciendo un transcrito circular (Fig. 3) [9].

5 Fig. 3. Modelo para explicar la generación de moléculas de RNA circular. A la izquierda: diagrama esquemático del proceso de splicing canónico que elimina el primer intrón de un pre-mrna de un gen de 4 exones, y la subsecuente eliminación de los intrones 2 y 3. El splicing canónico del exón 1 al exón 2 ocurre cuando la maquinaria de splicing cataliza la formación de un lazo con el intrón y el ataque al 3 OH libre del exón 1 en el sitio 3 corriente arriba del exón 2. Esto produce un lazo conteniendo el intrón 1 y un pre-mrna con los exones 1 y 2 unidos. A la derecha: modelo para la producción de transcritos circulares. Si hay un sitio canónico de iniciación de la transcripción, y si la escisión de intrones no procede de forma secuencial en el tiempo de 5 a 3 del pre-mrna, puede darse el apareamiento no canónico de los lugares de empalme en 5 y en 3. Dado que la secuencia de cada sitio de splicing en 5 del pre-mrna contiene las mismas señales de splicing, es posible que el sitio de empalme en 3 corriente arriba del exón 2 aparee con el sitio de empalme 5 corriente abajo del exón 3, y el splicing avance como si este sitio de empalme en 5 estuviera apareado con el sitio de empalme en 3 corriente arriba del exón 4. En este caso, el exón 3 se empalmaría corriente arriba del exón 2, creando un pre-mrna intermedio compuesto por estos dos exones y el intrón 2. El splicing canónico eliminaría este intrón, liberando un RNA circular compuestos por los exones 2 y 3. El inicio de la transcripción no canónica puede producir un lugar de empalme huérfano en 3 correspondiente al primer exón transcrito. Este sitio de empalme podría aparear con un sitio de empalme corriente abajo en 5, generando un RNA circular. En ambos modelos, el intrón escindido sería linear y ramificado, y sería de esperar que rápidamente fuese degradado. Tomado de J. Salzman, et. al, (2012). En ciertos casos se ha sugerido que el RNA circular no procede de errores en el proceso de splicing : La presencia de repeticiones invertidas en los intrones circundantes y/o los eventos de eliminación exones pueden jugar un papel en el mecanismo de circularización. Esto se da, por ejemplo, en el caso del locus SRY, donde el proceso de splicing es normal y la estructura circular es consecuencia de la estructura genómica inusual consistente en repeticiones invertidas que rodea el locus del gen [4, 9]. Es además característico en cuanto a la estructura de los RNAs circulares que carezcan de la cola de poli-a [3, 9], y a través de su interacción con los micrornas (que se comenta más adelante) puedan asociarse con proteínas de la familia Argonauta. Los RNAs circulares fueron descubiertos en plantas y agentes virales. En organismos unicelulares, los RNAs circulares se desarrollan a partir de pre-rrnas, pero en arqueas también

6 pueden surgir de genes codificantes para proteínas. En los RNAs circulares hallados en animales, el espliceosoma parece unir los extremos corriente arriba (59) y corriente abajo (39) de los exones del mismo transcrito. Probablemente el RNA circular mejor conocido es el antisentido del RNA del locus SRY (sex-determining region Y) que se expresa en grandes cantidades en testículos. Sin embargo algunos autores sostienen que no está claro cuál es la función biológica de los RNAs circulares en organismos eucariotas [2, 9, 11]. Los RNAs circulares son moléculas estables que muestran una expresión específica de tejido, tipo celular y estado de desarrollo. Por ejemplo, el RNA circular hsa-circrna (humano) aparece en los leucocitos CD19 + pero no se detecta en los leucocitos CD34 +, neutrófilos, o células HEK293. De forma análoga, una serie de RNAs circulares de nematodos son expresados en los oocitos pero están ausentes en los embriones de una o dos células [11]. Además, muestran sus secuencias enriquecidas en nucleótidos conservados, indicando que los RNAs circulares compiten con otros RNAs por la unión a otras moléculas mediante RBPs (RNA binding proteins) o micrornas [11]. Como se ha mencionado, para un conjunto de RNAs circulares, las señales de circularización parecen conservadas evolutivamente, como demuestra el hecho de que algunas se encontraran en ratón y humanos [2]. Dicha conservación se da tanto en genes ortólogos como parálogos, lo que indica que la formación de RNAs circulares es un proceso preservado evolutivamente y por tanto sugiere la existencia de importantes funciones. Se ha documentado, por ejemplo, la existencia de abundantes transcritos de RNAs circulares procedentes de los genes parálogos de las quinasas HIPK2 y HIPK3, determinando que la conservación de la circularización del RNA se da en genes parálogos y ortólogos de la familia HIPK [2]. 3. RNAs circulares, microrna y expresión génica Experimentos recientes sugieren que los RNAs circulares constituyen una gran clase de reguladores post-transcripcionales [11]. Evidencias como la abundancia de estos transcritos, su estabilidad, su expresión específica de tejido, tipo celular y etapa del desarrollo, así como el análisis de sus secuencias, apoyan esta teoría.

7 Los RNAs circulares tienen en su secuencia lugares muy conservados de unión a micrornas, lo que sugiere que ejercen su regulación a través de la interacción con estas moléculas. En comparación con los RNAs circulares, los micrornas están mucho más estudiados. Los micrornas son pequeños reguladores (aproximadamente 21 nucleótidos de longitud) no codificantes de la expresión génica. Cada microrna controla la expresión de un gran conjunto de genes, y, conjuntamente, los micrornas podrían regular aproximadamente la mitad de los genes humanos [6]. Esta clase de RNA es generada por la encima Dicer a partir de estructuras de RNA en horquilla [7], y se asocian con y guían a la proteína argonauta (AGO) a los mrnas de genes codificantes para reprimir su traducción [11]. En humanos, los micrornas regulan directamente la expresión de la mayoría de mrnas, influyendo en un rango muy diverso de funciones biológicas [11]. Un RNA circular en particular hallado en el cerebro humano y de ratón de 1500 nucleótidos contiene, sorprendentemente, más de 70 lugares evolutivamente conservados de unión para el microrna mir-7, sobre el que actúa como regulador negativo [10,11]. Los micrornas funcionan mediante la unión a través del apareamiento de bases a mrnas y la represión de su traducción y/o su degradación. No obstante, los micrornas pueden unirse a cualquier tránscrito que contenga una secuencia complementaria y de hecho, el RNA circular antes mencionado, antisentido para el tránscrito de la proteína 1 relacionada con la degeneración del cerebelo (CDR1as) puede unir eficientemente alrededor de micrornas mir-7 por célula, evitando por tanto la unión de mir-7 a otros RNAs [11]. Fig. 4. Los RNAs circulares secuestran e inhiben micrornas. Los intrones no codificantes (flanqueados por los sitios de empalme ss ) son eliminados del pre-mrna por la maquinaria de splicing para después añadir una cola de poli- A, que protege el mrna de la degradación. El mrna es entonces traducido en los ribosomas a no ser que se produzca la unión del mismo con micrornas asociados a la proteína argonauta (AGO). Posteriormente esta interacción inhibe la traducción y/o degrada el mrna. La maquinaria de splicing puede también llevar a cabo un proceso alternativo conocido como backsplice y generar RNAs circulares cuyos extremos 3 y 5 están unidos de forma covalente (derecha). Grandes cantidades de estos RNAs circulares secuestran los micrornas impidiendo su unión a los mrnas diana. Tomado de J. E. Wilusz, P. A. Sharp, Science, 340, 440 (2013)

8 De forma consistente con un modelo que propone que los RNAs circulares compiten e inhiben la acción de los micrornas, una disminución en la expresión de estos RNAs circulares en las células también causa una disminución en el número de mrnas con sitios de unión a mir-7, indicativo del aumento de la unión de mir-7 a estos mrnas causando su degradación. De igual forma, esto explica como en condiciones en las que el RNA circular CDR1as ejerce su acción mir-7 es regulado negativamente, hecho congruente con su expresión superpuesta y específica de tejido neuronal (Fig. 5). mir-7 también se expresa abundantemente en tejidos no neuronales como el colon, pero no así CDR1as. Esto implica que la interacción entre este microrna y CDR1as se da solo en el tejido neuronal, donde su expresión es similar (no idéntica) y CDR1as constituye un transcrito circular estable, resistente a la degradación mediada por microrna y citoplasmático, que controla la acción de mir-7 de forma muy potente [11]. Fig. 5. CDR1as y mir-7 tienen una expresión superpuesta y específica de tejido neuronal. a) Esta figura muestra como entre los tejidos de ratón estudiados en el experimento los tejidos neuronales co-expresan mir-7 y CDR1as (las barras indican la desviación estándar). b) Tinción in situ de CRD1as y mir-7 en el embrión de cerebro de ratón. (U6 y mir-124 son el control positivo. La prueba de scrambling, el control negativo). Tomado de S. Memczak et al., Nature 495, 333 (2013) Es además importante señalar que mir-7 une eficientemente la proteína AGO2 (Argonauta2) [10], que es el único miembro de la familia Argonauta con actividad endonucleasa [7]. Cuando mir-7 es unido por CDR1as, o cirs-7 (circular RNA sponge for mir-7), como lo han denominado otros autores [10], se une también a la proteína AGO2 que estaba asociada con mir- 7, resultando en la formación de un complejo ternario [10]. Considerando el papel de mir-7 como regulador clave en varios tipos de cáncer, y la implicación sugerida en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson a través del control directo de la expresión de la proteína α-sinucleína, es probable que cirs-7 esté involucrado de forma significativa en el funcionamiento de las neuronas e implicado en trastornos neurológicos y en el desarrollo de tumores cerebrales [10].

9 Otros RNAs circulares podrían funcionar de forma similar regulando la actividad de otros micrornas. Por ejemplo, en ratón, la región sex-determining región Y (sry), que como se mencionaba juega un papel fundamental en el desarrollo de los testículos, genera un RNA circular que contiene 16 sitios de unión a mir-138 [10]. Los RNAs circulares por tanto se incluyen en una clase creciente de RNAs que controlan la acción de los micrornas. Esta clase incluye RNAs endógenos competentes y RNAs procedentes de pseudogenes (genes no funcionales). Sin embargo, comparadamente a los RNAs endógenos competentes y los RNAs procedentes de pseudogenes, los RNAs circulares constituyen un mecanismo de control de microrna mucho más potente dado que se expresan en cantidades mucho mayores y tienen más sitios de unión a micrornas. De hecho, al contrario que los RNAs endógenos competentes, los RNAs circulares parecen ser resistentes a la degradación de RNA desencadenada por micrornas y por tanto tienen vidas medias más largas [10]. Además de regular micrornas, los RNAs circulares pueden estar implicados en unir y secuestrar proteínas de unión a RNA, resultando en la formación de grandes complejos RNA-proteína, además de llevar a cabo apareamiento de bases con mrnas, evitando así su degradación. Debido a sus altos niveles de expresión y conservación, y la presencia de una ORF en su secuencia, se exploró la posibilidad de que algunos RNAs circulares pudieran producir proteínas, ya que RNAs circulares sintéticos pueden ser eficientemente traducidos [8]. No obstante no se encontraron evidencias al respecto [2]. Evidencias recientes muestran que los RNAs circulares pueden ser diana del proceso de RNA interferente [2], un proceso implicado en la defensa antiviral en plantas e invertebrados, del que aún se desconoce su implicación en mamíferos [14]. 4. Ejemplos de metodología experimental relevante en el estudio del RNA circular A continuación se describen dos experimentos relevantes que apoyan lo expuesto hasta ahora: 1. Estabilidad y localización de los RNAs circulares. Dada su abundancia relativa, su localización citoplasmática y su alta estabilidad, la acción de control de los RNAs circulares sobre los micrornas es la más efectiva de entre los RNAs endógenos competentes.

10 William R. Jeck y colaboradores llevaron a cabo una estrategia sencilla pero eficaz para confirmar la estabilidad y localización esperada para los RNAs circulares. Para ello realizaron un experimento con células en cultivo utilizando una línea celular humana inmortal de fibroblastos (Hs68). Estas células fueron tratadas con actinomicina D, un inhibidor de la transcripción, y se midió la cantidad total de RNA de las células a determinados tiempos (Fig. Figura 6. El RNA circular es muy estable y su localización es citoplasmática. El ensayo de estabilidad del RNA utilizando actinomicina y la cuantificación mediante qrt-pcr demuestra: A)la estabilidad esperada de los transcritos control y B) productos génicos menos estables comparadamente con C) las formas de RNA circular altamente estables procedentes de los mismos genes. D) hibridación in situ fluorescente de RNA usando una muestra circular específica de HIPK3 demuestra su localización citoplasmática (fotografía de arriba). El uso de sirna que tienen por diana los RNAs lineares no afecta la localización de los circulares (fotografía de en medio), mientras que el uso de sirna que tiene por diana tanto transcritos lineares como circulares, extingue la detección de especies citoplasmáticas. Tomado de W. R. Jeck et al., RNA 19, 141 (2013) 6). Mientras que RNAs altamente estables como 18S o p16 INK4a mostraron tiempos medios de vida muy largos (>48 h.), la abundancia de tráscritos menos estables como c-myc o TATA Binding Protein (TBP) cayó después del tratamiento con actinomicina, por lo que mostraron vidas medias muy cortas (<3 h.) (Fig. 6A). El análisis de cuatro RNAs circulares y sus mrnas asociados revelaron que, mientras los RNAs lineales asociados tenían vidas medias de <20 h. (Fig. 6B), las isoformas de RNA circular eran altamente estables, con vidas medias para los transcritos que superaban las 48 h. (Fig. 6C). La hibridación por fluorescencia in situ (FISH) contra HIPK3 demostró que las formas circulares de HIPK3 se localizan preferentemente en el citoplasma (Fig. 6D). Estos resultados demuestran que los RNAs circulares son exportados desde el núcleo o son liberados en el citoplasma durante la mitosis, donde son extraordinariamente estables gracias a la resistencia a enzimas como las RNA exonucleasas. 2. Función de los RNAs circulares: Sry, Sry circrna y mir-138. La función principal atribuida al RNA circular es la de regulador negativo de la acción de los micrornas, a través de la unión a éstos mediante complementariedad de bases.

11 Para demostrarlo, T. B. Hansen y colaboradores llevaron a cabo un experimento con el RNA de Sry. Tras identificar mediante predicción de complementariedad de bases 16 sitios de unión del mirna mir-138 al RNA de Sry (Fig. 7a), diseñaron un vector que expresara el RNA circular de Sry (Sry circrna). La biogénesis del RNA Sry circular a partir de este vector fue verificada mediante Northern Blot y RT-PCR. Para comprobar que Sry circrna actúa como un RNA endógeno que compite e inhibe la acción de mir-138, se realizó una construcción que incluía la secuencia de Sry y la de un gen reportero (luciferasa), y se midió el descenso en la actividad de mir-138 en presencia o ausencia de Sry circrna. En efecto, después de la co-expresión de mir-138 y Sry, observaron un descenso de la luminiscencia de hasta cuatro veces comparado con la obtenida de la transfección con Figura 7. El RNA circular de Sry interacciona con mir-138. a) Diagrama del locus Sry de ratón que muestra los lugares aceptores y donadores de splicing que facilitan la circularización de Sry. Las líneas perpendiculares indican los sitios diana de unión de mir-138. b) Los ensayos con luciferasa y la secuencia Sry completa. La luminiscencia fue medida 48 horas después de la transfección con el gen reportero luciferasa y vectores de expresión para mir-138 (pjebb-138) o mir-769 (pjebb-769) y un vector vacío (empty vector; EV; pcdna3) o un vector de expresión con Sry (pcdna3-sry). *P<0,05. c) inmunoprecipitación de AGO2 marcada con Myc a partir de células HEK293 co-transfectadas con el vector de expresión Sry, Myc-AGO2 o vector vacío y pjebb-138 o pjebb-769 como se mencionaba. Los niveles de Sry circrna de ratón y GADPH humana fueron cuantificados por qrt-pcr y los ratios realtivos de inmunoprecipitación son representados gráficamente. d) células HEK293 fueron transfectadas con mir-7 o mir biotinilados junto con el vector de expresión de Sry. Se analizaron los niveles de Sry circrna y GADPH mediante qrt-pcr. Modificado de Hansen et al., Nature, 495, 384 (2013) mir-769 (en células control), lo que sugiere que los sitios diana de mir-138 facilitan el efecto de microrna (Fig. 7b). La posibilidad de usar otro mirna como control reside en que, dado que los sitios diana de mir-138 se encuentran en el gen Sry, mir-769 no tendrá ningún efecto por carecer de dichos sitios (no regula Sry), y por tanto no se observará una disminución de la traducción del gen reportero. No obstante, incluso en ausencia del RNA circular observaron cierta disminución en el efecto de mir-138, probablemente debido a una modesta biogénesis de Sry circrna desde el vector Sry. La inmunoprecipitación de AGO2 marcada con Myc a partir de células transfectadas con mir-138 resultó en un enriquecimiento hasta 10 veces superior en Sry circrna en comparación con células transfectadas con mir-769 (Fig. 7c). Esto es debido a que Sry

12 circrna interacciona con mir-138 pero no así con mir-769: Sry circrna solo aparecerá asociado a AGO2 cuando haya interaccionado con un microrna (en este caso este microrna es mir-138). Para verificarlo, utilizaron mir-138 biotinilado y capturaron específicamente Sry circrna (enriquecimiento hasta 6 veces superior en comparación con mir-7 biotinilado) (Fig. 7d) demostrando que Sry circrna es capaz de interaccionar con mir-138. En este caso mir-7 apenas muestra interacción con Sry circrna: en la reacción qrt-pcr los valores de Sry circrna son superiores con respecto a mir-138 indicando una mayor especificidad de unión por este microrna. En referencia a lo expuesto en el apartado anterior (RNAs circulares, microrna y expresión génica, Fig. 5) para mir-7 esperaríamos obtener lo contrario si se utilizara cirs-7 (mayor interacción de cirs-7 con mir-7, menor con mir-138). A partir de este resultado sugieren que Sry circrna actúa como un RNA endógeno que compite e inhibe la acción de mir-138. En ambos casos se utilizó la molécula GADPH (proteína humana) como control negativo de la qrt-pcr. Los transcritos de esta proteína en ningún caso dan interacción con el RNA circular Sry circrna. 5. Conclusiones Los RNAs circulares son una clase de ncrna cuyos extremos están unidos covalentemente, y generalmente constituidos por secuencias exónicas (entre 1 y 5 exones) La maquinaria de splicing está claramente implicada en su biogénesis dado que las señales canónicas de splicing flanquean su secuencia. También se ha sugerido que en ciertos casos dicha biogénesis dependa de secuencias repetidas invertidas que rodean el locus (como es el caso del locus SRY) Los RNAs circulares son resistentes a la degradación mediada por microrna y por nucleasas citoplasmáticas, lo que explica que su abundancia y estabilidad sean superiores con respecto a otros RNAs Las moléculas de RNA circular tienen una expresión específica de tipo celular, tejido y etapa de desarrollo. Además, presentan secuencias ricas en nucleótidos conservados, con múltiples sitios de unión a micrornas

13 El hecho de que las secuencias de los RNAs circulares estén conservadas aporta una importante evidencia acerca de su función, la unión a micrornas, sugiriendo que su biogénesis no es un hecho aleatorio sino que se ha preservado evolutivamente Por tanto los RNAs circulares son reguladores post-transcripcionales no codificantes de la expresión génica, que ejercen su acción a través de la interacción con micrornas Además de esta función principal, los RNAs circulares están implicados en unir y secuestrar mrnas, evitando así su degradación. También se ha demostrado su interacción con proteínas de unión a RNA, resultando en la formación de grandes complejos RNAproteína 6. Bibliografía [1] K. S. Wang et al., Nature 323, 508 (1986) [2] W. R. Jeck et al., RNA 19, 141 (2013) [3] C. Cocquerelle, B. Mascrez, D. Hétuin, B. Bailleul, FASEB J. 7, 155 (1993) [4] B. Capel et al., Cell 73, 1019 (1993) [5] Nigro et al., Cell (1991) [6] Mor. E, Shomron. N, Bioessays 881, (2013) [7] P. Parameswaran et al, Plos Pathogens (2010) [8] C. Y. Chen, P. Sarnow, Science 268, 415 (1995) [9] J. Salzman, C. Gawad, P. L. Wang, N. Lacayo, P. O. Brown, PLoS ONE 7, e30733 (2012) [10] T. B. Hansen et al., Nature 495, 384 (2013) [11] S. Memczak et al., Nature 495, 333 (2013) [12] M. Danan et al., Nucleic Acids Res. 40, 3131 (2012) [13] J. E. Wilusz, P. A. Sharp, Science, 340, 440 (2013) [14] P. V. Maillard et al, Science, 342, (2013)

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