Abbott RealTime HIV-1

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1 6L /R1 Abbott RealTime HIV-1 Nota: consulte las modificaciones marcadas es 6L /R1 Símbolos utilizados Fabricante referencia lote Producto sanitario para diagnóstico in vitro Control interno Envase de reactivos de amplificación Calibrador A Calibrador B Control negativo Control positivo bajo Control positivo alto Almacénese a 10 C o menos Fecha de caducidad Consulte las instrucciones de uso ATENCIÓN: maneje los productos de origen humano como potencialmente infecciosos. Consulte las instrucciones de uso. (Riesgo de infección) Si desea una explicación más detallada sobre los símbolos utilizados para cada componente, consulte el apartado REACTIVOS. Centro de Asistencia Técnica de Abbott: Internacional: póngase en contacto con el Centro de Asistencia Técnica de Abbott Molecular. Lea atentamente estas instrucciones de uso antes de utilizar este producto. No se puede garantizar la fiabilidad de los resultados de este ensayo si no se siguen exactamente las instrucciones indicadas. NOMBRE Abbott RealTime HIV-1 FINALIDAD DE USO Abbott RealTime HIV-1 es un ensayo in vitro de reacción en cadena de la polimerasa previa transcripción inversa (RT-PCR) para la determinación cuantitativa del virus de la immunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) en plasma humano de individuos infectados por el VIH 1 que presenten de 40 a copias/ml de RNA del VIH-1, este ensayo es realizado en el sistema automatizado m2000. El ensayo Abbott RealTime HIV-1 está diseñado para ser utilizado junto con el cuadro clínico y otras pruebas analíticas como indicador del pronóstico de la enfermedad y como ayuda en la evaluación de la respuesta vírica al tratamiento antirretrovírico medida por los cambios en las concentraciones de RNA del VIH-1 en el plasma. Este ensayo no está diseñado para ser utilizado como análisis de cribado de donantes para el VIH-1 ni como análisis de diagnóstico para confirmar la presencia de una infección por VIH-1. RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente causante del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). 1 3 Se puede transmitir por contacto sexual, exposiciones a sangre o productos sanguíneos infectados o a través de una madre infectada al feto. 4 El síndrome agudo del VIH, caracterizado por síntomas semejantes a los de una gripe, se desarrolla a la tercera o quinta semana de la infección inicial y se asocia a una viremia alta. 5,6 En un periodo de cuatro a seis semanas de la aparición de los síntomas, se puede detectar una respuesta inmunológica específica al VIH. 7,8 Tras la seroconversión, la carga vírica en sangre periférica disminuye y la mayoría de los pacientes pasan a una fase asintomática que puede durar años. 9 La determinación cuantitativa de la concentración de VIH en sangre periférica ha contribuido enormemente al entendimiento de la patogenia de la infección por VIH 10,11 y se ha demostrado que es un parámetro importante para el pronóstico y el tratamiento de las personas infectadas por VIH Las decisiones relativas a iniciación o cambios en el tratamiento antirretrovírico se guían por la monitorización de las concentraciones plasmáticas del RNA del VIH (carga viral), recuento de linfocitos T CD4+ y la situación clínica del paciente. 17,18 La meta del tratamiento antirretrovírico es reducir el virus VIH en el plasma por debajo de las concentraciones detectables por los análisis de viremia disponibles. 17,19 Las concentraciones plasmáticas de RNA del VIH se pueden cuantificar por la amplificación de los ácidos nucleicos o por tecnologías de amplificación de la señal El ensayo Abbott RealTime HIV-1 utiliza la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con la detección de fluorescencia homogénea en tiempo real. El diseño de la sonda fluorescente parcialmente de doble cadena permite la detección de distintos subtipos del grupo M y cepas del grupo O. El ensayo está estandarizado frente a un patrón vírico del Virology Quality Assurance (VQA) Laboratory (Laboratorio de aseguramiento de la calidad en virología) del AIDS Clinical Trial Group (Grupo de ensayo clínico del SIDA), 23 y frente al primer patrón internacional para RNA del VIH-1(97/656) de la OMS. 24,25 Los resultados del ensayo pueden comunicarse en copias/ml o unidades internacionales/ml (UI/ml). PRINCIPIOS BIOLÓGICOS DEL PROCEDIMIENTO El ensayo Abbott RealTime HIV-1 utiliza la RT-PCR 26 para generar producto amplificado del genoma del RNA del VIH-1 en muestras clínicas. Al principio de la preparación de la muestra se introduce en cada una de las muestras una secuencia de RNA no relacionada con la secuencia diana del VIH-1. Esta secuencia de RNA no relacionado se amplifica simultáneamente por RT-PCR y sirve como control interno (IC) para demostrar que el proceso se ha realizado correctamente para cada muestra. La cantidad de secuencia diana del VIH-1 presente en cada amplificación se mide mediante el uso de sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia en el instrumento Abbott m2000rt. Las sondas no generan señales a no ser que estén ligadas específicamente al producto amplificado. El ciclo de amplificación por el que el sistema Abbott m2000rt detecta una señal fluorescente es proporcional al log de la concentración de RNA del VIH-1 presente en la muestra original. 1

2 Preparación de las muestras El objetivo de la preparación de la muestra es extraer y concentrar las moléculas de RNA diana posibilitando que la diana sea accesible a la amplificación y eliminando los posibles inhibidores de la amplificación del extracto. El instrumento Abbott m2000sp prepara las muestras para el ensayo Abbott RealTime HIV-1 usando los reactivos del sistema de preparación de muestras Abbott msample Preparation System (4 24 preparaciones). El m2000sp utiliza la tecnología de partículas magnéticas para capturar los ácidos nucleicos y lava las partículas de los componentes de la muestra no ligados. Los ácidos nucleicos ligados se eluyen y se transfieren a la placa de 96 pocillos. Los ácidos nucleicos están listos para la amplificación. El control interno (IC) se lleva a cabo a lo largo de todo el protocolo de preparación de muestra, junto con los calibradores, los controles y las muestras. Preparación de los reactivos y del conjunto de placas de reacción El sistema Abbott m2000sp combina los componentes de los reactivos de amplificación Abbott RealTime HIV-1 [HIV 1 Oligonucleotide Reagent (reactivo de oligonucleótidos VIH-1), Thermostable rtth Polymerase Enzyme (enzima polimerasa rtth termoestable) y Activation Reagent (reactivo de activación)]. El sistema Abbott m2000sp dispensa la mezcla resultante en la placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott junto con las alícuotas de las muestras de ácidos nucleicos preparadas en el sistema Abbott m2000sp. Después de la colocación manual del sello óptico, la placa está lista para ser transferida al sistema Abbott m2000rt. Amplificación El RNA diana se convierte en cdna durante la reacción de la amplificación en el sistema Abbott m2000rt, debido a la actividad de la transcriptasa inversa de la polimerasa rtth DNA termoestable. En primer lugar, los cebadores inversos del VIH-1 y del control interno hibridan (anneal) con sus dianas correspondientes y se elongan durante un periodo de incubación prolongado. Después del paso de desnaturalización, en el que la temperatura de reacción se eleva por encima de la temperatura de fusión del producto cdna:rna de cadena doble, un segundo cebador hibrida (anneal) con la cadena cdna y mediante la actividad de la DNA polimerasa de la enzima rtth se elonga hasta crear un producto de DNA de cadena doble. Durante cada serie de termociclado, los productos amplificados se disocian en cadenas sencillas a temperaturas elevadas permitiendo la hibridación (annealing) y la elongación de los cebadores a medida que desciende la temperatura. La amplificación exponencial del producto se consigue mediante la repetición de ciclos de ascenso y descenso de la temperatura, dando lugar a una amplificación de las secuencias diana de un mínimo de mil millones de veces. La amplificación de ambas dianas (VIH-1 y control interno) tiene lugar simultáneamente en una misma reacción. La secuencia diana del ensayo Abbott RealTime HIV-1 está en la región integrasa del gen pol del genoma del VIH-1. Esta región está altamente conservada. 27 La secuencia de control interno procede del gen de hidroxipiruvato reductasa de la planta de la calabaza, Cucurbita pepo, y se utiliza en una partícula Armored RNA que ha sido diluida en plasma humano negativo. Detección Durante los ciclos de lectura de amplificación en el sistema Abbott m2000rt, la temperatura se reduce para permitir la detección de la fluorescencia de los productos amplificados cuando las sondas del VIH-1 y del control interno hibridan (anneal) con las dianas respectivas (detección de la fluorescencia en tiempo real). La sonda de VIH-1 tiene un fluoróforo ligado covalentemente al extremo 5 de la sonda. Un oligonucleótido extintor de fluorescencia corto es complementario al extremo 5 de la sonda de VIH-1 y tiene un extintor de fluorescencia ligado covalentemente al extremo 3 de la sonda. En ausencia de la diana de VIH-1, la sonda fluorescente de VIH-1 se extingue, ya que el extintor de fluorescencia está próximo al fluoróforo por lo cual se impide la emisión de fluorescencia. En presencia de secuencias de diana de VIH-1, la sonda VIH-1 hibrida con la secuencia diana, separándose del oligonucleótido extintor de fluorescencia y permitiendo la detección de la fluorescencia. La sonda de control interno es un oligonucleótido de DNA de cadena sencilla con un fluoróforo en el extremo 5 y un extintor de fluorescencia en el extremo 3. En ausencia de secuencia diana de control interno, la sonda fluorescente es extinguida. En presencia de secuencias diana de control interno, la sonda hibrida con las secuencias complementarias separando el fluoróforo y el extintor de fluorescencia y permitiendo la emisión y detección de la fluorescencia. Las sondas específicas de VIH-1 y de control interno están marcadas cada una con un fluoróforo distinto, lo que permite la detección simultánea de los dos productos amplificados en cada ciclo. El ciclo de amplificación por el que el sistema Abbott m2000rt detecta una señal fluorescente es proporcional al log de la concentración de RNA del VIH-1 presente en la muestra original. Determinación cuantitativa Para la determinación cuantitativa de las concentraciones de RNA del VIH-1 de las muestras y de los controles se requiere una curva de calibración. Para generar una curva de calibración se procesan dos calibradores del ensayo en replicados de 3. La pendiente y la ordenada en el origen de la curva de calibración se calculan a partir de la concentración de RNA del VIH-1 asignada y la mediana del ciclo umbral observado para cada calibrador y se almacenan en el instrumento. La concentración de RNA del VIH-1 en muestras y controles se calcula a partir de la curva de calibración almacenada, y los resultados se comunican automáticamente a la estación de trabajo del m2000rt. En cada procesamiento deben incluirse un control negativo, un control positivo bajo y un control positivo alto Abbott RealTime HIV-1 para verificar la validez del procesamiento. El sistema m2000 verifica que los controles se sitúen dentro de los intervalos de valores asignados. PREVENCIÓN DE LA CONTAMINACIÓN POR ÁCIDO NUCLEICO Se ha minimizado la posibilidad de contaminación por ácido nucleico ya que: Los procesos de retrotranscripción, amplificación por PCR e hibridación de los oligonucleótidos se llevan a cabo en una placa de reacción óptica de 96 pocillos sellada. La detección se lleva a cabo automáticamente sin necesidad de abrir la placa de reacción óptica de 96 pocillos. En todas las dispensaciones se utilizan puntas de pipetas antiaerosoles. Las puntas de pipetas se desechan después del uso. Para el ensayo Abbott RealTime HIV 1 se utilizan áreas distintas y específicas. Consulte el apartado PRECAUCIONES ESPECIALES en estas instrucciones de uso. REACTIVOS Los reactivos Abbott RealTime son de un solo uso, por lo que los reactivos no utilizados se deben desechar. Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Kit (equipo de reactivos de amplificación VIH-1) (n de ref.: 6L18-90) 1. Abbott RealTime HIV-1 Internal Control (control interno) (nº de ref.: 2G31Y) (4 viales, 1,2 ml cada uno) Armored RNA no infeccioso con secuencias de control interno en plasma humano negativo. Plasma humano negativo analizado, no reactivo para el HBsAg, ni para el RNA del VIH, ni para el RNA del VHC, ni para el DNA del VHB, ni reactividad de anticuerpos anti- VIH-1/VIH-2, ni anti-vhc. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. 2. Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Pack (envase de reactivos de amplificación) (nº de ref.: 6L18) Cuatro envases de reactivos de un solo uso, 24 tests por envase. El reactivo sobrante que no se haya utilizado se debe desechar. Cada envase contiene: 1 frasco (0,141 ml) de la Thermostable rtth Polymerase Enzyme (enzima polimerasa termoestable rtth) (2,9 a 3,5 unidades/µl) en solución tamponada. 1 frasco (1,10 ml) de HIV-1 Oligonucleotide Reagent (reactivo de oligonucleótidos VIH-1). Oligonucleótidos sintéticos (4 cebadores, 2 sondas y 1 oligonucleótido extintor de fluorescencia) y dntps en una solución tamponada con colorante de referencia. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. 1 frasco (0,40 ml) de reactivo de activación. Solución de cloruro de manganeso 30 mm. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. 2

3 Abbott RealTime HIV-1 Control Kit (nº de ref.: 6L18-80) y Lot-specific Kit Card (tarjeta del equipo específica del lote) 1. Abbott RealTime HIV-1 Negative Control (control negativo) (nº de ref.: 2G31Z) (8 viales, 1,8 ml cada uno) Plasma humano negativo analizado, no reactivo para el HBsAg, ni para el RNA del VIH, ni para el RNA del VHC, ni para el DNA del VHB, ni reactividad de anticuerpos anti-vih-1/vih-2, ni anti-vhc. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. 2. Abbott RealTime HIV-1 Low Positive Control (control positivo bajo) (n de ref.: 2G31W) (8 viales, 1,8 ml cada uno) Armored RNA no infeccioso con secuencias de VIH-1 en plasma humano negativo. Plasma humano negativo analizado, no reactivo para el HBsAg, ni para el RNA del VIH, ni para el RNA del VHC, ni para el DNA del VHB, ni reactividad de anticuerpos anti-vih-1/vih-2, ni anti-vhc. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. 3. Abbott RealTime HIV-1 High Positive Control (control positivo alto) (nº de ref.: 2G31X) (8 viales, 1,8 ml cada uno). Armored RNA no infeccioso con secuencias de VIH-1 en plasma humano negativo. Plasma humano negativo analizado, no reactivo para el HBsAg, ni para el RNA del VIH, ni para el RNA del VHC, ni para el DNA del VHB, ni reactividad de anticuerpos anti-vih-1/vih-2, ni anti-vhc. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. Abbott RealTime HIV-1 Calibrator Kit (equipo de calibradores) (nº de ref.: 6L18-70) y Lot-specific Kit Card (tarjeta del equipo específica del lote) 1. Abbott RealTime HIV-1 Calibrator A (calibrador A) (nº de ref.: 2G31A) (12 viales, 1,8 ml cada uno) Armored RNA no infeccioso con secuencias de VIH-1 en plasma humano negativo. Plasma humano negativo analizado, no reactivo para el HBsAg, ni para el RNA del VIH, ni para el RNA del VHC, ni para el DNA del VHB, ni reactividad de anticuerpos anti-vih-1/vih-2, ni anti-vhc. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. 2. Abbott RealTime HIV-1 Calibrator B (calibrador B) (nº de ref.: 2G31B) (12 viales, 1,8 ml cada uno) Armored RNA no infeccioso con secuencias de VIH-1 en plasma humano negativo. Plasma humano negativo analizado, no reactivo para el HBsAg, ni para el RNA del VIH, ni para el RNA del VHC, ni para el DNA del VHB, ni reactividad de anticuerpos anti-vih-1/vih-2, ni anti-vhc. Conservantes: ProClin 300 al 0,1% y ProClin 950 al 0,15%. NOTA: los lotes del equipo de los controles, los lotes del equipo de los calibradores y los lotes del equipo de reactivos de amplificación se pueden utilizar indistintamente. El ensayo debe recalibrarse siempre que se use un equipo de reactivos de amplificación nuevo. No mezcle componentes de distintos lotes entre sí. Por ejemplo: no utilice el control negativo del equipo de controles nº de lote X con los controles positivos del equipo de controles nº de lote Y. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Producto sanitario para diagnóstico in vitro Para uso en diagnósticos in vitro Este ensayo no está diseñado para ser utilizado como análisis de cribado del VIH-1 ni como análisis de diagnóstico para confirmar la presencia de una infección por el VIH-1. Los reactivos Abbott RealTime HIV-1 están diseñados para ser usados únicamente con el sistema Abbott m2000, que está formado por el m2000sp dedicado al procesamiento de muestras y el m2000rt dedicado a la amplificación y la detección. No utilice reactivos caducados. El protocolo de adición de la mezcla del sistema Abbott m2000sp debe comenzar antes de que transcurra 1 hora de la preparación de la muestra. Si se suspende el protocolo de adición de la mezcla Abbott m2000sp, deseche la placa de reacción óptica de 96 pocillos en una bolsa de plástico sellable de acuerdo con las instrucciones del Manual de funcionamiento del sistema m2000sp capítulo Riesgos, junto con los guantes utilizados para manejar la placa. No importe la petición de ensayo en el sistema m2000rt. Se debe seleccionar la placa de PCR adecuada cuando se cargan las muestras en el instrumento m2000rt. El protocolo m2000rt debe iniciarse antes de que hayan transcurrido 50 minutos de la iniciación del protocolo de adición de mezcla. Si el procesamiento en el instrumento Abbott m2000rt no se inicia antes de que transcurran 50 minutos o si éste se interrumpe o se suspende, deseche la placa de reacción óptica de 96 pocillos en una bolsa de plástico sellable de acuerdo con el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt, junto con los guantes que haya utilizado para manejar la placa. Precauciones de seguridad Si desea obtener más información sobre las precauciones de seguridad, consulte el capítulo Riesgos de los manuales de funcionamiento de los sistemas Abbott m2000sp y Abbott m2000rt. ATENCIÓN: este producto contiene componentes de origen humano o potencialmente infecciosos. Para una enumeración más detallada, consulte el apartado REACTIVOS en estas instrucciones de uso. Se ha analizado el material de origen humano y no se ha encontrado reactividad para el HBsAg, ni para el RNA del VHC, ni para el RNA del VIH, ni para el DNA del VHB, ni reactividad de anticuerpos anti-vih-1/vih-2, ni anti-vhc. Al no existir métodos de análisis que garanticen la inocuidad de materiales de origen humano o de microorganismos inactivados, todos los materiales de origen humano se deben considerar potencialmente infecciosos. Se recomienda manejar estos reactivos y las muestras de origen humano de acuerdo con las instrucciones especificadas en la publicación "OSHA Standard on Bloodborne Pathogens". 28 En el caso de materiales que contengan o pudieran contener agentes infecciosos, se deben seguir las prácticas de seguridad biológica "Biosafety Level 2" 29 u otras normativas equivalentes 30,31. Estas precauciones incluyen, entre otras, las siguientes: Use guantes al manejar las muestras o los reactivos. No pipetee con la boca. No coma, beba, fume, aplique cosméticos ni manipule lentes de contacto en áreas donde se trabaja con estos materiales. Limpie y desinfecte las salpicaduras de las muestras con un desinfectante efectivo contra el bacilo causante de la tuberculosis como hipoclorito de sodio al 1,0% u otro desinfectante adecuado. 32,33 Descontamine y deseche todo el material potencialmente contaminado de acuerdo a la normativa vigente. 34,35 El equipo del calibrador, el control, el control interno, los reactivos oligonucleótidos VIH-1 y los reactivos de activación Abbott RealTime HIV-1 contienen una mezcla de 5-cloro-2-metil-4- isotiazolin-3-ona y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona que son componentes de ProClin. Los componentes han sido clasificados por las directivas de la Comunidad Europea (CE) como: irritantes (Xi). A continuación se indican las frases relativas a los riesgos derivados de los peligros de la sustancia (R) y consejos de prudencia (S). R43 Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. S24 Evítese el contacto con la piel. S35 Elimine los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S37 S46 Úsense guantes adecuados. En caso de ingestión, acúdase inmediatamente al médico y muéstrele la etiqueta o el envase. PRECAUCIONES ESPECIALES Precauciones de manejo El ensayo Abbott RealTime HIV-1 está diseñado exclusivamente para su uso con muestras de plasma que se hayan manejado y almacenado en tubos con tapón tal y como se describe en el apartado RECOGIDA, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA AL LABORATORIO DONDE SE REALIZARÁ EL ENSAYO. Durante la preparación de las muestras, es esencial el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio para minimizar el riesgo de contaminación cruzada entre las muestras y la introducción involuntaria de ribonucleasas (RNases) en las muestras durante y después del procedimiento de extracción. Cuando se trabaja con RNA se deben utilizar siempre técnicas asépticas adecuadas. 3

4 Las tecnologías de amplificación tales como la PCR son sensibles a la introducción accidental de productos de reacciones de amplificación previas. Se pueden obtener resultados incorrectos si se contaminan accidentalmente, aunque sólo sea con muy pocas moléculas de producto de amplificación, las muestras clínicas o los reactivos RealTime utilizados durante los pasos de amplificación. Las medidas para reducir el riesgo de contaminación en el laboratorio incluyen separar físicamente las actividades que conlleva una PCR de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Áreas de trabajo Se recomienda utilizar dos áreas específicas, el área de preparación de muestras y el área de amplificación. El área de preparación de muestras está destinada a procesar las muestras (muestras, controles y calibradores Abbott RealTime HIV 1) y a añadir las muestras, los calibradores y los controles procesados a la placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott. Todos los reactivos utilizados en el área de preparación de muestras deben permanecer en este área específica todo el tiempo. Las batas de laboratorio, las pipetas, las puntas de pipeta y el Vortex utilizados en el área de preparación de la muestra deben permanecer en este área y no se deben trasladar al área de amplificación. No traslade producto amplificado al área de preparación de muestras. El área de amplificación está dedicada a la amplificación y detección del producto amplificado. Las batas de laboratorio y el equipo utilizado en el área de amplificación deben permanecer en este área y no se deben trasladar al área de preparación de muestras. Los lotes del equipo de los controles, los lotes del equipo de los calibradores y los lotes de los reactivos de amplificación se pueden utilizar indistintamente. El ensayo debe recalibrarse siempre que se use un equipo de reactivos de amplificación nuevo. No mezcle componentes de distintos lotes entre sí. Por ejemplo: no utilice el control negativo del equipo de controles nº de lote X con los controles positivos del equipo de controles nº de lote Y. El equipo de reactivos de amplificación, el de controles y el de calibradores pueden congelarse hasta un máximo de 3 veces antes de su uso. Las áreas de trabajo y las plataformas de instrumentos se deben considerar fuentes potenciales de contaminación. Cámbiese los guantes después de entrar en contacto con productos posiblemente contaminantes (tales como muestras, eluidos y/o producto amplificado) antes de manejar los reactivos, el control negativo, los controles positivos, los calibradores o las muestras cerrados. Si desea obtener más información sobre los procedimientos de limpieza de los instrumentos, consulte los manuales de funcionamiento de los sistemas Abbott m2000sp y m2000rt. Si se suspende el procesamiento en el instrumento Abbott m2000sp, deseche todos los productos y reactivos según las indicaciones del Manual de funcionamiento del Abbott m2000sp. Si se suspende el protocolo de adición de la mezcla Abbott m2000sp, deseche la placa de reacción óptica de 96 pocillos en una bolsa de plástico sellable de acuerdo con las instrucciones del Manual de funcionamiento del sistema m2000sp, junto con los guantes que haya utilizado para manejar la placa. Si se interrumpe o suspende el procesamiento en el sistema Abbott m2000rt, deseche la placa de reacción óptica de 96 pocillos en una bolsa de plástico sellable de acuerdo con el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt, junto con los guantes que haya utilizado para manejar la placa. Descontamine y deseche todo el material potencialmente biopeligroso de acuerdo a la normativa vigente. 34,35 Todos los materiales se deben manejar de forma que se minimice la posibilidad de contaminación en el área de trabajo. NOTA: la esterilización en autoclave de la placa de reacción sellada no degrada el producto amplificado y puede contribuir a que el producto amplificado se derrame al abrirse la placa. El laboratorio se puede contaminar con producto amplificado si los materiales de desecho no se manejan y se almacenan con las debidas precauciones. Contención del aerosol Para reducir el riesgo de contaminación por ácido nucleico debido a los aerosoles formados durante el pipeteo manual, se deben utilizar para todos los pipeteos manuales puntas de pipetas con filtro antiaerosol. Las puntas de pipetas deben utilizarse sólo una vez. Limpie y desinfecte las salpicaduras de las muestras y los reactivos como se indica en los manuales de funcionamiento de los sistemas Abbott m2000sp y Abbott m2000rt. Contaminación e inhibición Se deben observar las precauciones siguientes para minimizar los riesgos de contaminación por RNase, contaminación cruzada entre muestras e inhibición: Use indumentaria protectora adecuada en todo momento. Use guantes sin talco. Cámbiese los guantes si ha entrado en contacto con posibles contaminantes (como muestras, eluidos y/o producto amplificado). Para reducir el riesgo de contaminación por ácido nucleico debido a aerosoles formados durante el pipeteo, se deben utilizar para todos los pipeteos puntas de pipetas con filtro antiaerosol. La punta debe ser lo suficientemente larga para evitar la contaminación de la pipeta. Al pipetear, deberá tener cuidado de no introducir la pipeta dentro del tubo o del recipiente de muestra. Se recomienda el uso de puntas de pipetas con filtro antiaerosoles. Utilice una punta de pipeta nueva con filtro antiaerosol para CADA dispensación manual de líquido. Los reactivos del sistema de preparación de muestras Abbott msample Preparation System (4 24 preparaciones) son de un solo uso. Utilice recipientes de reactivo y tubos de reacción nuevos, y reactivos recién abiertos para cada procesamiento del ensayo Abbott RealTime HIV 1. Al final de cada procesamiento, deseche el reactivo restante de la mesa de trabajo tal y como se describe en el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000sp y en las instrucciones de uso del sistema de preparación de muestras Abbott m Sample Preparation System (4 24 preparaciones). INSTRUCCIONES DE FUNCIONAMIENTO Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Kit (equipo de reactivos de amplificación VIH-1) (n de ref.: 6L18-90) Los envases de reactivos de amplificación Abbott RealTime HIV-1 y los viales de control interno deben almacenarse a una temperatura inferior o igual a 10 C cuando no se están utilizando. Se debe tener cuidado al separar el envase del reactivo de amplificación Abbott RealTime HIV-1 que se está utilizando para que no entre en contacto con muestras, calibradores y controles. Abbott RealTime HIV-1 Control Kit (equipo de controles) (nº de ref.: 6L18-80) Los controles negativo y positivo Abbott RealTime HIV-1 deben almacenarse a una temperatura inferior o igual 10 C. Abbott RealTime HIV-1 Calibrator Kit (equipo de calibradores) (nº de ref.: 6L18-70) Los calibradores A y B de Abbott RealTime HIV-1 deben almacenarse a una temperatura inferior o igual a 10 C. CONDICIONES PARA EL TRANSPORTE Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Kit: transportar con nieve carbónica. Abbott RealTime HIV-1 Control Kit: transportar con nieve carbónica. Abbott RealTime HIV-1 Calibrator Kit: transportar con nieve carbónica. INDICACIONES DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Si un control positivo o negativo está fuera del intervalo esperado, puede ser indicio de deterioro de los reactivos. Los resultados de los ensayos asociados no son válidos y las muestras se deben analizar de nuevo. Puede ser necesario volver a calibrar el ensayo. PROCEDIMIENTO DEL INSTRUMENTO Antes de realizar el ensayo, se deben instalar los ficheros de aplicaciones del ensayo Abbott RealTime HIV-1 en los sistemas Abbott m2000sp y Abbott m2000rt con el Abbott RealTime HIV-1 m2000 System Combined Application CD-ROM (CD-ROM de aplicaciones combinadas del sistema m2000). Para más información sobre la instalación de los ficheros de aplicación, consulte el capítulo Instrucciones de funcionamiento de los manuales de funcionamiento de los sistemas Abbott m2000sp y Abbott m2000rt. 4

5 RECOGIDA, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA AL LABORATORIO DONDE SE REALIZARÁ EL ENSAYO Recogida y almacenamiento de la muestra Las muestras de plasma humano (ACD-A y EDTA) pueden utilizarse con el ensayo Abbott RealTime HIV-1. Siga las instrucciones del fabricante para el procesamiento de los tubos de recogida de plasma. Las muestras recién extraídas (sangre) pueden conservarse entre 15 C y 30 C hasta 6 horas o entre 2 C y 8 C hasta 24 horas, antes de centrifugarlas. Después de la centrifugación, retire el plasma de las células. Las muestras de plasma se pueden almacenar hasta 24 horas entre 15 C y 30 C o hasta 5 días entre 2 C y 8 C. Las muestras de plasma se pueden almacenar a 20 C hasta un máximo de 60 días. Si fuera necesario almacenarlas por más tiempo, las muestras de plasma deben almacenarse a una temperatura igual o inferior a 70 C. 36,37 Se debe evitar someter las muestras a múltiples ciclos de congelación/descongelación y no se deben someter a más de 3 ciclos de congelación/descongelación. Descongele las muestras de plasma a una temperatura de entre 15 C y 30 C o entre 2 C y 8 C. Una vez descongeladas, si no va a procesar las muestras de plasma inmediatamente, se pueden almacenar a una temperatura de entre 2 C y 8 C hasta 6 horas. Transporte de las muestras Transporte las muestras congeladas con nieve carbónica. Para el transporte nacional, las muestras se deben empaquetar y etiquetar de acuerdo con la normativa vigente sobre el transporte de muestras clínicas, para diagnóstico o biológicas. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO ABBOTT REALTIME HIV-1 El ensayo Abbott RealTime HIV-1 presenta cuatro opciones de volumen de muestras (0,2 ml, 0,5 ml, 0,6 ml y 1,0 ml). Consulte el paso 9 del protocolo de ensayo y el apartado Interpretación de los resultados Materiales suministrados Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Kit (equipo de reactivos de amplificación) (nº de ref.: 6L18-90) Materiales necesarios pero vendidos por separado Abbott RealTime HIV-1 Calibrator Kit (equipo de calibradores) (nº de ref.: 6L18-70) Abbott RealTime HIV-1 Control Kit (equipo de controles) (nº de ref.: 6L18-80) Materiales necesarios pero no suministrados (Disponibles todos por separado) Área de preparación de muestras Instrumento Abbott m2000sp (nº de ref.: 9K14) con la versión de software 4.0 o superior Abbott msample Preparation System (sistema de preparación de muestras) (4 24 preparaciones) (nº de ref.: 04J70-24) Tubos de reacción de 5 ml (nº de ref.: 4J71-20) Tubos de muestras de 13 mm a 16 mm Recipientes de reactivos de 200 ml (nº de ref.: 4J71-60) Puntas desechables de 200 µl (nº de ref.: 4J71-15) Puntas desechables de 1000 µl (nº de ref.: 4J71-10) Abbott Optical Adhesive Covers (cubiertas adhesivas ópticas de Abbott) (nº de ref.: 4J71-75) Abbott Adhesive Cover Applicators (aplicadores para la cubierta adhesiva óptica de Abbott) (nº de ref.: 9K32-01) Abbott Splash-Free Support Base (base para el soporte de placas) (nº de ref.: 9K31-01) Abbott 96-Deep-Well Plate (placa de 96 pocillos profundos de Abbott) (nº de ref. 4J71-30) Abbott RealTime HIV 1 m2000 System Combined Application CD ROM (CD-ROM de aplicaciones combinadas del sistema) (nº de ref. 6L83) Abbott 96-Well Optical Reaction Plate (placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott) (nº de ref. 4J71-70) Puntas de pipeta con filtro antiaerosol para dispensar de 20 µl a 1000 µl Pipetas calibradas para dispensar de 20 µl a 1000 µl Centrífuga a 2000g Master Mix Tube (tubo de mezcla) (nº de ref.: 4J71-80) Mezclador Vortex Área de amplificación Instrumento Abbott m2000rt (nº de ref.: 9K15) con la versión de software 2.0 o superior Abbott RealTime HIV-1 m2000 System Combined Application CD ROM (CD-ROM de aplicaciones combinadas del sistema) (nº de ref.: 6L83) Abbott m2000rt Optical Calibration Kit (equipo de calibración óptica) (nº de ref.: 4J71-93) Otros Materiales Cabina de seguridad biológica aprobada para trabajar con material infeccioso. Bolsas de plástico sellables Agua sin RNasas (Eppendorf o equivalente) Tubos de microcentrífuga sin RNasas de 1,7 ml (Dot Scientific, Inc. o equivalente) Torunda con punta de algodón (Puritan o equivalente) Nota: estos 3 componentes se utilizan en el procedimiento del apartado Seguimiento del laboratorio para comprobar la presencia de contaminación. Consulte el apartado PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD en estas instrucciones de uso. Precauciones de procedimiento Lea con atención estas instrucciones de uso antes de procesar las muestras. Los viales de los calibradores, del control interno, del control negativo, de los controles positivo bajo y positivo alto Abbott RealTime HIV-1 son de un solo uso y se deben desechar después del uso. El protocolo de adición de la mezcla del sistema Abbott m2000sp debe comenzar antes de que transcurra 1 hora de la preparación de la muestra. Si el protocolo de adición de la mezcla Abbott m2000sp no se inicia, tape los viales de reactivo de amplificación y almacénelos de nuevo en el envase de reactivos de amplificación a una temperatura de 10 C. Una vez descongelado, el envase de reactivos de amplificación Abbott RealTime HIV-1 puede congelarse hasta un máximo de 3 veces. Si se suspende el protocolo de adición de la mezcla Abbott m2000sp, deseche los reactivos de amplificación. El protocolo m2000rt debe iniciarse antes de que hayan transcurrido 50 minutos de la iniciación del protocolo de adición de mezcla. Si el procesamiento en el instrumento Abbott m2000rt no se inicia antes de que transcurran 50 minutos o si éste se interrumpe o se suspende, deseche la placa de reacción óptica de 96 pocillos en una bolsa de plástico sellable de acuerdo con el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt, junto con los guantes que haya utilizado para manejar la placa. Utilice las puntas de pipetas con filtro antiaerosol o las pipetas desechables sólo 1 vez cuando pipetee muestras o control interno (IC). Para evitar la contaminación de la pipeta, al pipetear deberá tener cuidado de no introducir la pipeta dentro del tubo o del recipiente de muestra. Se recomienda el uso de puntas de pipetas con filtro antiaerosoles. Los procedimientos de monitorización para detectar la presencia del producto de amplificación se pueden encontrar en el apartado PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD de estas instrucciones de uso. Para reducir el riesgo de contaminación del ácido nucleico, limpie y desinfecte las salpicaduras de las muestras con un desinfectante tuberculicida como hipoclorito de sodio al 1,0% u otro desinfectante adecuado. Los calibradores y controles Abbott RealTime HIV-1 se deben preparar junto con las muestras que vaya a analizar. La utilización de los controles y calibradores Abbott RealTime HIV-1 es fundamental para el rendimiento del ensayo Abbott RealTime HIV-1. Si desea más información, consulte el apartado PROCEDIMIENTOS DEL CONTROL DE CALIDAD en estas instrucciones de uso. PROTOCOLO DEL ENSAYO Para una descripción más detallada sobre cómo manejar los instrumentos Abbott m2000sp o Abbott m2000rt, consulte los capítulos Instrucciones de funcionamiento en los manuales de funcionamiento de los sistemas Abbott m2000sp y m2000rt. Se debe entrenar al personal de laboratorio para que pueda manejar los instrumentos Abbott m2000sp y m2000rt. El usuario debe conocer a fondo cómo procesar las aplicaciones en los instrumentos y seguir las buenas prácticas de laboratorio. 5

6 1. Descongele los controles del ensayo y el control interno a una temperatura entre 15 C y 30 C o entre 2 C y 8 C. Descongele los calibradores a una temperatura entre 15 C y 30 C o entre 2 C y 8 C sólo cuando procese una calibración. Para más información sobre la calibración del ensayo, consulte el apartado PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD de estas instrucciones de uso. Una vez descongelados, los controles de ensayo, el control interno y los calibradores se pueden almacenar a una temperatura de entre 2 C y 8 C hasta 24 horas antes del uso. 2. Mezcle con un Vortex cada calibrador de ensayo y cada control 3 veces durante 2 a 3 segundos. Asegúrese de que el contenido se encuentre en el fondo después de mezclar con el Vortex dando unos golpecitos al vial sobre la mesa de trabajo para que el líquido se desplace al fondo. Asegúrese de que no se forman burbujas o espuma; si hubiera, retírelas con una punta de pipeta esterilizada. Se debe usar una punta nueva con cada vial. 3. Descongele los reactivos de amplificación a una temperatura entre 15 C y 30 C o entre 2 C y 8 C y almacénelos a una temperatura entre 2 C y 8 C hasta que los necesite para el procedimiento de amplificación de la mezcla. Una vez descongelados, los reactivos de amplificación se pueden almacenar a una temperatura entre 2 C y 8 C hasta 24 horas si no los va a utilizar de inmediato. NOTA: utilice 1 frasco de tampón mlysis, 1 vial de control interno y 1 envase de reactivos de amplificación RealTime HIV-1 para llevar a cabo hasta 24 reacciones. Utilice un segundo conjunto de reactivos para llevar a cabo de 25 a 48 reacciones, un tercer conjunto de reactivos para llevar a cabo de 49 a 72 reacciones, y un cuarto conjunto de reactivos para llevar a cabo de 73 a 96 reacciones EXCEPTO EN EL CASO DE LAS mmicroparticles. USE ÚNICAMENTE 2 FRASCOS DE mmicroparticles CUANDO PROCESE DE 25 A 96 MUESTRAS. 4. Invierta con suavidad los frascos del sistema de preparación de muestras Abbott msample Preparation para asegurar una solución homogénea exenta de burbujas. Si observa cristales en cualquiera de los frascos de reactivo al abrirlos, deje que el reactivo se equilibre a la temperatura ambiente hasta que los cristales desaparezcan. No utilice los reactivos hasta que los cristales se hayan disuelto. Asegúrese de que no se forman burbujas o espuma; si hubiera, retírelas con una punta de pipeta esterilizada. Se debe usar una punta nueva con cada frasco. 5. Antes del uso, mezcle con un Vortex cada vial de control interno 3 veces durante 2 a 3 segundos. Asegúrese de que no se forman burbujas o espuma; si hubiera, retírelas con una punta de pipeta esterilizada. Se debe usar una punta nueva con cada vial. 6. Utilice una PIPETA DE PRECISIÓN CALIBRADA PARA USO EXCLUSIVO CON EL CONTROL INTERNO para añadir 500 µl de control interno a cada frasco de tampón mlysis. Mezcle invirtiendo suavemente el recipiente de 5 a 10 veces para minimizar la formación de espuma. 7. Se puede realizar un máximo de 96 reacciones por procesamiento. En cada procesamiento se debe incluir un control negativo, un control positivo bajo y un control positivo alto, por lo que sólo se pueden analizar un máximo de 93 muestras de pacientes en cada procesamiento. 8. Descongele las muestras a una temperatura de entre 15 C y 30 C o entre 2 C y 8 C. Una vez descongeladas, si no va a procesar las muestras inmediatamente, se pueden almacenar a una temperatura entre 2 C y 8 C hasta 6 horas. 9. Compruebe el volumen de muestra. El volumen de muestra mínimo del ensayo Abbott RealTime HIV-1 y los requisitos de los portatubos asociados para el sistema Abbott m2000sp se describen a continuación. ATENCIÓN: no coloque tubos de 13 mm en portatubos de 16 mm. Volumen de muestra mínimo para la aplicación del ensayo Abbott RealTime HIV-1 Portatubos Diámetro del tubo a 0,2 ml 0,5 ml 0,6 ml 1,0 ml b 13 mm 11,6 mm - 14,0 mm 0,7 ml 1,0 ml 1,1 ml 1,5 ml 16 mm 15,0 mm - 16,0 mm 1,0 ml 1,3 ml 1,4 ml 1,8 ml a Se refiere al diámetro exterior del tubo de muestras. b La opción de volumen de muestra de 1,0 ml se encuentra disponible solo para un máximo de 48 muestras. NOTA: los tubos de muestras con un volumen de muestra insuficiente no se procesarán y se identificarán, a través de una alerta de error, como muestras con un volumen insuficiente en las pantallas de registro del procesamiento y de resultado de la placa. ATENCIÓN: los pasos 10 y 11 deben llevarse a cabo en el orden descrito. En primer lugar mezcle con un Vortex las muestras y continúe con la centrifugación. Si no se llevan a cabo estos dos pasos en este orden, los resultados pueden ser incorrectos. 10. Mezcle cada muestra con un Vortex 3 veces de 2 a 3 segundos. 11. Centrifugue las muestras a 2000g durante 5 minutos antes de cargarlas en la mesa de trabajo del Abbott m2000sp. NOTA: la g se refiere a la fuerza g, no a las revoluciones por minuto (rpm). 12. Dispense cada muestra en tubos o viales limpios, en caso necesario. Consulte los tamaños de los tubos en el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000sp. Evite tocar el interior de los tapones de los tubos al abrirlos. Procure no alterar el contenido del tubo cuando retire el tubo de la centrífuga y que la punta de la pipeta no toque el fondo del tubo. Asegúrese de que cada tubo de muestra contenga el volumen mínimo indicado en la tabla anterior. 13. Coloque los controles positivos alto y bajo, el control negativo, los calibradores, en caso necesario, y las muestras de paciente en un portatubos de muestras m2000sp. 14. Coloque los tubos de reacción de 5 ml en el subsistema de gradillas de 1 ml m2000sp. 15. Coloque los reactivos del sistema de preparación de muestras Abbott msample Preparation System y la placa de 96 pocillos de Abbott sobre la mesa de trabajo del Abbott m2000sp, tal y como se describe en la tabla a continuación y en el capítulo Instrucciones del funcionamiento del Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000sp. 16. Seleccione el fichero de la aplicación correspondiente desde la pantalla Run Sample Extraction (procedimiento de extracción de muestras) que se corresponde al volumen de muestra que se analiza. Inicie el protocolo de extracción de muestra siguiendo las instrucciones descritas en el capítulo Instrucciones de funcionamiento, en el Manual de funcionamiento del Abbott m2000sp. 17. Introduzca los valores específicos del lote del calibrador (necesario si no se ha almacenado una curva de calibración en el sistema m2000rt) y del control en la pantalla Sample Extraction: Worktable Setup, Calibrator and Control (Extracción de muestra: configuración de la mesa de trabajo, calibrador y control). Los valores específicos del lote se especifican en cada tarjeta de equipo de control y calibrador del ensayo Abbott RealTime HIV-1. NOTA: verifique que los valores introducidos coinciden con los valores proporcionados en las tarjetas específicas de los lotes de los equipos. NOTA: el protocolo de adición de la mezcla Abbott m2000sp (paso 21) se debe iniciar antes de que haya transcurrido 1 hora después de la preparación de la muestra. NOTA: cámbiese los guantes antes de manejar los reactivos de amplificación. NOTA: la configuración de la carga de la placa se activará automáticamente en las condiciones siguientes: Se procese un lote de 49 a 95 muestras y se detecte alguna muestra válida en la columna 7 a 12. Se procese un lote de 49 a 95 muestras y se detecte alguna muestra con la indicación Well Status de Error. Se procese un lote completo de 96 muestras y se detecte alguna muestra con la indicación Well Status de Error. En estas condiciones, el portagradillas de reactivos 2 debe permanecer en su sitio, conteniendo como mínimo el recipiente de reactivo para el tampón de elución (portagradillas de reactivo 2, posición 6). En caso de que este recipiente de reactivo haya sido colocado, coloque uno nuevo en su lugar con la etiqueta de tampón de elución en el portagradillas de reactivos 2, posición 6. Este recipiente de reactivo puede permanecer vacío y se añadirá líquido del sistema al recipiente de reactivo. 6

7 NOTA: las instrucciones de uso para la función de carga de placas automatizada aparecen en el Manual de funcionamiento del sistema m2000sp (nº de ref.: 9K20-04 o superiores), capítulo 5, Instrucciones del funcionamiento, Extracción de muestras: modo cerrado. 18. Una vez completada la preparación de la muestra, cargue los reactivos de amplificación y los viales de la mezcla en la mesa de trabajo del instrumento m2000sp. Con cada envase de reactivos de amplificación se pueden realizar hasta 24 reacciones. NOTA: se necesita un segundo envase de reactivos de amplificación para llevar a cabo de 25 a 48 reacciones. Se necesita un tercer envase de reactivos de amplificación para llevar a cabo de 49 a 72 reacciones. Se necesita un cuarto envase de reactivos de amplificación para llevar a cabo de 73 a 96 reacciones. 19. Antes de abrir los reactivos de amplificación, asegúrese de que el contenido se encuentre en el fondo del tubo dando unos golpecitos al tubo en posición vertical sobre la mesa de trabajo. 20. Retire y deseche los tapones de los viales de amplificación. 21. Desde la pantalla Run Master Mix Addition (procesamiento de la adición de la mezcla) seleccione la placa de pocillos que corresponda al protocolo de extracción de muestras. Inicie el protocolo de adición de la mezcla del sistema Abbott m2000sp. Siga las instrucciones descritas en el capítulo Instrucciones de funcionamiento del Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000sp. El protocolo m2000rt debe iniciarse antes de que hayan transcurrido 50 minutos de la iniciación del protocolo de adición de mezcla. NOTA: si por cualquier motivo se suspende el procesamiento después del paso 21, debe usarse una nueva placa de PCR de 96 pocillos y el protocolo de adición de mezcla Abbott m2000sp (paso 21) se repetirá. 22. Encienda e inicie el instrumento Abbott m2000rt en la zona de amplificación. NOTA: el sistema Abbott m2000rt tarda 15 minutos en calentar. NOTA: quítese los guantes antes de volver al área de preparación de la muestra. 23. Selle la placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott una vez completada la adición de las muestras y de la mezcla en el instrumento Abbott m2000sp de acuerdo con lo descrito en el capítulo Instrucciones de funcionamiento del Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000sp. Exporte los resultados de la placa de PCR completos a un CD. 24. Coloque la placa de reacción óptica sellada en la base soporte para placas para transferirla al instrumento Abbott m2000rt. 25. Coloque la placa de reacción óptica de 96 pocillos en el instrumento Abbott m2000rt. Importe la petición de ensayos del m2000sp a través del CD según las instrucciones para la importación incluidas en el capítulo Instrucciones de funcionamiento del Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt. NOTA: en caso de que no pueda trasladar la petición de ensayos m2000sp, introduzca manualmente las ID de las muestras en el sistema m2000rt en las posiciones de la bandeja PCR correctas de acuerdo a la tabla Wells for Selected Plate, que se muestra en detalle en la pantalla PCR Plate Results del sistema m2000sp. Para más información, consulte el capítulo Instrucciones de funcionamiento del Manual de funcionamiento del sistema m2000sp. PROCEDIMIENTO DESPUÉS DEL PROCESAMIENTO 1. Retire la placa de 96 pocillos de Abbott de la mesa de trabajo y deséchela siguiendo las instrucciones del Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000sp. 2. Coloque la placa de reacción óptica de 96 pocillos en una bolsa de plástico sellable y deséchela según lo descrito en el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt, junto con los guantes que haya utilizado para manejar la placa. 3. Limpie la base soporte para placas antes de volver a utilizarla, tal y como se describe en el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt. PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD Calibración óptica del sistema Abbott m2000rt Si desea más información sobre cómo realizar una calibración óptica en el sistema Abbott m2000rt, consulte el capítulo Procedimientos de calibración del Manual de funcionamiento del Abbott m2000rt. Se requiere una calibración óptica del instrumento Abbott m2000rt para la medición precisa y la diferenciación entre los fluoróforos durante el procesamiento del ensayo Abbott RealTime HIV-1. Las siguientes placas de calibración óptica de Abbott m2000rt se utilizan para calibrar el instrumento Abbott m2000rt para procesar el ensayo Abbott RealTime HIV 1: Placa FAM (carboxifluoresceína) Placa ROX (carboxi-x-rodamina) Placa VIC (fluoróforo patentado) Calibración del ensayo Si desea más información sobre cómo realizar una calibración del ensayo, consulte los capítulos Instrucciones de funcionamiento en los manuales de funcionamiento de los sistemas Abbott m2000sp y m2000rt. Se requiere una curva de calibración para la determinación cuantitativa de las concentraciones del RNA del VIH-1 de las muestras y de los controles. Para generar una curva de calibración se procesan dos calibradores del ensayo en replicados de 3 (concentración VIH-1 frente al ciclo del valor umbral [C T ] en el que se detecta la señal de fluorescencia de una concentración de reactivo). La pendiente y la ordenada en el origen de la curva de calibración se calculan y se almacenan en el instrumento. La concentración del RNA del VIH-1 en una muestra se calcula a partir de la curva de calibración almacenada. Los resultados se comunican automáticamente a la estación de trabajo del sistema m2000rt. Siga el procedimiento de extracción de muestra, adición de la mezcla, amplificación y protocolos de detección, tal y como se describe en los manuales de funcionamiento de los sistemas Abbott m2000sp y Abbott m2000rt. Una vez aceptada y almacenada la calibración del ensayo Abbott RealTime HIV-1, puede usarse durante 6 meses. Durante este tiempo, se pueden analizar todas las muestras subsiguientes sin que sea necesario calibrar de nuevo a menos que: Se utilice un equipo de reactivos de amplificación del ensayo Abbott RealTime HIV-1 con un nuevo número de lote. Se utilice un sistema de preparación de muestras Abbott msample Preparation System (4 24 preparaciones) con un nuevo número de lote. Se utilice un fichero de especificación de la aplicación Abbott RealTime HIV-1 para un volumen de muestra diferente. Se instale un nuevo fichero de especificación de la aplicación Abbott RealTime HIV-1. La recalibración óptica del colorante puro (Pure Dye) de los colorantes específicos del ensayo Abbott RealTime HIV-1 (FAM, VIC o ROX) se realiza según se indica en el capítulo Procedimientos de calibración del Manual de funcionamiento del sistema m2000rt. Detección de la inhibición Se ha establecido un parámetro de validez de ensayo del ciclo de valor umbral [C T ] del control interno durante el procedimiento de calibración. Se introduce una cantidad constante y definida de control interno en cada muestra, calibrador y control al comienzo de la preparación de las muestras y se detecta con el instrumento Abbott m2000rt para demostrar el procesamiento correcto de la muestra y la validez del ensayo. El control interno consiste en una secuencia de RNA no relacionada con la secuencia diana del VIH-1. El ciclo de amplificación media en el que se detecta la señal fluorescente de la secuencia diana del control interno en las muestras de calibración establece un intervalo de validez C T del control interno dentro del cual deben estar todas las muestras y los controles procesados posteriormente. Si una muestra o control no cumple estas especificaciones, se visualiza una alarma de error. Si desea más información sobre las medidas correctivas de una alerta de error, consulte el Manual de funcionamiento del sistema m2000rt. Se deben volver a analizar las muestras cuyo valor C T de control interno sea superior al intervalo establecido desde el paso de preparación de la muestra. 7

8 Controles positivo y negativo Se debe incluir en cada petición de ensayo un control negativo, un control positivo bajo y un control positivo alto para evaluar la validez del procesamiento. Los valores específicos del lote para los controles positivo bajo y positivo alto aparecen especificados en las tarjetas del equipo de controles del ensayo Abbott RealTime HIV-1 y deben introducirse en la petición de ensayo cuando se realiza un procesamiento. Si un resultado de control se encuentra fuera del intervalo establecido, se visualiza un error. Si desea más información sobre las medidas correctivas de una alerta de error, consulte el Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt. Si los controles positivo o negativo están fuera del intervalo, se deben volver a procesar todas las muestras y los controles de ese procesamiento desde el paso de la preparación de la muestra. No se debe detectar presencia de VIH-1 en el control negativo. La presencia de VIH-1 en el control negativo es indicio de contaminación por otras muestras o por producto amplificado durante la preparación de la muestra o durante la preparación de la placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott. Para evitar la contaminación, limpie los instrumentos Abbott m2000sp y Abbott m2000rt y repita el procesamiento de los controles y las muestras siguiendo las Precauciones del procedimiento. Si los controles negativos son persistentemente reactivos, póngase en contacto con el Centro de Asistencia Técnica de Abbott Molecular. Seguimiento del laboratorio para comprobar la presencia de contaminación Se recomienda realizar este análisis al menos una vez al mes para comprobar si se ha producido contaminación por producto amplificado en las superficies y el equipo del laboratorio. Es muy importante analizar todas las zonas de trabajo que puedan haber estado expuestas a muestras, controles y calibradores procesados, y/o a producto amplificado. Esto incluye los objetos que se manejan habitualmente, como las pipetas, las teclas de función de los sistemas Abbott m2000sp and Abbott m2000rt, las superficies de trabajo del laboratorio, las microcentrífugas y los adaptadores de las centrífugas. 1. Añada 0,8 ml de agua sin RNasas en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml sin RNasas. 2. Empape la punta de una torunda de algodón (Puritan o equivalente) en el agua sin RNasas del tubo de microcentrífuga. 3. Con esta torunda de algodón empapada limpie con un movimiento de barrido el área que desea monitorizar. Coloque la torunda en el tubo de microcentrífuga. 4. Agite la punta en el agua sin RNasas unas 10 veces y presione el aplicador en la pared del tubo de forma que el líquido se desprenda y caiga dentro de la solución en el fondo del tubo de microcentrífuga. Deseche la torunda. 5. Pipetee 0,5 ml de tampón de solución de lavado mwash 1 en un tubo limpio utilizando la pipeta de uso exclusivo para el control interno. 6. Añada 20 µl de tampón de solución de lavado mwash 1 en cada tubo de microcentrífuga. 7. Cierre el tubo de microcentrífuga con la tapa. 8. Analice las muestras según lo descrito en el apartado Procedimiento del ensayo en estas instrucciones de uso. Transfiera el líquido del tubo de microcentrífuga a un tubo de reacción de 5 ml. Añada agua sin RNasas hasta alcanzar un volumen mínimo de 1,5 ml. 9. Si se detecta ácido nucleico del VIH-1 en la torunda de muestra, hay presencia de contaminación. 10. Si se detecta ácido nucleico del VIH-1 en el equipo, siga las directrices de descontaminación y limpieza indicadas en el manual de funcionamiento del equipo. Si se detecta ácido nucleico del VIH-1 en las superficies de trabajo, limpie las zonas contaminadas con solución de hipoclorito de sodio al 1,0% (v/v), seguido de etanol al 70% o agua. NOTA: las soluciones de cloro pueden dejar marcas en el equipo y en el metal. Utilice cantidades suficientes o repita las aplicaciones de etanol al 70% o agua hasta que ya no sean visibles los residuos de cloro. 11. Repita el análisis de la zona contaminada siguiendo los pasos 1 a 10. RESULTADOS Cálculo La concentración de RNA vírico de VIH-1 en una muestra o control se calcula a partir de la curva de calibración almacenada. El instrumento Abbott m2000rt comunica automáticamente los resultados a la estación de datos del sistema Abbott m2000rt. Los resultados del ensayo se pueden comunicar en copias/ml, log [copias/ml], Unidades internacionales (UI)/ml, o log [UI/ml]; (1 UI = 0,58 copias, 1 copia = 1,74 UI), con el primer patrón internacional para RNA del VIH-1 (97/656) de la OMS. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Volumen de Resultado Interpretación muestra 1,0 ml No detectado No se ha detectado la diana < 1,60 log [copias/ml] a Detectado 1,60 a 7,00 log [copias/ml] > 7,00 log [copias/ml] > UL d Q 0,6 ml No detectado No se ha detectado la diana < 1,60 log [copias/ml] a Detectado 1,60 a 7,00 log [copias/ml] > 7,00 log [copias/ml] > UL Q 0,5 ml No detectado No se ha detectado la diana < 1,88 log [copias/ml] b Detectado 1,88 a 7,00 log [copias/ml] > 7,00 log [copias/ml] > UL Q 0,2 ml No detectado No se ha detectado la diana < 2,18 log [copias/ml] c Detectado 2,18 a 7,00 log [copias/ml] > 7,00 log [copias/ml] > UL Q a 40 copias/ml b 75 copias/ml c 150 copias/ml d UL Q = upper limit of quantitation (límite superior de la cuantificación) El resultado No detectado significa que no se detectó ninguna diana. El resultado de < 1,60; < 1,60; < 1,88; < 2,18 log [copias/ml] indica que se detectó la diana pero que es inferior al límite inferior de cuantificación (LL Q ) para los respectivos volúmenes mínimos de muestra de 1,0 ml; 0,6 ml; 0,5 ml y 0,2 ml. Para volúmenes mínimos de 1,0 ml y 0,6 ml, el resultado de 1,60 a 7,00 log [copias/ml] indica que se ha detectado la diana y la concentración se sitúa entre 1,6 log copias por ml (LL Q ) y 7,0 log copias por ml (UL Q ). Para volúmenes mínimos de 0,5 ml, el resultado de 1,88 a 7,00 log [copias/ml] indica que se detectó la diana y la concentración se sitúa entre 1,88 log copias por ml (LL Q ) y 7,0 log copias por ml (UL Q ). Para volúmenes mínimos de 0,2 ml, el resultado de 2,18 a 7,00 log [copias/ml] indica que se detectó la diana y la concentración se sitúa entre 2,18 log copias por ml (LL Q ) y 7,0 log copias por ml (UL Q ). Adviértase que no se producen interpretaciones en el sistema m2000rt cuando los resultados se sitúan entre el LL Q y el UL Q. Un resultado de > 7,00 log [copias/ml] indica que se detectó la diana y que es superior al UL Q. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO PARA USO EN DIAGNOÓSTICO IN VITRO El rendimiento óptimo de este ensayo requiere la recogida, el manejo, la preparación y el almacenamiento adecuados de las muestras (consulte el apartado RECOGIDA, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA AL LABORATORIO DONDE SE REALIZARÁ EL ENSAYO en estas instrucciones de uso). Las muestras de plasma humano (recogidas en tubos con ACD-A o EDTA) pueden utilizarse con el ensayo Abbott RealTime HIV-1. El uso del ensayo Abbott RealTime HIV-1 debe limitarse al personal entrenado en los procedimientos de ensayo de diagnóstico molecular y en los instrumentos Abbott m2000sp y Abbott m2000rt. 8

9 Los instrumentos y los procedimientos del ensayo reducen el riesgo de contaminación por producto amplificado. Sin embargo, la contaminación por ácido nucleico de los calibradores, los controles positivos o las muestras se debe controlar mediante las buenas prácticas de laboratorio y siguiendo adecuadamente los procedimientos especificados en estas instrucciones de uso. No se puede suponer que una muestra con un resultado de "No se ha detectado la diana" sea negativa para el RNA del VIH-1. Como ocurre con cualquier otro ensayo de diagnóstico, los resultados del ensayo Abbott RealTime HIV-1 se deben interpretar junto con otros análisis clínicos y de laboratorio. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL FUNCIONAMIENTO Las características de funcionamiento se determinaron usando el ensayo RealTime HIV-1 con el sistema de preparación de muestras Abbott m2000 y el volumen de muestra de 1,0 ml, siempre y cuando no se especifique otra cosa. Límite de detección El límite de detección se define como la concentración de RNA del VIH-1 detectada con una probabilidad del 95% o superior. Límite de detección, volumen de muestra de 1,0 ml El límite de detección del ensayo Abbott RealTime HIV-1 es de 40 copias/ml para el volumen de muestra de 1,0 ml. El límite de detección del ensayo se determinó analizando diluciones de un patrón vírico del Virology Quality Assurance (VQA) Laboratory (Laboratorio de aseguramiento de la calidad de virología) del AIDS Clinical Trial Group (Grupo de ensayo clínico del SIDA). Las diluciones se hicieron con plasma humano negativo para el VIH-1. El análisis se realizó con 3 lotes de reactivos de amplificación en 3 sistemas m2000. Los resultados representativos del funcionamiento de la sensibilidad analítica del ensayo RealTime HIV-1 se resumen en la Tabla 1. Tabla 1 Conc. (copias/ml) análisis detecciones Porcentaje detectado a a Un replicado generó un mensaje de error de replicado no válido y se eliminó del análisis de datos. El análisis con el método Probit de los datos permitió precisar que la concentración de RNA del VIH-1 detectada con una probabilidad del 95% fue de 25 copias/ml (IC del 95% 20-33). Límite de detección, volumen de muestra de 0,6 ml El límite de detección del ensayo Abbott RealTime HIV-1 es de 40 copias/ml para el volumen de muestra de 0,6 ml. El límite de detección para el procedimiento de volumen de muestra de 0,6 ml se determinó según lo descrito para el procedimiento de volumen de muestra de 1,0 ml. Los resultados representativos del funcionamiento de la sensibilidad analítica del ensayo RealTime HIV-1 se resumen en la Tabla 2. Tabla 2 Conc. (copias/ml) análisis detecciones Porcentaje detectado Límite de detección, volumen de muestra de 0,5 ml El límite de detección del ensayo Abbott RealTime HIV-1 es de 75 copias/ml para el volumen de muestra de 0,5 ml. El límite de detección para el procedimiento de volumen de muestra de 0,5 ml se determinó según lo descrito para el procedimiento de volumen de muestra de 1,0 ml. Los resultados representativos del rendimiento de la sensibilidad analítica del ensayo RealTime HIV-1 se resumen en la Tabla 3. Tabla 3 Conc. (copias/ml) análisis detecciones Porcentaje detectado a a Un replicado generó un mensaje de error de replicado no válido y se eliminó del análisis de datos. El análisis con el método Probit de los datos permitió precisar que la concentración de RNA del VIH-1 detectada con una probabilidad del 95% fue de 65 copias/ml (IC del 95% 51-88). Límite de detección, volumen de muestra de 0,2 ml El límite de detección del ensayo Abbott RealTime HIV-1 es de 150 copias/ml para el volumen de muestra de 0,2 ml. El límite de detección para el procedimiento de volumen de muestra de 0,2 ml se determinó según lo descrito para el procedimiento de volumen de muestra de 1,0 ml. Los resultados representativos del funcionamiento de la sensibilidad analítica del ensayo RealTime HIV-1 se resumen en la Tabla 4. Tabla 4 Conc. (copias/ml) análisis detecciones Porcentaje detectado a a a Ocho replicados fueron no válidos debido a un error del instrumento y se borraron del análisis de datos. El análisis con el método Probit de los datos permitió precisar que la concentración de RNA del VIH-1 detectada con una probabilidad del 95% fue de 119 copias/ml (IC del 95% ). Intervalo lineal El límite superior de determinación cuantitativa (UL Q ) para el ensayo Abbott RealTime HIV 1 es 10 millones de copias/ml y el límite inferior es equivalente al límite de detección (L D ) (40 copias/ml para el procedimiento de preparación de muestra con un volumen de 1,0 ml y 0,6 ml, 75 copias/ml para el procedimiento de preparación de muestra con un volumen de 0,5 ml y 150 copias/ml para el procedimiento de preparación de muestra con un volumen de 0,2 ml). Se analizó un panel de 9 muestras preparado mediante dilución de armored RNA del VIH-1 de 7,44 log copias/ml a 1,16 log copias/ml en plasma humano negativo para el VIH-1. El análisis de linealidad se realizó de acuerdo a las pautas descritas en la guía EP6-A del NCCLS 38. Los resultados representativos de la linealidad del ensayo RealTime HIV-1, aparecen en la figura 1. El análisis con el método Probit de los datos permitió precisar que la concentración de RNA del VIH-1 detectada con una probabilidad del 95% fue de 39 copias/ml (IC del 95% 33 49). 9

10 Abbott RealTime HIV-1 log copias/ml Figura 1 Conc. esperada log copias/ml El ensayo RealTime HIV-1 demostró ser lineal en el intervalo analizado (n=99, r=0,999, pendiente=0,93 y ordenada en el origen=0,26). Precisión El ensayo RealTime HIV-1 se diseñó para conseguir una desviación estándar inter-ensayos (D.E.) inferior o igual a 0,25 log copias/ml en muestras que contengan concentraciones de RNA del VIH-1 entre copias/ml y 500 copias/ml. La precisión del ensayo se demostró analizando en 45 paneles de precisión realizando 9 paneles distintos repetidos hasta 5 veces. El panel se preparó diluyendo virus del VIH-1 en plasma humano negativo para el VIH-1. Las concentraciones medias de RNA de las muestras del panel se situaron entre 6,51 log copias/ml y 1,46 log copias/ml. El análisis se realizó de acuerdo a las pautas descritas en la guía EP10-A2 del CLSI. 39 En total se usaron 3 lotes de reactivos. Cada uno de los 3 laboratorios externos analizó 2 de los lotes durante 3 días para un total de 18 procesamientos. En total se analizaron 90 replicados para cada muestra del panel. En la tabla 5 se muestran los resultados del análisis de componentes de la variancia. Tabla 5 Análisis de precisión total n c Conc. media (log copias/ ml) Componente D.E. Intraserial Componente D.E. Interserial D.E. Interensayos a Componente D.E. Interlotes Componente D.E. Interlaboratorios D.E. total b Panel ,51 0,06 0,05 0,08 0,00 0,14 0, ,83 0,06 0,03 0,06 0,02 0,11 0, ,21 0,05 0,03 0,06 0,04 0,11 0, ,58 0,06 0,03 0,06 0,06 0,07 0, ,96 0,06 0,00 0,06 0,07 0,03 0, ,38 0,06 0,01 0,06 0,04 0,05 0, ,77 0,07 0,02 0,08 0,06 0,06 0, ,13 0,13 0,04 0,13 0,10 0,07 0, d 1,46 0,24 0,00 0,24 0,18 0,00 0,30 a Incluye componentes intraseriales e interseriales b Incluye componentes intraseriales, interseriales, interlotes e interlaboratorios c Resultados de análisis válidos d Para un replicado se comunica un resultado de No se ha detectado la diana Sustancias con capacidad de interferir Se evaluó la posibilidad de que haya interferencias en el ensayo Abbott RealTime HIV-1 por concentraciones elevadas de sustancias endógenas y fármacos comúnmente prescritos a pacientes infectados por el VIH-1. Se analizaron muestras negativas para VIH-1 y muestras que contenían copias/ml de RNA del VIH-1. No se observó interferencia en el rendimiento del ensayo Abbott RealTime HIV-1 en presencia de las sustancias siguientes para todas las muestras positivas y negativas analizadas: Hemoglobina Triglicéridos Bilirrubina Proteínas 500 mg/dl 3000 mg/dl 20 mg/dl 9 g/dl Se analizaron fármacos en concentraciones que superaban los picos de las concentraciones máximas de suero o plasma en 5 mezclas de muestras. No se observó interferencia en el funcionamiento del ensayo Abbott RealTime HIV-1 en presencia de las siguientes mezclas de fármacos para todas las muestras positivas y negativas analizadas: Mezcla de Fármaco analizado fármaco 1 Zidovudina, Saquinavir, Ritonavir, Claritromicina, Interferon 2a, Interferon 2b 2 Sulfato de abacavir, amprenavir, Peginterferon 2a, Peginterferon 2b, Ribavirina 3 Tenofovir disoproxil fumarato, lamivudina, sulfato de indinavir, ganciclovir, clorhidrato de valganciclovir, aciclovir 4 Stavudina, efavirenz, lopinavir, enfuvirtida, ciprofloxacina 5 Zalcitabina, Nevirapina, Nelfinavir, Azitromicina, Valaciclovir Especificidad La especificidad del ensayo RealTime HIV-1 se evaluó en 3 laboratorios externos donde se analizaron 514 muestras de VIH 1 en plasma seronegativas procedentes de donantes de sangre voluntarios. Las muestras se analizaron en 3 instrumentos m2000 con 4 lotes de reactivos de amplificación. En este estudio representativo el RNA del VIH-1 no se detectó para ninguna de las 514 muestras y la especificidad del ensayo RealTime HIV 1 se estimó que es del 100% (514/514), (IC del 95% 99,28 100%). La especificidad del ensayo se evaluó posteriormente analizando 70 muestras que habían sido obtenidas de pacientes diagnosticados o cribados para una enfermedad autoinmune o clasificados serológicamente como positivos para los siguientes marcadores: Lupus Eritematoso Sistémico (SLE), anticuerpos anti-nucleares (ANA), factor reumatoide (RF), HBsAg, anti-htlv-i/ii, anti-vhc y anti VIH 2. No se detectó RNA del VIH-1 en ninguna muestra analizada. Los resultados demostraron que la presencia de una enfermedad autoinmune o marcadores serológicos para la enfermedad autoinmune o de patógenos víricos distintos al VIH-1 no afectan al ensayo Abbott RealTime HIV-1. Reactividad cruzada Los siguientes virus y microorganismos que, potencialmente podrían presentar alguna reacción cruzada, se evaluaron con el ensayo RealTime HIV-1. El ácido nucleico purificado o lisado vírico de cada organismo se añadió a una concentración esperada de 5,0 log copias/ml a muestras negativas de RNA del VIH 1 y muestras que contenían copias/ml de RNA del VIH-1. Virus de la immunodeficiencia Virus vaccinia humana 2 Virus T-linfotrópico humano 1 Poliomavirus BK humano Virus de la hepatitis C Virus de papiloma humano 16 Virus de la hepatitis B Virus de papiloma humano 18 Virus de Epstein-Barr Neisseria gonorrhoeae Virus herpes simple 1 Chlamydia trachomatis Virus herpes simple 2 Candida albicans Citomegalovirus Staphylococcus aureus Herpesvirus humano 6B Staphylococcus epidermidis Herpesvirus humano 8 Mycobacterium gordonae Virus de la varicela zoster Mycobacterium smegmatis No se observó interferencia en el funcionamiento del ensayo Abbott RealTime HIV-1 en presencia de los organismos que podrían presentar alguna reacción cruzada en las muestras positivas y negativas analizadas. Detección de los grupos y subtipos del VIH-1 Para evaluar el rendimiento del ensayo RealTime HIV-1 con los subtipos/ grupos del VIH-1 se analizaron transcripciones de RNA purificado del grupo M (subtipos A, B, C, D, CRF01-AE, F, CRF02-AG, G y H), grupo O y grupo N, y se analizaron 10 muestras clínicas de cada subtipo del grupo M (A, B, C, D, CRF01-AE, F, CRF02-AG, G) y 10 muestras del grupo O. 10

11 Se analizaron transcripciones del RNA de grupo M (subtipos A, B, C, D, CRF01-AE, F, CRF02-AG, G y H), grupo O y grupo N con concentraciones esperadas de aproximadamente 6,0 log copias/ml, 4,7 log copias/ml, 3,0 log copias/ml y 1,7 log copias/ml. Se analizaron tres replicados en cada concentración para cada transcripción. Los resultados, representativos de la linealidad de la dilución para los 11 grupos y subtipos analizados, aparecen en la figura 2. Figura 2 Abbott RealTime HIV-1 log copias/ml Conc. esperada log copias/ml Los resultados muestran que se detectaron todos los subtipos y grupos analizados y se demostró la linealidad de la dilución para todos los grupos y subtipos analizados (intervalos de coeficiente de correlación de 0,997 a 1,000). Se analizaron un total de 90 muestras clínicas, 10 de cada subtipo del grupo M (A, B, C, D, CRF01-AE, F, CRF02 AG, G) y del grupo O con el ensayo RealTime HIV-1 y con otros 2 ensayos aprobados del VIH-1 cuantitativo a los que nos referimos como Ensayo comparativo 1 (se usó la versión aprobada por la FDA) y Ensayo comparativo 2 (se usó la versión con distintivo CE). Los resultados se resumen en la Tabla 6. Tabla 6 Grupos/ Subtipos n Detectados con el ensayo RealTime Detectados con el Ensayo comparativo 1 a Detectados con el Ensayo comparativo 2 a M/Subtipo A (1) 10 (1) M/Subtipo B (0) 10 (0) M/Subtipo C (0) 10 (0) M/Subtipo D (0) 10 (0) M/Subtipo (0) 10 (0) AE M/Subtipo F (0) 10 (0) M/Subtipo (3) 10 (1) AG M/Subtipo G (2) 10 (1) Grupo O (NA) 7 (7) a Los números entre paréntesis representan la cantidad de muestras cuyos valores de determinación cuantitativa fueron inferiores en más de 1,00 log copias/ml en comparación con el ensayo RealTime HIV-1. El ensayo RealTime HIV-1 detectó todos los subtipos y grupos analizados (el intervalo de valores de determinación cuantitativa fue de 2,56 log copias/ml a 6,14 log copias/ml). El ensayo comparativo 1 detectó todos los subtipos analizados del grupo M y no detectó el grupo O en ninguna de las 10 muestras (el intervalo de valores de determinación cuantitativa de las muestras detectadas fue de 2,01 log copias/ml a 5,54 log copias/ml, y 3 muestras se situaron por encima del límite superior de cuantificación [UL Q ]). El ensayo comparativo 2 detectó todos los subtipos del grupo M analizados y en 7 de las 10 muestras se detectó el grupo O (el intervalo de valores de determinación cuantitativa de las muestras detectadas fue de 1,75 log copias/ml a 5,41 log copias/ml). Ninguna muestra tuvo valores cuantitativos con el ensayo RealTime inferiores a más de 1,00 log copias/ml comparados en el Ensayo comparativo 1 y en el Ensayo comparativo 2. 6 muestras del grupo M tuvieron valores cuantitativos con el Ensayo comparativo 1 inferiores en más de 1,00 log/copias/ml en comparación con el ensayo RealTime HIV-1. 3 muestras del grupo M y 7 del grupo O tuvieron valores cuantitativos con el Ensayo comparativo 2 inferiores en más de 1,00 log copias/ml en comparación con el ensayo RealTime HIV-1. Correlación La determinación cuantitativa del RNA del VIH-1 se comparó entre el ensayo Abbott RealTime HIV-1 y un ensayo de RNA del VIH-1 de comparación aprobado por la FDA. Se analizaron un total de 301 muestras recogidas de pacientes infectados por el virus del VIH-1 con el ensayo RealTime HIV-1 en 3 laboratorios externos y con el método de comparación en un laboratorio central. Los resultados de un total de 259 muestras que se situaron dentro del intervalo analítico común se analizaron con el método de regresión lineal de Passing- Bablok (Figura 3). 40 El coeficiente de correlación fue de 0,936, la pendiente de 0,97 (IC del 95% 0,92 1,01), y la ordenada en el origen fue de 0,05 log copias/ml (IC del 95% -0,22 0,14). Figura 3 Abbott RealTime HIV-1 log copias/ml Ensayo VIH-1 de comparación log copias/ml Bibliografía 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983;220: Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, et al. Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and pre-aids. Science 1984;224: Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and at risk for AIDS. 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Armored RNA es una tecnología patentada desarrollada en conjunto por Ambion, Inc. y Cenetron Diagnostics, LLC. Patentes de EE. UU. números 5,677,124; 5,919,625; 5,939,262 y patentes pendientes. Armored RNA es una marca comercial registrada de Ambion. ProClin es una marca comercial registrada de Rohm and Haas. StrataCooler es una marca comercial registrada de Stratagene. FAM and ROX son marcas comerciales de Life Technologies o sus filiales de EE. UU. y/u otros países. VIC es una marca comercial registrada de Life Technologies o sus filiales de EE. UU. y/u otros países. Abbott m, m1000, m2000, m2000rt y m2000sp son marcas comerciales de Abbott Laboratories. Celera y Spirit design son marcas comerciales registradas de Celera Corporation o sus filiales de EE. UU. y/u otros países. Abbott Molecular Inc. es el fabricante legal de: Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Kit (equipo de reactivos de amplificación) (nº de ref.: 6L18-90); Abbott RealTime HIV-1 Control Kit (equipo de controles) (nº de ref. 6L18-80) y Abbott RealTime HIV-1 Calibrator Kit (equipo de calibradores) (nº de ref.: 6L18-70). 2007, 2012 Abbott Laboratories Marzo /R1 12