11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl. 7 : C12N 5/ Inventor/es: Arruga Artal, Alberto

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl. 7 : C12N /08 A61C 8/00 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 Fecha de presentación: Solicitante/s: Alberto Arruga Artal Monasterio de Samos, 1 1º A 0008 Zaragoza, ES 43 Fecha de publicación de la solicitud: Inventor/es: Arruga Artal, Alberto 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: Agente: Ungría López, Javier 4 Título: Procedimiento de obtención de células mononucleares. 7 Resumen: Procedimiento de obtención de células mononucleares. Procedimiento de obtención de células mononucleares, partiendo de una extracción de sangre periférica, mediante sistema vacutainer comprendiendo el procedimiento diferentes fases, realizándose dos extracciones del vacutainer, a inyectar en respectivos viales (2) y (3) con un separador celular; una centrifugación de dichos viales (2) y (3); una aspiración de la capa de células mononucleares () para inyectarlas en viales (9) y (10) con un medio de cultivo; una centrifugación de ambos viales (9) y (10); una aspiración de parte (14) de su contenido, mientras que los últimos ml., conteniendo las células mononucleares (19), se agitan y se inyectan en respectivos viales (1) y (16), con un medio de cultivo; una nueva centrifugación; una nueva aspiración de parte (18) de su contenido, mientras que los últimos ml., conteniendo las células mononucleares (19), se agitan y se inyectan en un vial contenedor del elemento a implantar. ES A1 Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES A1 2 DESCRIPCIÓN Procedimiento de obtención de células mononucleares. Objeto de la invención La siguiente invención, según se expresa en el enunciado de la presente memoria descriptiva, se refiere a procedimiento de obtención de células mononucleares, siendo llevado a cabo a partir de una extracción de sangre periférica, preferentemente, de la flexura del codo del propio paciente, con objeto de obtener en pequeñas clínicas la separación y crecimiento posterior de las células mononucleares de una forma rápida y operativa, sin precisar laboratorios especializados y pudiendo realizarse en el momento en el que se va a realizar la operación de implantación de carácter ambulatorio sin necesidad de ingreso en centros hospitalarios. Así, las células mononucleares serán utilizadas como baño de inmersión de un elemento de implante, tal como un implante dental, de forma que el procedimiento de obtención puede ser llevado a cabo sin precisar un laboratorio estéril de cultivo, por lo que es de especial aplicación, para ser utilizado con carácter ambulatorio y en salas de consulta. De esta forma, el procedimiento de obtención de células mononucleares que se presenta tiene por objeto la obtención de células mononucleares a partir de una extracción de sangre periférica, preferentemente de la flexura del codo, pudiendo ser llevado a cabo en consultas médicas, tales como las odontológicas, permitiendo, durante el propio tiempo de consulta para efectuar el implante dental, haber mantenido el cuerpo de implante inmerso en un baño de células mononucleares del propio paciente, presentando la ventaja de minimizar el riesgo de rechazo, así como permitiendo que el paciente se vaya con el implante colocado. Campo de aplicación En la presente memoria se describe un procedimiento de obtención de células mononucleares, cuyo procedimiento es de especial aplicación para su puesta en practica en pequeñas clínicas al poder ser llevado a cabo sin necesidad de disponer de un laboratorio de cultivo y en un ambiente no estéril y eliminando la campana de flujo laminar. Antecedentes de la invención Como es conocido en hematología a partir de una extracción sanguínea, preferentemente periférica, en grandes centros hospitalarios o laboratorios especializados, se pueden obtener células mononucleares, mediante un adecuado tratamiento y requiriendo tiempo y aceleradores de crecimiento, para su utilización en operaciones quirúrgicas a realizar al propio paciente con posterioridad, siendo de especial utilidad en implantología, al conseguir un aumento de estas células. Por otra parte, en todas las especialidades médicas, y en general en todas las industrias, se ha producido un gran avance técnico, de manera que en especialidades médicas, tales como en odontología, se trata de evitar, en lo posible, las habituales, en tiempos, extracciones de las piezas dentales, tratando de mantener, siempre que sea posible, las piezas naturales. Lógicamente, a pesar de ello, en numerosas ocasiones se hace preciso la extracción de piezas dentales, siendo cada día más habitual sustituirlas por implantes fijos, en lugar de por puentes provisionales o permanentes, consistentes en elementos de una o más piezas dentales artificiales fijados a un soporte que se sostiene en las piezas dentales naturales contiguas, de forma que, ante la carencia de un número importante de piezas dentales su sustitución se lleva a cabo por medio de una dentadura postiza parcial, e incluso total, ante la carencia total de piezas dentales naturales. De esta forma, la implantología dental ha experimentado un importante avance, y, entre otros objetivos, se trata de evitar los rechaces del cuerpo de implante, de manera que si el cuerpo de implante es sometido a un baño de células mononucleares del propio paciente las células se adhieren al implante minimizando el riesgo de rechazos del mismo, al poder conseguir un aumento de dichas células previamente a la implantación del implante, además de facilitar la osteointegración. Así, uno de los principales inconvenientes que se presentan es poder llevar a cabo dicha técnica con carácter ambulatorio o sin necesidad de ingreso en un centro hospitalario. Por otra parte, podemos citar la Patente de Invención española P por: implante dental y método operativo de implantación, en la cual se presenta un método de obtención de células mononucleares con objeto de actuar como baño de inmersión de un implante dental, de forma que el mismo se caracteriza porque una vez extraída sangre al paciente, mantenida en el correspondiente recipiente de extracción provisto de un anticoagulante, una cantidad predeterminada de la misma se vierte en un recipiente al que se añade idéntica cantidad de suero, introduciendo la mezcla obtenida en un recipiente que contiene un separador celular de densidad 1077, centrifugándose para la separación en diferentes capas de los componentes sanguíneos, extrayéndose la capa de células mononucleares obtenida para realizarle dos lavados consecutivos en medio de cultivo de McCOYS, y su posterior introducción en el recipiente contenedor del implante a implantar, incubándose durante un tiempo predeterminado a una temperatura constante de 37 C, adhiriéndose las células mononucleares al cuerpo de implante, quedando ya dispuesto para su inmediata implantación. Descripción de la invención En la presente memoria se describe un procedimiento de obtención de células mononucleares, partiendo de una extracción de sangre periférica, preferentemente, de la flexura del codo, siendo llevado a cabo mediante el sistema vacutainer para rellenar el vacutainer conteniendo suero fisiológico con la sangre extraída y una, posterior, extracción del aire de su interior, de forma que el procedimiento comprende las siguientes fases: dos sucesivas extracciones de 3 ml. del contenido del vacutainer siendo inyectadas en respectivos viales conteniendo un separador celular; una centrifugación de los dos viales, uno frente al otro, a r.p.m. durante 20 minutos; una aspiración de la capa de células mononucleares para ser inyectadas en correspondientes viales con un medio de cultivo; una centrifugación de ambos viales a r.p.m. durante minutos; una aspiración de parte del contenido de ambos

3 3 ES A1 4 viales y su desecho o inyección en correspondientes viales, mientras que los últimos 1 ó 1, ml., conteniendo las células mononucleares, se agitan y se inyectan en otro vial con un medio de cultivo; una nueva centrifugación a r.p.m. durante minutos; una aspiración de parte del contenido de ambos viales y su desecho o inyección en correspondientes, mientras que los últimos 1 ó 1, ml., conteniendo las células mononucleares, se agitan y se inyectan en un vial contenedor del elemento a implantar o directamente se aplica al paciente Además, la parte aspirada del contenido de los viales no desechada e inyectada en los correspondientes viales conteniendo CICa permite la obtención de gel. De esta forma, la gran ventaja que presenta el procedimiento propuesto es que el mismo se puede llevar a cabo en un medio no estéril, pudiendo ser aplicado con carácter ambulatorio y en consultas, tales como las odontológicas. Así, el procedimiento que se presenta, aplicable, genéricamente, en implantología, es de especial utilidad para su aplicación en implantes dentales, dado que para su puesta en práctica se necesita una mínima inversión económica, de manera que en una única operación se pueden llevar a cabo los implantes deseados. Para complementar la descripción que seguidamente se va a realizar, y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña a la presente memoria descriptiva, de un juego de planos, en cuyas figuras de forma ilustrativa y no limitativa, se representan los detalles más característicos de la invención. Breve descripción de los diseños Figura 1. Muestra una vista de las sucesivas fases relativas al procedimiento de obtención de células mononucleares, partiendo de una extracción sanguínea periférica. Descripción de una realización preferente A la vista de la comentada figura y de acuerdo con la numeración adoptada podemos observar como una vez que se ha partido de una extracción de sangre periférica, preferentemente, de la flexura del codo, mediante el sistema vacutainer para rellenar el vacutainer con suero fisiológico con la sangre extraída y una, posterior, extracción del aire de su interior, en una primera fase se procederá a realizar dos extracciones de 3 ml. cada una de ellas del vacutainer 1 siendo inyectadas en respectivos viales 2 y 3 que contienen un separador celular. A continuación, en una segunda fase, los viales 2 y 3 son centrifugados por medio de la centrifugadora 4, uno frente al otro, a r.p.m. durante 20 minutos, de forma que las células mononucleares conforman un anillo de color blanco opaco, quedando por encima de ellas la placa leucoplaquetar 6 e inferiormente queda el separador 7 y en el fondo la capa eritrocitaria 8. En una tercera fase las células mononucleares son aspiradas e inyectadas en correspondientes viales 9 y 10 contenedores de un medio de cultivo, para, en una cuarta fase, ser centrifugados, por medio de la centrifugadora 11, a r.p.m. durante minutos, de forma que las células mononucleares 19 quedan agrupadas en proximidad al fondo del vial. En una quinta fase se aspira parte 14 del contenido de los viales 9 y 10 y se desecha o inyecta en correspondientes viales 13 y 12 contenedores de CICa, de forma que con los últimos 1 ó 1, ml., conteniendo las células mononucleares 19 se agita y se inyecta en otros viales 1 y 16 que contienen un medio de cultivo, de manera que, en una sexta fase, se centrifugan, en la centrifugadora 17, los viales 1 y 16 a r.p.m. durante minutos. Finalmente, en una séptima fase se aspira parte 18 del contenido de los viales 1 y 16 y se desecha o inyecta en correspondientes viales 20 y 21 contenedores de CICa, de forma que el resto, conteniendo las células mononucleares 19, se agita y se aspira para su utilización, de manera que el mismo puede ser inyectado en un vial que contenga un cuerpo de implante dental, puede ser colocado directamente en un alvéolo donde vaya a ser implantado un implante dental, puede ser mezclado con hueso autólogo o no, etc.. Asimismo, la parte (14)-(18) aspirada del contenido de los viales (9)-(10) y (1)-(16) e inyectada en los correspondientes viales (13)-(12) y (20)-(21) conteniendo ClCa permite la obtención de gel. Así, mediante el procedimiento descrito se permite obtener en pequeñas clínicas células mononucleares de una forma rápida y operativa, sin precisar un laboratorio especializado, siendo de especial aplicación en implantología de carácter ambulatorio. De esta forma, el procedimiento de obtención de células mononucleares es de especial aplicación en implantología dental, dado que el mismo puede ser aplicado en pequeñas clínicas con carácter ambulatorio, sin necesidad de disponer de un laboratorio especial, por lo que no es precisa una gran inversión económica, y con la ventaja añadida de poder llevarse a cabo en el momento de realizar la operación de implantación

4 ES A1 6 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de obtención de células mononucleares, partiendo de una extracción de sangre periférica, preferentemente, de la flexura del codo, mediante el sistema vacutainer (1), u otro similar, para rellenar el vacutainer con suero fisiológico con la sangre extraída y una, posterior, extracción del aire de su interior, caracterizado porque el procedimiento comprende las siguientes fases: dos sucesivas extracciones de 3 ml. del contenido del vacutainer (1) siendo inyectadas en respectivos viales (2) y (3) conteniendo un separador celular; una centrifugación, por medio de una centrifugadora (4), de los dos viales (2) y (3), uno frente al otro, a r.p.m. durante 20 minutos; una aspiración de la capa de células mononucleares () para ser inyectadas en correspondientes viales (9) y (10) con un medio de cultivo; una centrifugación, por medio de una centrifugadora (11), de ambos viales (9) y (10) a r.p.m. durante minutos; una aspiración de parte (14) del contenido de ambos viales (9) y (10) y su desecho o inyección en correspondientes viales (13) y (12), mientras que los últimos 1 ó 1, ml., conteniendo las células mononucleares (19), se agitan y se inyectan en otro vial (1) y (16), respectivamente, con un medio de cultivo; una nueva centrifugación, por medio de una centrifugadora (17), a r.p.m. durante minutos; una aspiración de parte (18) del contenido de ambos viales (1) y (16) y su desecho o inyección en correspondientes viales (20) y (21), mientras que los últimos 1 ó 1, ml., conteniendo las células mononucleares (19), se agitan y se inyectan en un vial contenedor del elemento a implantar. 2. Procedimiento de obtención de células mononucleares, según reivindicación 1ª, caracterizado porque la parte (14)-(18) aspirada del contenido de los viales (9)-(10) y (1)-(16) e inyectada en los correspondientes viales (13)-(12) y (20)-(21) conteniendo CICa permite la obtención de gel

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6 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 ES Nº de solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 1 Int. Cl. 7 : C12N /08, A61C 8/00 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones X EP A2 (ARRUGA ARTAL) , columna 7, 1 párrafos 40,41,43. E ES A1 (ARRUGA ARTAL) , resumen. 2 afectadas A US A (DORN A.R.) , ejemplos 2,3. 1 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador Página A. Maquedano Herrero 1/1