INFECCIONES POR ESPECIES DE MALASSEZIA

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1 INFECCIONES POR ESPECIES DE MALASSEZIA INTRODUCCION Las levaduras del género Malassezia forman parte de la micota normal de la piel de humanos y de animales de sangre caliente. Estas levaduras pueden jugar un rol en la pitiriasis versicolor (P.V.), dermatitis seborreica (D.S.), foliculitis, dermatitis atópica (D.A.) y en infecciones sistémicas. En esta última categoría, las especies de Malassezia pueden estar asociadas con sepsis por catéteres, fungemias e infecciones pulmonares en neonatos siendo en algunos casos amenaza de vida. Las especies de Malassezia son capaces de causar también un amplio rango de enfermedades en animales. Estos hongos levaduriformes existen en una interfase entre comensal y patógeno y como tal, su interacción con el sistema inmune del huésped es de gran interés. AGENTES ETIOLOGICOS. TAXONOMIA La taxonomía y nomenclatura de las especies de Malassezia fue confusa hasta muy recientemente en que se concluyó que es un hongo dimórfico, existiendo ambas fases filamentosas y micelial. En 1997, se indujo a la levadura a producir hifa in vitro usando una variedad de condiciones de cultivos. También se observó que las formas levaduriformes ovales y redondeadas, producen hifas y esto permitió sugerir que dichas formas son simples etapas en el ciclo de vida de un mismo organismo. Antes de 1990, solamente tres especies de Malassezia fueron reconocidas, a saber: furfur (Robin) Baillon, pachydermatis (Weidman C. W. Dodge), y sympodialis (Simmons y Guého). Con el desarrollo de técnicas moleculares se incorporaron nuevas especies dentro del género Malassezia: restricta, obtusa, sloffiae y globosa de acuerdo a la comparación de sus secuencias genómicas y ribosomal de un gran número de aislamientos humanos y de animales. Las siete especies difieren en la morfología celular y en la de sus colonias, en el % G+C, serotipos, secuencias de ADN/ARN ribosomal 25S, requerimientos de ácidos grasos de cadena larga, actividad catalasa y tolerancia a la temperatura. En 2002 Sugita et al. hicieron la descripción de otra nueva especie: dermatis, la cual fue identificada mediante el análisis de las secuencias del gen del ARNr (regiones D1 y D2 del 26S del ADNr) y los ITS (Internal Transcribed Spacer)), a partir del aislado de un paciente japonés con dermatitis atópica. El mismo grupo de investigadores describió al año siguiente japonica identificada también por métodos moleculares (PCR anidada) y en el año 2004 propusieron a yamatoensis aislada de un paciente japonés con dermatitis seborreica. También en 2004, el grupo japonés de Hirai et al. describió nana en animales, utilizando secuenciación de ADNr de la subunidad 26S y del ITS1. En 2006 se aislaron por medio de análisis comparativos de marcadores moleculares de regiones D1/D2, análisis de la subunidad 26S de ADNr y secuencias de nucleótidos, dos nuevas variedades; las cuales se identificaron en animales domésticos y se denominaron caprae (aislada de piel sana de cabras) y equina (aislada principalmente en caballos), las cuales presentan características morfológicas y fisiológicas distintivas. En el año 2010, el grupo de Cabañés et al. propusieron otra nueva especie, cuniculi sp. nov. aislada de piel de conejos, avalado este hallazgo por el análisis de las regiones D1/D2 del gen de la subunidad 26S del ARNr y de la secuencia génica ITS-5.8S del ARNr. El análisis filogenético de las secuencias de esta nueva especie demostró que ella podía ser

2 claramente distinta de las otras trece especies descriptas, dado que excedía la variación interespecies que ocurre generalmente. Por lo tanto, actualmente el género cuenta con 13 especies aceptadas y una especie aún en estudio para ser formalmente incluída dentro del género Malassezia. Taxonómicamente, Malassezia, se clasifica en: Reino: Fungi División: Basidiomycota Clase: Ustilaginomycetes Orden: Malasseziales Género: Malassezia ESTRUCTURA, FISIOLOGIA Y BIOQUIMICA La forma levaduriforme del género Malassezia predomina en los cultivos, aunque la micelial puede ser vista en algunas especies. Su reproducción asexual esta es enteroblástica, monopolar con una base de brotación ancha o estrecha que es una característica especie específica. La célula madre e hija son divididas por un septo, y la célula hija se separa por fisión, dejando una cicatriz o collarete a través de la cual sucesivas células pueden surgir. La pared celular de este género está pobremente caracterizada, siendo más gruesa que otras levaduras (0,12u) ya que se presenta con una pared celular gruesa de multicapa y cuya pared interna es corrugada, constituyendo el 26 al 37% del volumen celular. Sus componentes son: mananoproteínas (70%), proteínas (10%), lípidos (15 al 20 %) y quitina (1 a 2%) con pequeñas cantidades de nitrógeno y sulfuro. Se considera que la capacidad inmunomodulatoria de las levaduras de Malassezia está relacionada con los lípidos de la pared celular. La membrana celular está fuertemente unida a la pared celular interna. Un rasgo fisiológico que poseen estas levaduras es el de utilizar los lípidos como única fuente de carbono. Esta afinidad por los lípidos varía entre las especies del género, pudiéndose hablar de especies lipodependientes aquellas que necesitan para su desarrollo ácidos grasos de cadena larga (C 12 a C 24 ) y de levaduras no lipodependientes que pueden crecer en presencia de ácidos grasos de cadenas cortas, generalmente presentes en los medios de cultivo habituales de laboratorio. La incapacidad de este organismo para formar ácidos grasos de cadena larga se debe al bloqueo en la síntesis de novo del ácido mirístico, requiriendo la adición de ácidos grasos preformados. Se demostró que los lípidos presentes en la flora normal de la piel humana son capaces de satisfacer los requerimientos lipídicos de este organismo. Las estrictas necesidades nutricionales, su capacidad de presentar simultáneamente forma micelial y de levadura y la inestabilidad morfológica de este último estado, han condicionado su aislamiento e identificación, dificultando por muchos años su estudio in Vitro Se ha comprobado que no fermentan los azúcares; no requieren vitaminas, ni trazas de elementos ni electrolitos, y preferencialmente usan metionina como única fuente de sulfuro, aunque pueden utilizar cistina o cisteína. Son capaces de usar algunos aminoácidos, así como sales de amonio, como fuente de nitrógeno. Aunque estas levaduras desarrollan normalmente in vitro en condiciones aeróbicas, también son capaces de desarrollar bajo una microaerofilia y condiciones anaeróbicas. Las especies de Malassezia elaboran un amplio rango de enzimas y metabolitos entre ellas lipasa que presenta.actividad lipídica in vivo e in vitro. Está localizada en la pared celular y/o membrana y el citoplasma. También producen fosfolipasas.

3 Un mecanismo propuesto para explicar la causa de las alteraciones en la pigmentación de la piel con P.V.está asociado a la presencia del ácido azelaico (metabolito producido durante el desarrollo de Malassezia en presencia de ácido oleico, que actúa como un inhibidor competitivo de la tirosinasa, enzima involucrada en la producción de la melanina). EPIDEMIOLOGIA Las levaduras del género Malassezia forman parte de la micota normal de la piel de humanos y puede ser aislada de áreas ricas en glándulas sebáceas de la piel particularmente del tronco, espalda y regiones de la cabeza. De acuerdo a estudios realizados, sympodialis, globosa y furfur son las especies mayormente aisladas en las patologías dérmicas producidas por Malassezia. Sin embargo, existen diferencias en cuanto a la prevalencia de cada especie según la patología en cuestión, la región geográfica de donde provenga el estudio epidemiológico y las técnicas utilizadas para el asilamiento e didentificación. En cuanto a la edad, se ha observado la colonización en niños y en recién nacidos. En general, la presencia de Malassezia parece incrementarse en la pubertad, correlacionado con el incremento de la actividad de glándulas sebáceas. El aumento de las fungemias de Malassezia está relacionada al uso de catéter en la alimentación parenteral lipídica, en niños prematuros, de bajo peso al nacer y en pacientes añosos que sufren extensos períodos de hospitalización. FORMAS CLINICAS PITIRIASIS VERSICOLOR Es una infección crónica, en general asintomática, del estrato córneo. Las lesiones se caracterizan por tener consistencia furfurácea o parecida al salvado. Pueden presentase en forma aislada o en varias zonas del cuerpo. Se presenta con áreas cutáneas que cambian de color, pudiendo ser hipo o hiperpigmentada. Las zonas más frecuentemente involucradas son: tórax, abdomen, miembros superiores, espalda y cara. Los factores responsables de la proliferación de estos microorganismos no están aún bien establecidos. Una hipótesis sería que la descamación de la piel de forma lenta favorecería en muchos pacientes el desarrollo de la enfermedad, ya que en personas tratadas con corticoides en forma local o por vía endógena la susceptibilidad a contraer PV aumenta. Esta facilidad desaparece cuando se suspende la medicación. También se sugiere predisposición genética, malnutrición, acumulación de glucógeno extracelular, embarazos, pero sobre todo el uso de sustancias oleosas sobre la piel o alteraciones metabólicas que aumentan la concentración de ácidos grasos a nivel de la piel. También influye la alta humedad y temperatura ambiente. Se presenta con mayor frecuencia en adolescentes y en personas de mediana edad, pero también se produce en niños y recién nacidos. No existe diferencia con respecto al sexo. Su distribución es mundial aunque se obseva más en climas tropicales. La modificación de la pigmentación se explicaría por la alteración de la filtración de la luz UV debida a la presencia del microorganismo en la piel, que bloquea la transferencia de melanosomas a queratinocitos, y la consiguiente inhibición de la producción de la melanina por acción del ácido azelaico; competidor por inhibición de

4 la tirosinquinasa. Esta es la hipótesis que más se propone, pero el mecanismo por el cual la pigmentación es alterada todavía no se conoce. DERMATITIS SEBORREICA La DS se presenta con descamación e inflamación de áreas del cuerpo ricas en glándulas sebáceas tales como cara, tronco, cejas, pliegues nasolabiales, mejillas, y regiones esternal e intraescapular. En la población normal, la incidencia es del orden de 1 al 3%, mientras que en pacientes con Sida la incidencia es mucho mayor: 30 al 83%. Se presenta después de la pubertad volviéndose crónica con frecuentes estallidos, ocasionados por stress. En pacientes con Sida, la condición puede ser mucho más severa y refractaria a la terapia que en personas no Sida. La relación entre DS y caspa es controvertida. Distintos autores creen que ambas son distintas entidades clínicas, mientras otros creen que la caspa es una forma no inflamatoria y más suave de la DS, caracterizada por una excesiva descamación. La alta incidencia de DS producida por Malassezia en pacientes inmunocomprometidos sugiere la relación de este microorganismo y el sistema inmune. La alteración de la inmunidad mediada por células puede facilitar la sobrevida de estas levaduras en la piel. Aún no se conoce correctamente qué especies de Malassezia están asociadas a la DS probablemente debido a que aún no se emplearon métodos cuantitativos convenientes. De acuerdo al balance de evidencias se sugiere que el organismo es muy importante en la etiología de estas infecciones y no sólo un aumento en la colonización. FOLICULITIS La foliculitis por Malassezia consiste en pápulas pruriginosas y pústulas que ocurren principalmente en el tronco, brazos, cuello y en menor proporción en la cara. Generalmente se presenta en pacientes con prolongada terapia antibiótica y asociada con embarazo, leucemia, trasplante de médula ósea, Sida, síndrome de Down, enfermedad de Hodgkin, diabetes, y trasplantes de riñón y corazón. Se presenta con mayor frecuencia en países con clima tropical probablemente debido al calor y la humedad; y en climas templados se presenta frecuentemente en los meses de verano. Bajo la influencia de factores predisponentes, se postula que la foliculitis por Malassezia se produce por el crecimiento exacerbado de las levaduras en el folículo piloso, pudiendo la oclusión local jugar un rol importante en el desarrollo de la enfermedad. En los pacientes se localiza en regiones corporales grasas y con oclusión local. La inflamación que se observa en esta patología, se debe a los metabolitos que producen estos hongos tras la hidrólisis de los ácidos grasos del medio consecuencia de la acción de las lipasas y fosfolipasas que liberan al medio. DERMATITIS ATOPICA La DA es una enfermedad crónica inflamatoria multifactorial de la piel, la cual ha tenido un marcado incremento en las últimas décadas. Recientemente se ha recomendado el uso de una nueva nomenclatura para nombrar a esta enfermedad:

5 eczema atópico/ síndrome dermatitis (EASD), término que refleja la heterogeneidad en este grupo de pacientes. La DA es una enfermedad inflamatoria, crónica, de la piel cuya etiología es aún desconocida. Los síntomas iniciales de la DA o sus subsecuentes exacerbaciones pueden ser producidas por: stress emocional, infecciones, irritantes químicos y mecánicos, sudoración y alergenos. La patogénesis del EASD no se comprende completamente. Hay suficiente evidencia de que Malassezia es un factor contribuyente en el EASD (principalmente cuando se localiza en el cuello y en la cabeza), pero sigue siendo un enigma cómo, dónde y cuándo un individuo se vuelve sensibilizado a este hongo oportunista. Se supone que la sensibilización se produce a través de la barrera de la piel, que se encuentra debilitada en los pacientes con EASD, donde las células de Langerhans interactúan con Malassezia, migrando luego a los nódulos linfáticos regionales en donde presentan los alergenos a otras células del sistema inmune produciendo de esta manera una respuesta inmune. Los pacientes con DA generalmente tienen altos niveles de IgE total, especialmente en la enfermedad severa. Mientras que la IgE puede ser importante en las manifestaciones respiratoria de la atopía (rinitis alérgica y asma bronquial) su rol en la DA aún no es claro. OTRAS ENFERMEDADES SUPERFICIALES Malassezia ha sido asociado a un amplio rango de enfermedades superficiales, incluyendo acné vulgaris, dacriocystitis, blefaritis seborreica, pustulosis neonatal, papilomatosis reticular y confluente, onicomicosis, infección nodular del pelo y psoriasis. En algunos de estos casos el aislamiento de Malassezia fue considerado como el causante de la enfermedad, pero su condición de comensal en la piel muchas veces dificulta entender su verdadero rol. Esta levadura también ha sido implicada en infecciones más profundas que las anteriores como: mastitis, sinusitis, artritis séptica y otitis externa maligna. ENFERMEDADES SISTEMICAS Las especies de Malassezia están relacionadas con procesos sistémicos habiéndose aislado de peritonitis, tejido pulmonar y especialmente en hemocultivos de sujetos con catéteres venosos centrales y sometidos a alimentación parenteral. Los grupos más expuestos para desarrollar una sepsis por Malassezia son principalmente los prematuros y lactantes de bajo peso que reciben alimentación rica en lípidos a través de un catéter venoso central. En esta situación, la población de levaduras se multiplica exageradamente, coloniza el catéter y penetra al torrente sanguíneo. También se ha aislado ocasionalmente de niños menores o adultos con las mismas características antes dichas y portadores de enfermedades subyacentes graves (anemia aplásica, enfermedad de Crohn, trasplante de médula ósea, nutrición parenteral, etc.).la sintomatología de la sepsis por Malassezia es inespecífica: fiebre, trombocitopenia, hepatoesplenomegalia, infiltrados pulmonares, leucocitosis. El diagnóstico no es sencillo, debido a que normalmente no se utilizan medios de aislamiento adecuados que son los que contienen un suplemento lipídico. Por esto, es

6 importante considerar la probablidad que estas levaduras pueden ocasionar este tipo de infección y procesar los hemocultivos para poder recuperar olas levaduras desde los mismos. El tratamiento consiste en la extracción del catéter y suspender, si es posible, la emulsión lipídica y administrar anfotericina B u otro antifúngico. Se ha aislado pachydermatis en este tipo de infección, como consecuencia de la colonización de las manos de personal paramédico dedicado a la atención de los pacientes hospitalizados. furfur también ha sido involucrada en esta afección. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO La toma de muestra se realiza : técnica de la cinta transparente engomada (cinta Scotch): consiste en colocar un trozo de cinta transparente sobre las lesiones; se presiona sobre la cinta y después de unos pocos segundos, se retira y se adhiere sobre un portaobjeto. raspando con bisturí estéril las lesiones y recogiendo las escamas entre dos portaobjetos estériles EXAMEN DIRECTO Se realiza con colorante azul de lactofenol para ser observado con microscopio óptico. También se puede emplear la técnica de Blanco de Calcofluor para la observación por fluorescencia directa. Se observará levaduras unicelulares o brotantes y/o filamentos anchos, cortos como letras chinas. El diagnóstico se puede realizar con el examen directo, y puede ser informado sin necesidad de esperar los cultivos. CULTIVOS Los medios de cultivo empleados son: agar Sabouraud glucosa con y sin el agregado de aceite de oliva; medio de Dixon modificado o medio de Leeman y Notman. Estos últimos tienen incorporados los ácidos grasos necesarios para el desarrollo de estas levaduras. Se incuba a 32 ºC durante 5-7días. Las caraterísticas macro y micromorfológicas de las distintas especies se detallan en la Tabla 1 y Tabla 2. ESTUDIOS FISIOLOGICOS (Tabla 3) -Test de la catalasa: En un portaobjeto, se deposita una pequeña porción de la colonia de la levadura a identificar. Sobre ella se agrega una gota de agua oxigenada de 10 volúmenes. La producción de gas indica resultado positivo sin tener en cuenta la intensidad de las mismas.. -Test de la esculina: En tubos conteniendo agar esculina, se siembra en profundidad la levadura a investigar. Incubar a 32 C durante 5 días. El oscurecimiento del medio indica resultado positivo. Esta prueba evidencia la existencioa de la enzima ß-glucosidasa que desdobla la

7 esculina en esculetina y glucosa oscureciendo el medio por la liberación de sales férricas incorporadas en el medio. -Test de asimilación de Tween 20, 40, 60, 80: Se coloca en una placa de Petri agar Sabouraud glucosa con una suspensión de la levadura en estudio (10 5 células/ ml). Se homogeiniza y se deja solidificar. Se realizan cuatro hoyos de 2mm de diámetro con sacabocado y se llena cada uno con Tween 20, 40, 60, y 80 respectivamente. Se incuba a 32 C durante 7 días. El desarrollo levaduriformes alrededor de cada uno de los hoyos indica resultado positivo. -Termotolerancia a 37ºC y 42ºC: En el medio de agar Dixon se siembra la levadura a investigar y se la incuba a 37 C y 42 C, durante 7 días. -Asimilación del Aceite de ricino La capacidad para asimilar este aceite se evalúa agregando una suspensión de 10 5 células/ml de la levadura en estudio al medio de cultivo Mycosel, previamente fundido y enfriado a 50 C aproximadamente. Luego del mezclado, esta suspensión se vierte en una placa de petri. Una vez que el agar solidifica, se realiza un hoyo que se rellena con una gota de aceite de ricino. Las placas se incuban a 32ºC por una semana. La utilización del compuesto se analiza por el grado de crecimiento de las levaduras alrededor del pocillo. -Desarrollo en ChromAgar-Malassezia Las cepas de Malassezia a identificar se siembran en CHROMAgar-Malassezia (CHROMM), y se incuba a 32ºC durante 6 días. En CHROMM se evalúa fundamentalmente la presencia o no de precipitado; la morfología de la colonia: lisa o rugosa y el color. Se anexan Tabla 3 con resultados de las pruebas fisiológicas y los dos algoritmos de trabajo que coexisten en la actualidad para la identificación de especies de Malassezia. BIBLIOGRAFIA Arenas R. Micología Médica 1993 Arango ; Castañeda E. Micosis Humanas. Procedimientos diagnósticos. Exámenes directos Ediciones Rojo, Medellín. Editorial Presencia, Santa fe de Bogotá. Ashbee H., Evans G. V Immunology of Diseases Associated with Malassezia species. Clinical Microbiology Reviews: 15 (1) Faergeman J Atopic Dermatitis and Fungi. Clinical Microbiology Reviews: 15 (4) Kibbler C.C.; Mackenzie D.W.R.; Odds F.C. Principles and Practice of Clinical Mycology John Wiley & Sons. Chichester- New York- Brisbane- Toronto- Singapore. Negroni R. Lecciones de Clínica Micológica Ed. La Agenda Buenos Aires. Rippon J.W. Micología Médica. Hongos y actinomicetos patógenos Ed. Interamericana- Mc Graw- Hill.

8 TABLA 1. CARACTERISTICAS MACROMORFOLOGICASS DE LAS ESPECIES DE MALASSEZIA Características Macroscópicas Superficie/aspecto furfur sympodialis slooffiae globosa obtusa restricta dermatis Lisa o Lisa, plana o con Rugosa con Elevada, a Lisa y plana Lisa o rugosa, convexa de la colonia acuminada, una ligera surcos veces cremosa cremosa elevación central radiantes finos plegada, cremosa Bordes Color de la colonia Enteros o lobulados Crema a amarillento, brillante u opaco amarillento Lobulados Lobulados Lobulados Lisos Lobulados Borde liso o lobulado Crema, brillante Crema Crema Crema, brillante Opaco a Crema Blanco a

9 Tabla 1 (continuación) Características Macroscópicas japonica yamatoensis nana cuniculi sp. nov caprae equina pachydermatis Superficie/aspecto Lisa o ligeramente rugosa Lisa, Lisa, Convexa Rugosa Convexa, acuminada de la colonia rugosa convexa convexa Convexa a veces Bordes Borde liso o Borde liso o Lisos o Lisos Levemente Plegados o Lisos lobulado lobulado apenas plegados, irregulares plegado lobulados Color de la colonia Opaco. Brillante. Crema Opaco a Crema a Opaco a Brillante a Brillante a opaco. Crema a a amarillento brillante. blanca brillante. opaco. Crema Crema a amarillento amarillento Crema a Crema, amarillo blanquecino

10 Tabla 2-CARACTERÍSTICAS MICROMORFÓLOGICAS DE ESPECIES DE MALASSEZIA Características Forma y tamaño de la célula Patrón de brotación furfur Elongado, oval a esférica, 6 µm. Base ancha de brotación sympodialis Ovoide, globosa, 2,5-5 µm en longitud Brotación simpodial pachydermatis Cilíndrica, 2,5-4 µm en longitud Base ancha de brotación, cicatriz marcada al brotar globosa slooffiae restricta obtusa Esférica, 6-8 µm en diámetro. Base estrecha de brotación Cilíndrica, 1,5-3,5 µm en longitud. Base ancha de brotación Esférica, oval, 2-4 µm Base estrecha de brotación Cilíndrica 4-6 µm. Base ancha de brotación

11 Tabla 3-CARACTERÍSTICAS FISOLÓGICAS DE ESPECIES DE MALASSEZIA Especies de Malassezia Prueba fisiológica furfur pachydera sympodialis globosa slooffiae restricta obtusa mtis Reacción + v catalasa Crecimiento Bueno Bueno Bueno Pobre Bueno Pobre Pobre 37ºC Crecimiento Bueno Bueno Bueno No Bueno No No 42ºC Descomposición +/ de esculina Uso de lípidos Tween Tween 40/ Tween Aceite Ricino + v Aclaración: +, positivo; -, negativo; v, variable.

12 Identificación de especies de Malassezia (Guillot et al. y Mayser et al.; 1996) Malassezia spp. (a) Sub-cultivo en Sb-Glucosa pachydermatis (+) (-) (b) Utilización de Tweens sympodialis furfur (+) sympodialis (+) furfur (c) Aceite de ricino (-) (e) Pba. de la esculina (-) slooffiae slooffiae (-) (d) Catalasa restricta (+) (e) Pba. de la esculina (-) (+) globosa obtusa Estudio microscópico Células globosas Células cilíndricas

13 ALGORITMO DE IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE MALASSEZIA (Kaneko et al., 2007) Cultivo en CHROMM Presencia de pp. Subcultivo en ASG (+) (-) pachydermatis Esculina E (+) G (-) sympodialis E (-) G (+) dermatis Catalasa (-) restricta E (-) G (-) globosa Ausencia de pp. grande, Esculina rosa, rugosa E (-) G (+) furfur E (+) G (+) slooffiae E (+) japonica G (-) obtusa pp: precipitado G: desarrollo en AE E: hidrólisis de esculina