Microtúbulos. Cuando una célula entra en mitosis los microtúbulos citoplasmáticos se desensamblan y se reensamblan para formar el huso mitótico.

Transcripción

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2 Microtúbulos MTs del huso MTs de interfase vesícula axonema Cuando una célula entra en mitosis los microtúbulos citoplasmáticos se desensamblan y se reensamblan para formar el huso mitótico.

3 Estructura de las subunidades de tubulina y los microtúbulos Análisis al microscopio electrónico de la polaridad de microtúbulos seccionados transversalmente la orientación de los ganchos de tubulina en dirección horaria indican que el extremo (+) apunta hacia el observador. El dímero de tubulina une dos moléculas de GTP. Los heterodímeros de tubulina se ensamblan para formar los microtúbulos. La molécula de GTP unida a la subunidad de tubulina beta puede hidrolizarse afectando la dinámica de los microtúbulos. La orientación constante de los monómeros en los polímeros determina su polaridad estructural. Las velocidades de crecimiento diferentes de los extremos (+) y (-) son consecuencia de esta polaridad. extremo (-) hacia el frente

4 Los polímeros de tubulina exhiben polaridad funcional La incubación de fragmentos de polímero (ej. axonemas) con concentraciones de monómero de tubulina varias veces mayor a la Cc resulta en la elongación de los polímeros por ambos extremos, aunque uno crece ~ 5 veces mas rápido que el otro. Al extremo de mayor crecimiento se lo denomina extremo (+) y al de crecimiento lento extremo (-). Cuando la concentración de monómero se diluye por debajo de la Cc, los polímeros se desensamblan por ambos extremos, aunque se acortan mas rápido por el extremo (+). polimerización de tubulina núcleos tubulina > Cc mayor elongación del extremo (+) dilución tubulina < Cc desensamble preferencial del extremo (+)

5 Los microtúbulos además exhiben un comportamiento dinámico conocido como inestabilidad dinámica La inestabilidad dinámica de los microtúbulos puede visualizarse en células vivas. tiempo 0 tiempo 2 min tiempo 5 min tiempo 11 min A diferencia del treadmilling, la inestabilidad dinámica se caracteriza por la alternancia entre fases de crecimiento lento y de acortamiento rápido en los extremos (+). La transición de la fase de crecimiento a la de acortamiento se denomina catástrofe y la transición de acortamiento a crecimiento rescate. 10 mm Lodish et al MCB2004

6 La inestabilidad dinámica es una consecuencia de la presencia de tubulina-gdp/gtp en los extremos (+) de los MTs Alberts et al., MBC2002 La inestabilidad dinámica de los microtúbulos depende de la presencia de tubulina-gdp o tubulina- GTP en los extremos (+). En una población de microtúbulos, existe una mezcla de ambos estados. Cuando la velocidad de adición de monómeros supera a la de la hidrólisis del GTP se acumula tubulina-gtp ("GTP cap"), condición que favorece la elongación. Cuando el cap de GTP se pierde, la velocidad de disociación de monómeros incrementa dramáticamente, causando el acortamiento rápido del MT. extremo estable extremo inestable

7 En las células el estado de polimerización de la actina y tubulina es regulado por diversas proteínas asociadas proteínas que se unen a las subunidades no ensambladas * proteínas que causan la fragmentación de los polímeros tubulina actina microtúbulos katanin microfilamentos gelsolin stathmin thymosin stathmin-p profilin *las proteínas promueven la depolimerizacion ( )o polimerizacion ( ) de los respectivos polímeros proteínas que se asocian a las paredes de los polímeros y los estabilizan microtúbulos microfilamentos MAP2, Tau XMAP215 tropomyosin microtúbulos proteínas que se unen a los extremos de los polímeros microfilamentos proteínas que se asocian a las paredes de los polímeros y los desestabilizan g-turc (-), nucleación + TIPs (CLIP170, Op18) CapZ (+), capping Arp2/3 (-), nucleación microtúbulos XMAP215-P KIF2 microfilamentos cofilin

8 En las mayoría de las células animales los microtúbulos se organizan a partir de los centrosomas El centrosoma esta formado por un par de centríolos. El material pericentriolar contiene numerosos complejos de tubulina gama donde se nuclean los microtúbulos y se anclan los extremos (-). g -Turc: gama Tubulin ring complex inmunofluorescencia dímero αβ g-turc Microscopía electrónica de un MT nucleado en un anillo de tubulina g anillo de γ-tubulina proteínas accesorias

9 Ciertas MAPs (+TIPs) se unen a los extremos (+) de los microtúbulos y afectan su dinamismo Alberts et al., MBC2002 ej. CLIP170 ej. Op18, XKCM1, XKIF2

10 Una serie de proteínas denominadas +TIPs se unen al extremo (+) de los microtúbulos y regulan su función EB1, CLIP170 y otras, son ejemplos de proteínas que interaccionan con el extremo (+) de los microtúbulos en crecimiento. Cumplen diversas funciones, promueven la estabilidad del extremo (+), promueven el anclaje de microtúbulos con membranas, filamentos de actina, interaccionan con moléculas motoras, moléculas de señalización, etc. La interacción de estos factores con el extremo (+) permite que la célula emplee la energía que libera la polimerización de microtúbulos para generar fuerzas que pueden usarse para posicionar el huso, cromosomas u organelas. Galjart 2005 Nat Rev Mol Cell Biol

11 Alberts et al., MBC2002 Otras MAPs se unen a los monómeros y promueven la depolimerización de los MTs stathmin secuestra tubulina no ensamblada, favoreciendo la frecuencia de catastrofes de los extremos (+)

12 Alberts et al., MBC2002 MAP2 y Tau se unen a la pared de los MTs y contribuyen a su estabilización y espaciamiento en fascículos MAP2 y tau son proteínas de entrecruzamiento que regulan el espaciamiento entre MTs. MAP2 Tau Microscopía electrónica de células transfectadas con MAP2 o Tau.

13 En neuronas MAP2 se localiza principalmente en dendritas y Tau en axones Microscopía electrónica de un axón (A) y de una dendrita (B). Observe el diferente espaciamiento de los microtúbulos. A B tau MAP2 Neurona de hipocampo. La inmunofluorescencia revela la localización de MAP2 en dendritas (anaranjado) y de la tau en axones (verde).

14 Drogas que alteran la dinámica de microtúbulos se usan como agentes quimioterápicos para el tratamiento de tumores Las drogas que afectan la polimerización de tubulina son agentes citotóxicos. Las drogas que estabilizan los microtúbulos (taxol y epotilonas) se unen al sitio taxano en la subunidad β de tubulina estabilizando los contactos longitudinales y laterales. Laulimalida y pelorusida A estabilizan los microtúbulos uniendo dos subunidades β protofilamentos adyacentes. Los agentes desestabilizantes se unen al sitio de colchicina ubicado entre las subunidades α y β de tubulina en el mismo dímero, o al sitio de vinca, que se forma entre subunidades α y β de dos dímeros distintos alineados longitudinalmente. Los complejos tubulina-colchicina pueden incorporarse durante la elongación alterando los extremos del microtúbulo. Los compuestos dirigidos al sitio maitansina se unen a tubulina β en el extremo más del microtúbulo inhibiendo la elongación. Akhmanova (2015) Nat Rev Mol Cell Biol

15 Los microtúbulos y las moléculas motoras son esenciales para el transporte intracelular Los microtúbulos de fibroblastos y de conos de crecimiento axonal son dinámicos y alternan fases de elongación y acortamiento. Durante la mitosis, el treadmilling de microtúbulos del cinetocoro (B) facilita la segregación de cromosomas. Galjart 2005 Nat Rev Mol Cell Biol

16 El transporte axonal de proteínas puede estudiarse bioquímicamente empleando precursores radioactivos La breve incorporación (pulso) de un aminoácido radioactivo en proteínas que se sintetizan en el soma de las neuronas del ganglio de la raiz dorsal permite determinar su movimiento a lo largo de los axones (por ej. del nervio ciático). En autoradiografías se observa que las proteínas se transportan a distintas velocidades en los axones: transporte rápido (bandas rojas); transporte intermedio (en celeste) y lento (en gris) transporte axonal anterógrado desde el soma al terminal axonal transporte axonal retrógrado desde el terminal al soma - transporte rápido: vesículas, 250 mm/día - transporte lento: citoesqueleto, <1 mm/d - intermedio: mitocondrias

17 Análisis por videomicroscopía revela el transporte bi-direccional y saltatorio de las vesículas El transporte axonal ha sido visualizado en extractos de axon gigante de calamar incubados en presencia de ATP. En el panel de la izquierda se muestra una serie de imágenes adquiridas a distintos tiempos por una cámara de video acoplada a un microscopio óptico. Las flechas negra y amarilla señalan vesículas moviéndose en dirección opuesta sobre los MTs. (B): Una región similar a (A) fue procesada para microscopía electrónica. Se observan 2 vesículas unidas a un MT A B videos disponibles

18 En los melanóforos, los microtúbulos son requeridos para la redistribución de vesículas con pigmentos El movimiento de los gránulos de pigmento sobre los MTs es regulado por señales extracelulares. movimiento centrífugo dependiente de kinesinas movimiento centrípeto dependiente de dineínas killifish melanóforos Hong & Laverty, Proc Assoc Biol Lab 2011

19 El sistema de microtúbulos es fundamental para mantener la organización estructural y funcional del sistema secretor Diferentes combinaciones de proteínas motoras especifican el movimiento de organelas y vesículas Colocalización MTs (rojo) y ER (verde). Waterman-Storer & Salmon Curr Biol 1998

20 Los microtúbulos contribuyen al posicionamiento de organelas ER Golgi MTOC MTs núcleo MT ER Golgi En células tratadas con colchicina el ER colapsa alrededor del núcleo y el aparato de Golgi se fragmenta. Cuando se remueve la colchicina, los microtúbulos se reensamblan y las proteína motoras transportan las organelas a sus posiciones originales.

21 Las dineínas y kinesinas son moléculas motoras que emplean energía de la hidrólisis de ATP para translocarse sobre microtúbulos Class Members Cargo Direction of Movement * Cytosolic kinesins Kinesin, Unc-104 Cytosolic vesicles (+) Spindle kinesins Ncd/KAR3, BimC/Eg5, CENP-E Spindle and astral MTs, centrosomes, kinetochores Cytosolic dyneins Cytoplasmic dynein Cytosolic vesicles, kinetochores during mitosis and meiosis Axonemal dyneins Outer-arm dyneins, inner-arm dyneins A tubule of doublet microtubules in cilia and flagella (+) or ( ) ( ) ( ) * Movement of motor protein toward the (+) end or ( ) end of microtubules. Also known as kinesin related proteins (KRPs). Outer-arm dyneins have three heavy chains, and inner-arm dyneins have two heavy chains. Lodish et al MCB 2000

22 Las dineínas forman complejos multimoleculares que transportan diversos cargos hacia los extremos (-) de los microtúbulos Las dineínas son proteínas multiméricas compuestas de 2-3 cadenas pesadas y varias subunidades intermedias y livianas. Las subunidades pesadas son ATPasas que interaccionan con el microtúbulo. Las cadenas livianas interaccionan con un complejo multiproteico denominado dinactina que se asocia al cargo. cabezas globulares de las cadenas pesadas microscopía electrónica."freeze-etch" Las dineínas citosólicas son responsables del transporte axonal retrógrado, transporte de vesículas endocíticas hacia lisosomas, posicionamiento perinuclear del Golgi, elongación y posicionamiento del huso mitótico, movimiento de cromosomas, movimiento radial centrípeto de pigmentos en melanóforos, etc. La velocidad de transporte varía entre 1-2 mm/seg. Las numerosas subunidades que componen al complejo dineína-dinactina explicaría la amplia diversidad de cargos transportados por las dineínas.

23 El movimiento de dinéna está acoplado a la hidrólisis de ATP Ciclo mecánico de dineína (1) Se libera el ADP. El anillo AAA+ sufre un cambio conformacional, pero el motor queda unido al MT. (2) Con la unión de ATP dineína se suelta del microtúbulo y el linker se mueve a la posición previa al golpe de propulsión. (3) El motor vuelve a unirse al microtúbulo y el linker da el golpe de propulsión que produce la fuerza que lo retorna a su posición original. Las dineínas interaccionan con su cargo a través de la cola en el N-t de la cadena pesada. El dominio linker se extiende a lo largo del anillo que forman los 6 dominios AAA+ (ATPases Associated with diverse cellular Activities). El linker es el elemento móvil que produce fuerza cambiando de posición en respuesta a la unión de ATP al sitio AAA1. El tallo contien el dominio de unión a microtúbulos. Carter (2013) JCS

24 Los dominios motores de dineína se mueven de manera procesiva dando pasos alternados y no alternados Carter (2013) JCS (1) En el dímero de dineína los dos dominios motores están unidos al microtúbulo en la conformación posterior al golpe de propulsión. (2) El dominio motor azul se mueve hacia el extremo (-) adelantándose al dominio amarillo. Cuando en el siguiente ciclo vuelve a moverse el motor azul es tan probable que se adelante como que retroceda. (3) Luego de un ciclo (no alternado) en el que el dominio motor azul dio un paso hacia el extremo (-), es más probable que el dominio motor amarillo que está retrasado de un paso hacia el extremo (-).

25 Las kinesinas constituyen una superfamilia de proteínas diversas que transportan cargos sobre microtúbulos La mayoría de las kinesinas están compuestas de cadenas pesadas y livianas. El dominio motor de las kinesinas se encuentra en las cadenas pesadas. De acuerdo a la posición del dominio motor las kinesinas se clasifican en kinesinas-n (con el dominio motor en el terminal amino); kinesinas-c (en el terminal carboxilo) y kinesinas-m (en una posición interna). KIN-N y KIN-M se translocan hacia el extremo (+) de los MTs y las KIN- C hacia el extremo (-). Desde un punto de vista funcional las kinesinas se clasifican en citosólicas y mitóticas. microscopía electrónica. "freeze-etch" KIN-N KIN-M KIN-C De las 45 kinesinas descriptas, tres pertenecen a las KIN-C; tres a las KIN- M y el resto a las KIN-N.

26 Estructura de las kinesinas convencionales La kinesina I o convencional consiste en dos cadenas pesadas, cada una de las cuales se asocia a una cadena liviana. El dominio globular (cabeza) de las cadenas pesadas une ATP e interaccionan con la tubulina en el microtúbulo. Mediante una region flexible (cuello) las cabezas se conectan a un dominio coiled coil o tallo. El cuello flexible acopla los ciclos de hidrólisis de ATP con cambios conformacionales que se trasladan al tallo. Las cadenas livianas se asocian al extremo del tallo y contribuyen a las interacciones con el cargo. Lodish et al MCB2004 Las kinesinas I son responsables del transporte axonal anterógrado, el transporte de vesículas secretoras hacia la membrana plasmática y el movimiento radial centrífugo de gránulos con pigmentos en melanóforos.

27 El transporte mediado por kinesinas puede ser visualizado en ensayos in vitro El movimiento direccional mediado por kinesinas ha sido estudiado fijando microtúbulos (a) o kinesinas (b) a cubreobjetos. El movimiento de esferas cubiertas con kinesinas (a) o microtúbulos (b) requiere de la presencia de ATP en el buffer de incubación. las vesículas siempre se mueven hacia el extremo (+) MT pegado al cubreobjeto kinesinas pegadas al cubreobjeto

28 Las vesículas pueden translocarse en direcciones opuestas sobre el mismo microtúbulo Hancock 2014 Nat Rev Mol Cell Biol

29 Paradoja de la co-dependencia entre motores antagonistas Experimentos de pérdida de función revelan la co-dependencia entre motores antagonistas. El transporte bidireccional de vesículas (PrP, lipid droplets), mitocondrias y gránulos requiere de la actividad de kinesinas y dineínas. La inhibición de un motor también inhibe la actividad del motor que se mueve en dirección opuesta. Quimografos del transporte anterógrado y retrógrado de vesículas de PrP celular fusionada a YFP en neuronas: (a) knock out para la cadena liviana de kinesina 1 (KLC1) y knock down para KLC2, o (b) knock down para la subunidad p150 de la proteína adaptadora de dineína dinactina

30 El AMPc regula diferencialmente la actividad de motores asociados a la superficie de gránulos de pigmento La dispersión de melanóforos correlaciona con altos niveles de AMPc, activación de kinesina y miosina V para eventos de transporte coordinado que resulta en la distribución uniforme de gránulos de pigmento en el citoplasma. La agregación de melanóforos correlaciona con disminución en los niveles de AMPc y activación de dineínas que resulta en la agregación en el centro de la célula. Modelo para la activación del transporte dirigido a los extremo (-) de microtúbulos Kashina & Rodinov (2005) TiCB

31 Modelo del movimiento de kinesina sobre microtúbulo Las cabezas motoras (en azul) interaccionan con la beta tubulina de dímeros sucesivos (1 y 2) de un protofilamento. La unión del ATP a la cabeza delantera (2) aumenta la afinidad por la tubulina e induce un movimiento del cuello hacia el extremo (+) (en rojo) que tracciona la cabeza trasera (1) hacia el extremo (+) del microtúbulo (línea de puntos). La cabeza trasera unida a ADP da un paso total de ~16 nm (desde la subunidad 1 a la 3). El avance neto del cargo unido al extremo del tallo es de ~ 8 nm. La interacción de la cabeza translocada unida a ADP con la tubulina b induce la liberación del ADP. La cabeza trasera hidroliza el ATP pero no libera el Pi. La hidrólisis disminuye la afinidad por la tubulina. La liberación del Pi de la cabeza trasera debilita aun más la unión al microtúbulo y adopta la conformación apropiada para dar un nuevo paso cuando la cabeza delantera intercambia el ADP por ATP. Vale & Milligan, Science

32 Comparación de los ciclos mecano-químicos de kinesina y miosina Vale & Milligan, Science 2000 Miosina ejecuta un paso y se disocia del filamento. En contraste, kinesina es un motor altamente procesivo y ejecuta varios cientos de pasos antes de disociarse del microtúbulo.

33 El elemento mecánico de kinesina 14 sufre un golpe de propulsión hacia el extremo (-) kinesin 1 kinesin 14 (Ncd) Kinesina 1 se mueve hacia el extemo (+) de microtúbulos porque el linker en el cuello apunta hacia adelante en el motor más retrasado (naranja) y hacia atrás en el que va adelante (rojo). Cuando el linker del dominio motor más adelantado encastra (amarillo), empuja al otro dominio motor hacia adelante. En cambio, la unión de ATP hace que el elemento mecánico de Ncd rote hacia el extremo (-) (amarillo). Luego el motor se libera y vuelve a la posición previa al golpe de propulsión y el ciclo comienza de nuevo.

34 El huso mitótico separa las cromátids durante la anafase El huso mitótico es un arreglo bipolar de microtúbulos. Los extremos (+) de los microtúbulos se proyectan hacia afuera de los polos del huso, mientras que los extremos (-) quedan anclados en los polos. En el ecuador del huso mitótico se superponen los extremos (+) de los microtúbulos interpolares. Los microtúbulos del cinetocoro conectan los polos del huso con los cinetocoros de las cromátides hermanas. Los microtúbulos astrales conectan los polos con la actina cortical.

35 La función del huso mitótico depende de proteínas motoras asociadas a microtúbulos Kinesina 5 interacciona con dos filamentos antiparalelos y su movimiento hacia los extremos (+) resulta en la separación de los polos. La kinesina 14 tiene un solo dominio motor que se mueve hacia el extremo (-). Al interaccionar con microtúbulos interpolares antiparalelos tiende a acercar los polos. Las kinesisnas 4 y 10 se asocian a los brazos de los cromosomas alejándolos de los polos. Las dineínas conectan el extremo (+) de microtúbulos astrales con la actina cortical. El movimiento de dineína hacia el extremo (-) tira de los polos hacia la actina cortical.

36 - Son polímeros no polares extremadamente estables - Los monómeros son proteínas fibrosas ricas en alfa hélice - Los monómeros no unen nucleótidos - El ensamblaje no requiere de hidrólisis de nucleótidos - No participan en motilidad celular ni se conocen motores asociados a IFs - Proveen resistencia al estrés mecánico

37 Los filamentos intermedios se forman a partir de una familia de subunidades Lodish et al MCB 2016

38 Todas las subunidades de los filamentos intermedios comparten un dominio rígido rico en alfa hélice, y difieren en las regiones amino y carboxilo El dominio central conservado posee repeticiones de 7 aminoácidos hidrofóbicos (héptadas) involucradas en la formación de estructuras coiled-coil (super hélices) entre monómeros.

39 Los filamentos intermedios son polímeros no polares que se ensamblan por interacciones laterales de dímeros y tetrámeros monómero 2 monómeros se asocian por sus a-hélice y forman un dímero coiled coil 2 dímeros se asocian lateralmente en orientación antiparalela. Tetrámero 2 tetrámeros se asocian lateralmente y forman octámeros. 4 octámeros se asocian lateralmente y forman el filamento.

40 Las células epiteliales poseen filamentos de la proteína queratina

41 Los filamentos de queratinas se anclan en desmosomas y hemidesmosomas estabilizando la estructura del epitelio

42 Los desmosomas son áreas especializadas de contacto célula-célula Los desmosomas se asocian en su lado citosólico a proteínas adaptadoras de la familia de las plaquinas que anclan los filamentos intermedios de queratina. Proteínas transmembrana relacionadas con las cadherinas median el contacto entre células adyacentes

43 Los hemidesmosomas son sitios de anclaje de la célula a la matriz Un tipo particular de integrina media el anclaje de la célula a laminina en la lámina basal y a filamentos intermedios de queratina a tavés de proteínas adaptadoras

44 Mutaciones en la queratina desestabilizan la estructura de la epidermis Sección normal de piel Sección de piel de ratón mutante en un gen de queratina epidermis Esquema de epitelio mutante. La flecha indica la ruptura de las células debido a la fragilidad de los filamentos de queratina

45 Filamentos de la proteína desmina estabilizan la estructura de los sarcómeros en las células musculares Skelemina y sinemina alinean los filamentos de desmina con las miofibrillas. Ankirina y paranemina anclan los filamentos de desmina a la membrana plasmática. desmin Risebro 2009 Developemnet

46 Los neurofilamentos (NFs) son esenciales para la estructura del axon Tres tipos de proteínas de neurofilamentos (NF-L, NF-M y NF-H) se ensamblan para formar heteropolímeros. Los NFs axonales estan áltamente interconectados por puentes de NF-H N-t α-helical rod domain C-t Alteraciones en proteínas de neurofilamentos en neuronas motoras estan asociadas a la enfermedad neurodegenerativa amyotrophic lateral sclerosis (ALS).

47 Los filamentos de laminas estabilizan la envoltura nuclear Hay tres tipos de laminas: A, B y C. Las laminas son fosforiladas por Cdks-M al comienzo de la mitosis provocando el desensamble de los filamentos y el desarmado de la red.

48 Los filamentos intermedios se asocian con microtúbulos mediante proteínas puente: plectina microscopía electrónica de barrido

49 Materila de Estudio Libros Alberts, Molecular Biology of the Cell Lodish, Molecular Cell Biology Artículos Thomas D. Pollard, et al. Actin, a Central Player in Cell Shape and Movement. Science 326, 1208 (2009) Thomas D. Pollard, et al. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell 112, (2003) Ronald D. Vale, et al. The Way Things Move: Looking Under the Hood of Molecular Motor Proteins. Science 288, 88 (2000) Andre P. Carter. Crystal clear insights into how the dynein motor moves. Journal of Cell Science 126, (2013) Hancock. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology (2014) ibioseminars JULIE THERIOT: CELL MOTILITY AND THE CYTOSKELETON Protein Polymers, Crawling Cells and Comet Tails: THOMAS POLLARD: CELL MOTILITY AND CYTOKINESIS I. Mechanism of cell motility 1: II. Mechanism of cell motility 2: RON VALE: MOLECULAR MOTOR PROTEINS Molecular Motor Proteins: