UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA

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2 UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, BIOFARMACIA, INDUSTRIAS Y PRODUCCIÓN FACULTAD DE BIOFARMACIA TEMA: ESTUDIO DEL SISTEMA ABO Y FACTOR Rh Monografía previa a la obtención del Título de Químico Farmaceuta. INVESTIGADORA: Tlgo. Mariela Fernanda Barrera Bravo. DIRECTOR: Q.F. Xavier Santamaría Rubio. CUENCA ECUADOR 2012

3 AGRADECIMIENTO Agradezco infinitamente a Dios y a la Virgen María por colmarme de salud y darme la oportunidad de haber terminado una de mis metas propuestas. Mi agradecimiento a la Universidad Católica de Cuenca en la persona de su Rector el Dr. César Cordero Moscoso, a todo el Personal Docente y Administrativo de la Facultad de Biofarmacia. III

4 DEDICATORIA Dedico con profundo cariño y de manera especial esta monografía a mis padres como principales forjadores de mi educación y porvenir, a mis hermanos, sobrinos y amigos que estuvieron de una u otra manera apoyándome. A mi esposo Well, corrector, crítico y paciente compañero de largas horas de soledad y trabajo. A mi hijo Antonio Alonso, por ser mi estímulo para mi vida. De igual manera dedico este trabajo a mi eterno amigo Edwin Geovanny Patiño Carrión por todos los momentos compartidos y vividos. IV

5 INTRODUCCIÓN Dentro de las amplias ciencias de la Biología y la Química, existen entre una de sus ramificaciones aquella que es indispensable para realizar análisis de la sangre humana: Análisis Clínico o Prueba de Laboratorio. La indagación complementaria solicitada al laboratorio clínico por un médico para confirmar o descartar un diagnóstico se la llama comúnmente análisis clínico o prueba de laboratorio. Forma parte del proceso de atención a la salud que se apoya en el estudio de distintas muestras biológicas mediante su análisis en laboratorio y que brinda un resultado tanto cuantitativo o cualitativo. El resultado de un análisis clínico se interpreta mediante valores de referencia establecidos para cada población y requiere de una interpretación médica. No deben confundirse ambos conceptos ya que hablamos de dos cosas diferentes, por un lado esta la prueba diagnóstica realizada y su resultado, y por el otro, la interpretación que el médico en cuestión dé a esos resultados. Algunos de los aspectos que se emplean para tal explicación son: la especificidad, la sensibilidad, el valor predictivo, la exactitud, precisión y validez, así como la preparación y recogida de la muestra o el rango de referencia. Actualmente en los laboratorios, dominan los analizadores clínicos automatizados, computarizados y especializados en diferentes campos analíticos como: hematología, hemograma, bioquímica clínica, urianálisis, microbiología y genética entre otras. En el Estudio del sistema ABO, se describen los diferentes grupos sanguíneos presentes en la población humana. Existen dos aglutinógenos A y B, que están ligados a los hematíes, y dos aglutininas a y b que se presentan en el suero y siendo capaces de aglutinar a los aglutinógenos respectivos. V

6 Se puede definir los grupos formados de la siguiente manera: El grupo O, no contiene ningún aglutinógeno en sus hematíes y posee en cambio dos aglutininas sérica a y b. Sus hematíes no pueden ser aglutinados por otros sueros, pues se trata del grupo de donadores universales. El grupo A posee el aglutinógeno eritrocítico A y la aglutinina b. El grupo B posee la aglutinina a y el aglutinógeno B. El grupo AB, posee ambos aglutinógenos en sus eritrocitos, pero el suero no posee aglutininas; el suero de estas personas, por consiguiente no aglutinan ninguna sangre humana, por lo cual pueden recibirla indistintamente de cualquier persona, considerados como receptores universales. Posteriormente se descubrieron subgrupos de A dependientes de la existencia de dos tipos de aglutinógeno, dando origen a los subgrupos A 1, A 2, A 1 B y A 2 B. El suero de la mayoría de los individuos del grupo B y del O, contienen variedades de aglutinina a, una de estas denominada a 1, reaccionan sólo con la sangre A 1 y A 1 B, mientras que la otra a (a común) reacciona con todos los subgrupos A 1, A 2, A 1 B y A 2 B. La transfusión de sangre es posible cuando los glóbulos rojos del donador no son aglutinados por el suero del receptor, es decir, que los glóbulos rojos no son portadores de aglutinógenos capaces de ser atacados por las aglutininas homólogas existentes en el suero del receptor. El Estudio del Factor Rh se realizo en 1939, por Levine y Stetson al hacer una transfusión con sangre del grupo O del marido, porque en su segundo embarazó dio a luz un feto muerto de 8 meses con pérdida de abundante sangre, a pesar de que ellos tenían el mismo grupo, se presentó una reacción violenta, que los autores interpretaron que la madre había sido inmunizada por el hijo el cual había recibido un antígeno distinto (Rh) por herencia paterna, y al hacerse la transfusión el anticuerpo materno reaccionó con el antígeno del marido. En 1940, Landsteiner y Wiener, inyectando a cobayos y conejos con sangre de macacusrhesus, observaron que se producía un anticuerpo en el suero de aquellos animales, que no solamente aglutinaban los hematíes del mono, sino además al 85% de la población blanca de Nueva York. Al grupo constituido por el 85% de las personas cuyos hematíes aglutinaban con el suero antimacacus les llamó Rh positivo, y al resto, Rh negativo. VI

7 No tardó en comprobarse que el suero de ciertos individuos que presentaban incompatibilidad transfusional, se comportaba igual que el suero antimacaco. Del factor Rh se han desdoblado una serie de subgrupos, para los cuales pueden existir sensibilizaciones. No obstante el grupo Rh clásico, o sea del gene D, es el que provoca la mayoría de sensibilizaciones y sus consecuencias, aproximadamente el 96% de todo la inmunohematología grupal. Con los valiosos conocimientos recibidos y asimilados en los cuatro años de estudios y prácticas preprofesionales realizadas en las aulas y Laboratorio Clínico de la Unidad Académica de Ingeniería Química, Industrial, de Alimentos, Biomolecular, Biocombustible y Biofarmacia de la Universidad Católica de Cuenca, obtuve la capacidad de realizar el Estudio del sistema ABO y el Estudio del sistema RH, relacionado íntegramente con la sangre humana. Gracias a lo indicado con anterioridad he realizado a continuación un estudio minucioso y al mismo tiempo claro y conciso del sistema ABO y del factor Rh, también he buscado analizar y explicar las técnicas de cómo se deben realizar esta actividad profesional. El capitulo I se encarga de introducirnos al estudio de la determinación de los diferentes tipos sanguíneos he bautizado a este capitulo como Sistema ABO. En el capitulo II lo dedico a explicar los antígenos y anticuerpos que forman el sistema Rh, así como los métodos para la determinación del antígenos D de dicho Sistema, en muestras de sangre de seres humanos. Capitulo III, este lo he dedicado a detallar pormenorizadamente la recolección, preparación, almacenamiento y transporte de componentes sanguíneos, para evitar una posible contaminación de las sangres. El Capitulo IV lo he reservado para puntualizar los diferentes métodos de las pruebas pretranfusiones para la posterior transfusión sanguínea; así como los efectos adversos que puede traer consigo dicha transfusión. VII

8 OBJETIVO GENERAL Realizar el estudio del Sistema ABO y del Factor Rh. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Describir y determinar el sistema ABO. 2. Indicar los métodos de determinación del sistema Rh. 3. Identificar los procesamientos de los componentes sanguíneos. 4. Valorar los efectos adversos a la transfusión sanguínea. VIII

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10 CAPÍTULO I SISTEMA ABO UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 1.1. GENERALIDADES Los primeros pasos en el estudio de los grupos sanguíneos fueron dados por Landois quien en 1875 señalaba que si los glóbulos rojos de una especie eran mezclados con el suero sanguíneo proveniente de otra especie se producía un fenómeno de aglutinación o de hemólisis. El sistema ABO fue descubierto en 1900 por Karl Landsteiner quien primero señalo la aglutinación de los glóbulos rojos humanos por el suero proveniente de otras personas, lo que permite explicar las causas de la incompatibilidad y prevenir sus fatales consecuencias. En 1901, en el Instituto de Patología de Viena, toma 22 muestras de sangre de individuos y analiza el resultado de sus combinaciones. A partir de la presencia o ausencia de antígenos, concluye que hay tres tipos de glóbulos rojos, el A, el B y el O. El grupo A posee el antígeno A y el anticuerpo anti-b. El grupo B, el antígeno B y el anticuerpo anti-a. El grupo O carece de ambos antígenos pero tiene anticuerpos anti-a y anti-b. En 1903, dos colaboradores de Landsteiner, Von Decastello y Adriano Sturly, utilizan los mismos parámetros de clasificación y agregan un cuarto grupo, el grupo AB, que cuenta con los dos antígenos A y B en su membrana que carecían de anticuerpos anti-a y anti-b en su suero. Posteriormente se supo que las células sanguíneas O poseen un antígeno denominado H el cual resulta ser el precursor de los antígenos A y B. (1) Desde entonces sabemos con claridad cuál es la relación adecuada entre donantes y receptores de sangre. En primer lugar, las personas de un mismo grupo son compatibles. En segundo término, el tipo dador no debe incluir antígenos que rechazarían los anticuerpos del receptor. Por lo tanto, el grupo O es considerado dador universal y el grupo AB, receptor universal. (1) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

11 El descubrimiento del sistema ABO fue fundamental en el desarrollo de la transfusión sanguínea, por cuyo impacto en medicina clínica le fue otorgado a Landsteiner el Premio Nobel, treinta años más tarde. Grupo Sanguíneo Antígenos Anticuerpos Genotipo O H anti-a y anti-b 00 A A anti-b AA, AO B B anti-a BB, BO AB A,B Ninguno AB 1.2. ANTÍGENOS DEL SISTEMA ABO El antígeno H es la sustancia (SPH) sobre la cual se acoplan mediante transferasas residuos de azúcares terminales, para así conformar los antígenos del sistema ABO. La sustancia H está compuesta por tres tipos de azúcares: galactosa, N-acetilglucosamina y fucosa. Esta sustancia se encuentra en todos los eritrocitos humanos, excepto en aquellos individuos de fenotipo Oh (Fenotipo Bombay). Los individuos de tipo sanguíneo O, no pueden añadir ningún azúcar, solo tienen la sustancia H, por lo que se encuentra en mayor cantidad que en los grupos A, B y AB. La deficiencia de H se halla con mayor frecuencia en los eritrocitos del grupo sanguíneo AB,que producen pocas cantidades de SPH y en este grupo la sustancia H es utilizada tanto para la formación del antígeno A como el B. Para el momento del nacimiento los antígenos del sistema ABO no están completamente desarrollados y por consiguiente, la reacción de las células fetales con los sueros reactivos puede ser de intensidad menor a la observada en las células adultas. Ello se debe a que la cantidad de antígeno A o B en las células rojas del recién nacido, es sustancialmente menor que el encontrado en las células adultas, aunque los aglutinógenos pueden detectarse en hematíes de embriones de 5 ó 6 semanas. 3

12 En teoría, esta carencia podría ser debida a: Una baja concentración de las transferasas específicas A y B en los precursoreseritroides del recién nacido. La deficiencia de la sustancia precursora de los glóbulos rojos para su conversión en antígenos A y B. Tilley y colaboradores, encontraron en sueros del recién nacido niveles de transferasas ABH iguales o superiores a los hallados en adultos; por consiguiente, si las transferasas son normales, es otra la causa del escaso desarrollo de los antígenos A y B. Romano y colaboradores, sostienen que tal deficiencia es debida, más que a la falta de transferasas específicas, a la carencia del substrato (sustancia H) para su conversión en los antígenos correspondientes. Lo demostraron incubando glóbulos rojos O de adultos y de recién nacidos con uridin-difosfato-galactosa (UDP-galactosa) y suero de grupo B, con lo cual, ambas células se convirtieron en grupo B. La determinación del número de puntos o sitios antigénicos en la membrana demostró, que mientras las células O de adulto habían generado más de antígenos B por glóbulo rojo, las células O del recién nacido sólo habían formado entre a El desarrollo completo de los antígenos del sistema ocurre entre los 2 y 4 años de edad y a partir de ese momento, su expresión o fuerza antigénica permanece constante por el resto de la vida. Los antígenos del sistema ABO están presentes en la membrana del glóbulo rojo en forma de glicolípidos, mientras que dependiendo del estado secretor del individuo (Genes SeSe o Sese) se encuentran en las secreciones acuosas como la saliva, sudor, lágrimas, leche, jugo gástrico, etc. en forma de glicoproteínas.las pruebas para secreciones pueden ayudar a establecer el verdadero tipo ABO en individuos con antígeno eritrocitarios poco desarrollados. Genes Secretores: gen SeSe, gen Sese. Se: Carácter dominante. se: Carácter recesivo. No secretores: gen se. 4

13 Los individuos homocigotos para sese, no secretan antígenos A, B y H, aunque tengan los genes A, B y H SUBGRUPOS DEL ANTÍGENO A Los grupos más comunes de A son el A 1 y el A 2, los cuales comprenden el 99% de todos los subgrupos de A. Puesto que las células A 1 y A 2 reaccionan fuertemente con los antisueros anti-a comerciales su diferencia se hace poniendo a reaccionar las células A con suero humano absorbido anti-a 2 o con la lectina anti-a 1 obtenida de las semillas de la planta Dolichosbiflorus, estos reactivos aglutinan las células A 1 pero no las A 2. Un 80% de las personas que poseen el antígeno A reaccionan con estos reactivos y son clasificadas como A 1 o A 1 B, mientras que el 20% restante no lo hace y son clasificadas como A 2 o A 2 B. No es necesario en la rutina determinar si una persona es A 1 o A 2, a menos que en su suero exista un anticuerpo con especificidad anti-a 1 que esté causando una discrepancia en la interpretación del grupo inverso, o que se presente incompatibilidad en la prueba cruzada. Hasta un 8% de las personas A y 35% de las A 2 B pueden desarrollar anti-a 1. Generalmente este anticuerpo es natural, pues con frecuencia se encuentra en personas sin antecedentes transfusionales o de embarazos y se considera que no tiene importancia clínica a menos que reacciones a 37 C. La categorización de los subgrupos de A se basa en los siguientes criterios: Grado de aglutinación de los hematíes con los antisueros anti-a, anti-ab y la lectina anti-a 1. Aglutinación con la lectina anti-h. Presencia o ausencia de anti-a 1 en el suero. Secreción de sustancia A y H en la saliva de las personas secretoras. 5

14 SUBGRUPOS DEL ANTÍGENO B Los subgrupos de B son aun más raros que los de A. No se conoce un grupo B análogo al A 2, pero en cambio se han descrito varios tipos de B que no reaccionan o lo hacen muy débilmente con el antisuero anti-b. Salmon ha sugerido que la terminología empleada para los subgrupos de B debería ser paralela a la de los subgrupos de A y propuso que los términos B 3, B x y B el deberían ser empleados en la siguiente forma: B 3 muestra un factor de aglutinación de campo mixto, conteniendo sustancia B la saliva de los secretores; B x muestra un patrón de aglutinación muy débil y en la saliva se encuentra la sustancia B, que inhibe la actividad de anti-b, el subgrupo B el, no es aglutinado por anti-b, el cual puede subsecuentemente ser eluido. La saliva contiene sustancia H pero no contiene A. En general, los estudios para la diferenciación de los subgrupos de B son similares a los empleados con los subgrupos de A.(2) 1.3. ANTICUERPOS DEL SISTEMA ABO Los anticuerpos del sistema ABO se reconocen como anticuerpos naturales, aunque estos se producen rápidamente después del nacimiento por exposición, tras la ingestión o inhalación de sustancias antigénicas presentes en los polisacáridos bacterianos, en los alimentos y en el polen. Comúnmente los individuos poseen los anticuerpos anti-a o anti-b que están ausentes de sus eritrocitos. Esto permite determinar el grupo ABO del individuo por la detección de estos en el suero. En los recién nacidos estos anticuerpos están ausentes y se ha observado que su síntesis comienza entre los 3 y 6 meses de edad, se incrementan en su concentración entre los 5 y los 10 años de edad y declinan en edades muy avanzadas. (2) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

15 Los anticuerpos de este sistema incluyen los anti-a, anti-b y anti-ab. Este último es producido por las personas de grupo O y reacciona con estructuras comunes a los antígenos A y B, por lo que no pueden separarse las actividades anti-a de las anti-b. Los anticuerpos naturales anti-a y anti-b son predominantemente de la clase IgM, aunque pueden detectarse pequeñas concentraciones de IgG. Los anticuerpos anti-ab son generalmente de la clase IgG; por este motivo los recién nacidos de madres de grupo O tienen más riesgos de padecer la enfermedad hemolítica por incompatibilidad ABO que aquellos de madres de grupos A o B. El hecho que los recién nacidos no tengan estos anticuerpos sugiere que debe existir un estímulo persistente en el medio ambiente que induce su producción. En efecto en bacterias ubicuas en el medio ambiente se han encontrado sustancias químicamente similares a los antígenos A, B y H, constituyéndose en el estímulo que inicia la producción de los anticuerpos del sistema que generalmente son de la clase de inmunoglobulina M. (3) En las personas de grupo sanguíneo O, aparte de la anti-a y el anti-b se encuentra otro anticuerpo denominado anti-ab que se caracteriza porque su actividad anti-a y anti-b no puede ser separada mediante pruebas de absorción. A este anticuerpo Wiener lo ha llamado anti-c y reacciona con una estructura común a los determinantes antigénicos de A y B. La importancia de este anticuerpo radica en su utilidad para evidenciar subgrupos débiles de A y B. El anticuerpo anti-h se lo ha encontrado en personas A 2 (1-2%) y A 2 B (25%), es generalmente un anticuerpo frío que carece de importancia clínica. Por su parte el anti-h que se produce en los individuos Bombay sí tiene importancia clínica, siendo un anticuerpo que reacciona a 37 C causando destrucción de los eritrocitos in-vivo. Los anticuerpos mencionados se encuentran también presentes en algunos líquidos orgánicos como la leche, líquido ascítico, saliva, lágrimas, y menos frecuentemente en secreciones cervicales. (3) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

16 1.4. REACCIÓN ANTÍGENO ANTICUERPO La reacción entre el antígeno y su correspondiente anticuerpo puede producirse in vivo o in vitro. La reacción in vivo generalmente coincide con la invasión del organismo por antígenos extraños contra los que reacciona por intermedio de los anticuerpos, como sucede en la reacción hemolítica transfusional; o mediante la transferencia pasiva de anticuerpos como es el caso de la enfermedad hemolítica del recién nacido. En estados de autoinmunidad, la reacción in vivo puede causar enfermedades tales como la anemia hemolítica autoinmune, la púrpura trombocitopénica autoinmune, la neutropenia inmune, etc.(4) La reacción in vitro tiene particular importancia porque ella permite que tanto los antígenos como los anticuerpos puedan ser determinados y estudiados. La mayoría de las reacciones antígeno anticuerpo ocurren en dos fases o etapas: en la primera, el antígeno se combina con el anticuerpo y en la segunda, posiblemente a través de cambios electroquímicos y de atracción entre fuerzas moleculares con cargas eléctricas positivas y negativas, se producen complejos antígeno anticuerpo. Las fases generalmente se sobreponen en tiempo, pero en la medida en que se forman los complejos antígeno anticuerpo, la reacción se hace visible. En la formación de estos complejos intervienen ciertas condiciones de reacción inherentes al tipo de antígeno y del anticuerpo envueltos, pero en particular, es importante el tamaño del antígeno. Los anticuerpos son inmunoglobulinas y por lo tanto, son solubles; su tamaño molecular, por consiguiente, es de menor importancia en este sentido. Los antígenos pueden ser relativamente pequeños o grandes o aun más importante, ser parte de una estructura colosal como los eritrocitos, leucocitos, células tisulares o bacterias. Por esta razón, el tamaño del antígeno es de importancia capital en la determinación de la naturaleza física del complejo antígeno anticuerpo. (4) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

17 Una vez combinados el antígeno con su correspondiente anticuerpo, deben permanecer unidos. Se ha señalado que esta unión no depende de la formación de enlaces covalentes entre ellos. Pero en cambio, la naturaleza complementaria de las correspondientes estructuras en el antígeno y en el anticuerpo, facilitan que el determinante antigénico entre en estrecho contacto con el sitio de combinación del anticuerpo. Esta combinación es mantenida mediante uniones intermoleculares débiles y se piensa que sean grupos iónicos con cargas eléctricas diferentes, átomos de hidrógeno, uniones hidrofóbicas, etc., es decir, que probablemente varios factores intervienen para mantener unido el complejo antígeno anticuerpo formado TIPOS DE REACCIONES Las siguientes reacciones in vitro han sido aplicadas para demostrar la reacción antígeno anticuerpo en el campo de la transfusión sanguínea: Aglutinación. Hemólisis. Inhibición. Absorción. Precipitación. Fijación de complemento. Radioinmunoensayo. Fluorescencia. Enzima inmunoensayo. La aglutinación y la hemólisis son las técnicas más frecuentes usadas en la serología de los grupos sanguíneos. La aglutinación se produce por la actuación de los anticuerpos (Acs) del suero o aglutininas sobre los antígenos (Ags) de los glóbulos rojos o aglutinógenos.cuando un antígeno particular reacciona con su anticuerpo específico se observa la formación de grumos o agregados de estas partículas, esto se conoce como aglutinación. En estas reacciones el determinante antigénico está sobre la superficie de una partícula o de una célula. 9

18 La hemólisis es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o hematíes), producida por la liberación de la hemoglobina contenida en el eritrocito a consecuencia de una alteración de la pared del glóbulo o cuando el glóbulo está distendido por la acción de una solución hipotónica (hemólisis osmótica), éste pasa por un estado de turgencia (se hincha por el exceso de líquido) y luego esta célula estalla debido a la presión. Esto genera una menor cantidad de células que transporten oxígeno al cuerpo entre otros elementos como los anticuerpos. En determinadas situaciones patológicas hay un aumento de la destrucción de los eritrocitos intra o extravascular, como consecuencia de unión antígeno-anticuerpo (reacción transfusional, eritroblastosis fetal). La inhibición y la absorción/elución, aun cuando no son técnicas de uso frecuente en la rutina del banco de sangre, si son regularmente usadas en los laboratorios de referencia para la identificación de anticuerpos y en los laboratorios forenses para la caracterización de material sanguíneo y otros fluidos orgánicos. La absorción es la separación de un anticuerpo en un suero, mediante su fijación a un antígeno presente en la membrana de eritrocitos o de otras partículas. La elución es la técnica usada para disociar o separar el anticuerpo unido al antígeno eritrocitario. La precipitación, fijación de complemento y radioinmunoensayo son usados ampliamente en los bancos de sangre para la detección de antígenos de la hepatitis viral y en el estudio de otras enfermedades. La fluorescencia se ha empleado para demostrar la presencia de antígenos de grupos sanguíneos en tejidos y de inmunoglobulinas en células y otros componentes tisulares. Recientemente, las técnicas de enzima inmunoensayo se han aplicado en el campo de la inmunohematología DETERMINACIÓN DEL SISTEMA ABO Comprende dos partes: a) Una prueba celular para determinar los antígenos. b) Una pruebas sérica, para la determinación de los anticuerpos. 10

19 Las dos pruebas se practican simultáneamente porque ellas se complementan y en esta forma una verifica los resultados de la otra. Deben realizarse a temperatura ambiente (20 a 2 C) o menos; la incubación a 37 C debilita la reacción. En aquellos casos en que haya discrepancias entre ambas pruebas, la investigación adicional revelará una condición que podrá ser de importancia clínica o simplemente interesante desde el punto de vista serológico. Los reactivos comerciales empleados en la clasificación de los antígenos, son antisueros usualmente provenientes de individuos que han sido estimulados con sustancias de grupo sanguíneo A y B para producir anticuerpos de altos títulos. Debido a ello, las células pueden ser aglutinadas directamente, sin centrifugación. Los antígenos celulares son genéticamente determinados, por lo tanto, bajo condiciones normales, los resultados son definitivos. La clasificación del suero con hematíes A 1 y B conocidos, se denomina prueba inversa o sérica. No se debe practicar en lámina, porque generalmente la concentración de los anticuerpos no es lo suficientemente alta para causar la aglutinación de los glóbulos rojos sin centrifugar. Los resultados de la prueba sérica pueden variar ocasionalmente, por modificaciones ambientales o enfermedades DETERMINACIÓN DE LOS ANTIGENOS ABO EN LA SUPERFICIE DE LOS HEMATÍES O GRUPO HEMÁTICO La determinación de los antígenos ABO se basa en la aglutinación directa de los hematíes con antisueros específicos anti-a, anti-b y anti-ab MÉTODO POR MEDIO DE ANTISUEROS PRINCIPIO DEL MÉTODO Los eritrocitos se ensayan con tres antisueros: Suero anti A. Suero anti B. Suero anti AB. 11

20 Antes de usar los antisueros ver las instrucciones del fabricante. Después de abrir el frasco guardar en el frigorífico a +4 C. Conservar los frascos cerrados herméticamente y procurar tenerlos el menor tiempo posible a la temperatura ambiente. Los sueros contaminados son turbios y blanquecinos. Examinar una gota en el microscopio, usando el objetivo x40. Si se observa bacterias desechar el suero. El estudio se puede efectuar: En portaobjetos o lámina. En Tubo de ensayo (particularmente en los casos dudosos) MÉTODO DEL PORTAOBJETOS Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Pipetas de transferencia. Vasos para análisis. Una centrífuga. Un lápiz graso. Palillos o aplicadores desechables. Portaobjetos. Solución salina fisiológica 0.9%: Se coloca 8.5g de NaCl en un balón de aforo de 1000ml y se mezcla con un poco de agua destilada. Ahora enrasar con agua destilada. Para mayor precisión en el enrase, una vez cerca de la línea, se termina echando gota a gota el agua destilada hasta la línea de enrase. Mezclar y etiquetar la disolución. Antisueros: anti A, anti B y anti AB (consérvense según las instrucciones del fabricante. Si hay turbidez en un antisuero es probable que se encuentre contaminado por bacterias; no se deberá usar. Los frascos que se hayan abierto se deberán conservar en el frigorífico a 4 C). 12

21 Sangre venosa recogida con anticoagulante:centrifugar durante 5 minutos a alta velocidad. Aspirar el plasma con una pipeta de Pasteur. Este plasma se debe conservar para clasificar grupos sanguíneos por medio de glóbulos rojos conocidos. Sangre venosa coagulada:dejar coagular la sangre de 5-10ml (para lograr una coagulación rápida colocar un aplicador en el tubo que contiene la sangre, durante minutos a 37 C). Centrifugar durante 5 minutos a alta velocidad. Aspirar el suero con una pipeta Pasteur. Conservar el suero para hacer clasificaciones de grupos sanguíneoss por medio de glóbulos rojos conocidos Ejecución del Ensayo A) Lavado y preparación de suspensiones de glóbulos rojos al 10%: Centrifugar la muestra para separar el suero o plasma de los glóbulos rojos. Pasar el suero o plasma a otro tubo limpio rotulado. Con una pipeta de Pasteur, colocar ml de glóbulos rojos en cada tubo. Completar con solución salina hasta 1cm del borde. Centrifugar durante 1-2 minutos para sedimentar las células. Extraer la solución salina. Agitar el tubo para resuspender los glóbulos rojos. Repetir los pasos 3-6 tantas veces como sea necesario hasta obtener un sobrenadante limpio (color sandia), sin signos de hemólisis. Una vez realizado el lavado, se realiza una suspensión de hematíes, en dado caso en el que se tenga que hacer en otra cantidad se realiza una regla de tres simple. Ejemplo: B) Enumerar 3 portaobjetos: N 1, N 2 y N 3. 13

22 C) Depositar: Portaobjetos N 1 Portaobjetos N 2 Portaobjetos N 3 Suero anti 1 gota suero anti A 1 gota suero anti B 1 gota suero anti AB Suspensión de Glóbulos Rojos 10% 1 gota 1 gota 1 gota D) Mezclar la preparación de cada portaobjetos con un aplicador, utilizar un aplicador nuevo en cada portaobjetos. No pasar residuos de la mezcla de un portaobjetos al siguiente. E) Hacer oscilar el portaobjetos hacia adelante y hacia atrás para terminar de hacer la mezcla. Se debe examinar antes de que transcurran 2 minutos, vigilando que no ocurra una evaporación que causaría una aglutinación falsa Interpretación de los Resultados Aglutinación Positiva.- Se forman pequeños conglomerados de glóbulos rojos, que flotan en un líquido claro. Reacción Negativa.- Los glóbulos rojos no se aglutinan MÉTODO DEL TUBO DE ENSAYO Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de ensayo de 75 x12mm. Pipetas de transferencia. Una centrífuga. Un lápiz graso. Una gradilla para tubos. Un espejo cóncavo para microscopio. Solución salina fisiológica 0.9%. Antisueros: anti A, anti B y anti AB. Sangre fresca del paciente (ver pág. 12). 14

23 Ejecución del Ensayo A. Lavado y preparación de suspensión de glóbulos rojos al 2%. (ver pág. 12). B. Marcar 3 tubos de ensayo con el número correspondiente. C. Depositar: Tubo No.1 Tubo No. 2 Tubo No. 3 Suero anti 1 gota suero anti A 1 gota suero anti B 1 gota suero anti AB Suspensión de Glóbulos Rojos 2% 1 gota 1 gota 1 gota D. Incubar: Sin centrifugar, dejar reposar los tubos durante 1 hora a temperatura ambiente. Con el empleo de la centrífuga (método rápido), dejar reposar los tubos 15 minutos a temperatura ambiente, a continuación centrifugar durante 1 minuto a baja velocidad. E. Sacudir ligeramente el fondo del tubo de ensayo examinar el sedimento de glóbulos rojos. Se puede usar el espejo cóncavo Interpretación de los Resultados Reacción Positiva.- Los glóbulos rojos forman uno o más conglomerados y se observa un líquido sobrenadante claro. Reacción Negativa.- Los glóbulos rojos vuelven a formar una suspensión fácilmente, sin aglutinación visible MÉTODO POR MEDIO DE ERITROCITOS ESTANDARIZADOS PRINCIPIO DEL MÉTODO El suero o plasma cuyo grupo se pretende identificar se ensaya con tres suspensiones de eritrocitos conocidos: 15

24 Eritrocitos del grupo A 1. Eritrocitos del grupo B. Eritrocitos del grupo O. Este ensayo se puede llevar a cabo: En portaobjetos o lámina. En Tubo de ensayo (particularmente en los casos dudosos) MÉTODO DEL PORTAOBJETOS Materiales, Reactivos y Muestra Pipetas de transferencia. Una centrífuga. Un lápiz graso. Tubos de ensayo de 75 x 12mm. Palillos o aplicadores desechables. Muestras frescas de sangre entera: A 1, B y O. Solución salina fisiológica 0.9%. Sangre fresca del paciente (ver pág. 12) Ejecución del Ensayo a) Lavado de loseritrocitos de referencia en tres tubos de ensayo. En cada tubo mezclar: Tubo N 1 Tubo N 2 Tubo N 3 Sangre entera 1ml sangre A 1 1ml sangre B 1ml sangre O (con anticoagulante) Solución salina fisiológica 0.9% 4ml 4ml 4ml O bien, 16

25 Tubo N 1 Tubo N 2 Tubo N 3 Eritrocitos 0.5ml sangre A 1 0.5ml sangre B 0.5ml sangre O sedimentados Solución salina 4.5ml 4.5ml 4.5ml fisiológica 0.9% Centrifugar durante 5 minutos a alta velocidad. Desechar el líquido sobrenadante. Sustituir con el volumen equivalente de solución salina fisiológica 0.9%. Mezclar, centrifugar y desechar de nuevo el líquido sobrenadante. b) Preservación para los eritrocitos lavados, hacer una suspensión del sedimento de eritrocitos en una solución conservadora que puede ser, solución ACD, o solución de cloruro sódico, siempre en las mismas proporciones: 4.5ml de la solución. 0.5ml de glóbulos rojos lavados (sedimento). De esta manera se producirá una suspensión de glóbulos rojos de referencia al 10%, que se puede conservar en el frigorífico a 4 C, en frascos goteros provistos de la etiqueta correspondiente (indique en ella la fecha en que se ha hecho la preparación). Usando este método de preservación, la suspensión puede durar 3 días en la solución de cloruro sódico y 1 semana en ACD. c) Preparar tres portaobjetos marcados con las identificaciones A 1, B y O. Colocar: Portaobjetos A 1 Portaobjetos B Portaobjetos O 1 gota de suspensión al 1 gota de suspensión al 1 gota de suspensión al 10% de eritrocitos A 1 10% de eritrocitos B 10% de eritrocitos O 2 gotas del suero o 2 gotas del suero o 2 gotas del suero o plasma plasma plasma d) Mezclar la preparación de cada portaobjetos utilizando un aplicador. No se haga pasar cantidad alguna de la mezcla hecha en un portaobjetos a la de otro portaobjetos. e) Hacer oscilar el portaobjetos hacia adelante y hacia atrás para terminar la preparación de la mezcla. f) Observar el tamaño de la aglutinación que varía de una persona a otra (dependiendo de la concentración de anticuerpos anti-a o anti-b que haya en el suero). 17

26 Interpretación de los Resultados UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Eritrocitos A 1 Eritrocitos B Eritrocitos O Grupo del Paciente Grupo A Grupo B Grupo AB Grupo O Nota: Comparar estos resultados con los que se obtienen en el ensayo con antisueros. Deberán ser iguales con ambas técnicas. Si no es así repetir los ensayos MÉTODO DEL TUBO DE ENSAYO Materiales, Reactivos y Muestra Pipetas de transferencia. Una centrífuga. Un lápiz graso. Tubos de ensayo de 75 x 12mm. Una gradilla para tubos. Solución salina fisiológica 0.9%. Eritrocitos de referencia A 1, B y O. Sangre fresca del paciente (ver pág. 12) Ejecución del Ensayo a. Lavar y preparar suspensiones al 2% de eritrocitos estandarizados A 1, B y O: A partir de las suspensiones al 10% (ver pág. 16). Mezclar: Tubo A 1 Tubo B Tubo O Solución salina fisiológica 0,9% 2ml 2ml 2ml Suspensiónde eritrocitos al 10% 10 gotas 10 gotas 10 gotas Nota: Las suspensiones al 2% se deben usar durante el mismo día que se han preparado. 18

27 b. Marcar tres tubos de ensayo con las identificaciones A 1, B y O. c. Colocar: Tubo A 1 Tubo B Tubo O 2 gotas del suero o 2 gotas del suero o 2 gotas del suero o plasma plasma a ensayar plasma a ensayar a ensayar 1 gota de la suspensión 1 gota de la suspensión al 1 gota de la suspensión al al 2% de eritrocitos A 1 2% de eritrocitos B 2% de eritrocitos O d. Incubar: Sin centrifugación: Dejar los tubos en reposo una hora a la temperatura ambiente. Uso de la centrífuga (método rápido): Dejar reposar los tubos 15 minutos a la temperatura ambiente. A continuación centrifugar durante 2 minutos a baja velocidad. e. Sacudir el tubo con suavidad, observar si ha ocurrido la aglutinación Interpretación de los Resultados Reacción Positiva: Los eritrocitos forman pequeños conglomerados. Aglutinación Negativa: Los eritrocitos se suspenden nuevamente con facilidad, sin que se forme conglomeración visible COMBINACIÓN DE RESULTADOS ANTISUEROS ERITROCITOS DE REFERENCIA Anti-A Anti-B Anti-AB A 1 B O Grupo A Grupo B Grupo AB Grupo O DETERMINACIÓN DE LOS ANTICUERPOS DEL SISTEMA ABO O GRUPO SÉRICO Los individuos bajo condiciones normales desarrollan anticuerpos anti-a y anti-b cuando los respectivos antígenos están ausentes en sus hematíes. 19

28 La determinación de los anticuerpos anti-a y anti-b del sistema ABO se fundamenta en la capacidad del suero o plasma de la persona (mayor de 6 meses de edad) de aglutinar células de referencia A 1, A 2, B y O.Para determinar los anticuerpos anti-a y anti-b se utilizan células de referencia A 1 y B correspondientemente. Las células A 1 y A 2 ayudan a demostrar anticuerpos anti- A 1 en aquellas personas A 2 o A 2 B. Por su parte las células O se incluyen como un control negativo en la determinación del grupo sérico. Las células sugeridas se obtienen comercialmente. Para retrasar la hemólisis y la contaminación, así como una disminución de la fuerza antigénica de las células, éstas son conservadas con sustancias certificadas por las casas comerciales MÉTODO EN TUBO PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-A Y ANTI-B Principio del Método La reacción que producen los anticuerpos cuando se mezclan dos grupos de sangre no compatibles destruye las células extrañas en un proceso llamado hemólisis. La hemólisis puede causar daños en el hígado e incluso la muerte. Por esta razón es muy importante tener en cuenta el grupo sanguíneo del donante y del paciente antes de hacer una transfusión. Los distintos grupos de sangre, presentan anticuerpos en el plasma sanguíneo. En la mayoría de los casos, los neonatos no poseen anticuerpos en el plasma, ya que estos se producen con el contacto de antígenos similares al A, B y H en los primeros años de vida. El grupo A, tendrá anticuerpos B. El grupo B, tendrá anticuerpos A. El grupo O, tendrá anticuerpos A y B y el grupo AB no poseerá anticuerpos Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Una gradilla para tubos. Pipetas de transferencia. Una centrífuga. Lámpara de lectura. Un lápiz graso. Células de referencia A 1, A 2, B y O. 20

29 Suero o plasma: Las muestras que no van a ser procesadas inmediatamente deben ser refrigeradas entre 2-8 C por un periodo que no excedan las 48 horas. Las muestras que van a ser procesadas después de las 48 horas de colección deben ser congeladas Ejecución del Ensayo A) La prueba debe ser realizada a temperatura de laboratorio (20-25 C). B) Para cada muestra marcar cuatro tubos así: A 1, A 2, B y O. C) Colocar: Tubo A 1 Tubo A 2 Tubo B Tubo O Suero o plasma 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas Células 1 gota de 1 gota de 1 gota de 1 gota de células A 1 células A 2 células B células O D) Mezclar suavemente el contenido de cada tubo. E) Centrifugar a 3.400rpm por segundos. F) Suavemente resuspender el botón de células para observar la presencia o ausencia de aglutinación contra un fondo blanco bien iluminado. G) Anotar los resultados en formatos apropiados después de cada observación. Generalmente la aglutinación es fuerte (3+ ó 4+) Interpretación de los Resultados Suero o plasma analizado con Células A 1 Células A 2 Células B Células O Anticuerpo Presente Grupo Sanguíneo (Fenotipo) Anti-B A 1 o A Anti-A B Anti-A y Anti-B O Ninguno AB Posible Anti-A 1 y Anti-B Posible Anti-A 1 Posible A 2 con anti-a 1 Posible A 2 B con anti-a 1 0 = No aglutinación. + = Aglutinación. 21

30 Nota: La palabra posible indica que deben hacerse pruebas adicionales para comprobar que efectivamente se está ante un anticuerpo anti-a 1 y ante un subgrupo A MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS SUBGRUPOS DE A: A 1 Y A PRINCIPIO DEL MÉTODO La determinación de los subgrupos A 1 y A 2 se basa en la aglutinación de los hematíes por lectinas que reaccionan con las células A 1 y A 1 B, pero no con las A 2. La lectina A 1 es preparada a partir de extractos de las semillas de la planta Dolichosbiflorus. En otras palabras, la lectina A 1 contiene fitoaglutininas que reaccionan de manera similar al anticuerpo anti-a obtenido de humanos.(5) MÉTODO DELPORTAOBJETOS Materiales, Reactivos y Muestra Portaobjetos. Pipetas de transferencia. Palillos o aplicadores desechables. Lámpara de lectura. Un lápiz graso. Reactivo comercial lectina A 1. Solución Salina Fisiológica 0.9% (SSF). Sangre anticoagulada clasificada como A o AB Ejecución del Ensayo A. Marcar un portaobjetos con el número correspondiente. (5) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

31 B. Dispensar una gota de la sangre A o AB a examinar. UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Portaobjetos 1 Sangre A o AB a examinar Lectina A 1 1 gota 1 gotas C. Mezclar con un palillo o aplicador cubriendo un área de 2-4cm de diámetro. D. Rotar suavemente la lámina y examinar la presencia o ausencia de aglutinación contra un fondo blanco bien iluminado. E. Anotar los resultados observados. Generalmente la aglutinación es fuerte (3+ o 4+) y ocurre dentro de 30 segundos después de adicionado el reactivo Interpretación de los Resultados Reacción Positiva: Indica los fenotipos A 1 y A 1 B. Aglutinación Negativa: Indica los fenotipos A 2 y A 2 B MÉTODO DEL TUBO DE ENSAYO Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Una gradilla para tubos. Lámpara de lectura. Una centrífuga. Pipetas de transferencia. Reactivo lectina A 1. Solución Salina Fisiológica 0.9% (SSF). Sangre anticoagulada clasificada como A o AB Ejecución del Ensayo a) Marcar un tubo con la identificación de la muestra. b) Lavar y realizar una suspensión al 2-5% con SSF de los hematíes a analizar (ver pág. 12). 23

32 c) Dispensar: Tubo 1 Suspensión de eritrocitos al 2% Lectina A 1 1 gotas 1 gota d) Mezclar suavemente. e) Centrifugar a 3.400rpm por segundos. f) Resuspender suavemente el botón de células y examinar en una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado la presencia o ausencia de aglutinación. g) Anotar los resultados observados Interpretación de los Resultados Reacción Positiva: Indica los fenotipos A 1 y A 1 B. Aglutinación Negativa: Indica los fenotipos A 2 y A 2 B. 24

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34 CAPÍTULO II SISTEMA Rh UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 2.1. GENERALIDADES El sistema Rh es después del ABO el más importante de los sistemas de grupos sanguíneos, por sus alcances clínicas en la transfusión sanguínea y en la etiopatogenia de la enfermedad hemolítica del recién nacido. En su descubrimiento concurrieron dos hallazgos relevantes. El primero de ellos acaeció en 1939, con la publicación por Levine y Stetson de su histórico trabajo descubrieron cómo una madre que terminaba de dar a luz un feto muerto y macerado, había desarrollado una severa reacción hemolítica por la transfusión de sangre proveniente de su esposo. Ellos encontraron que el suero de la madre aglutinaba los glóbulos rojos de su esposo y además, del 80% de las personas de grupo O con los cuales se cruzó. El antígeno responsable fue demostrado ser independiente de los ya conocidos ABO. En la interpretación de estos hallazgos, postularon que la madre había sido inmunizada, desarrollando anticuerpos contra un antígeno del cual ella carecía pero que estaba presente en los glóbulos rojos del feto, a su vez, heredado del padre. Cuando la paciente fue transfundida con la sangre de su esposo, el anticuerpo reaccionó con dicho antígeno causando la reacción hemolítica.(6) Levine y Stetsonanunciaron este descubrimiento como Un caso raro de aglutinación intra grupo, sin darle nombre al factor sanguíneo que terminaban de descubrir; si ellos le hubiesen asignado un nombre, sería ése y no Rh la denominación de este sistema. Un segundo descubrimiento experimental, se produce en 1940, como resultado de las prácticas en animales, de Landsteiner y Wiener. (6) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

35 Ellos inmunizaron conejos y cobayos con glóbulos rojos de momos Macacusrhesus; obteniendo un suero que aglutinaba los glóbulos rojos de los monos rhesus y del 85% de la población blanca. Las personas cuyas células eran aglutinadas por el nuevo suero anti-rhesus fueron clasificadas como Rh positivo y el restante 15% que no reaccionaban, como Rh negativo. El siguiente paso fue la demostración de Wiener y Peters que el anticuerpo anti-rh, supuestamentees el mismo que había sido elaborado en animales contra los hematíes del momo rhesus, podía ser hallado en el suero de algunas personas quienes habían presentado reacción hemolítica después de haber recibido transfusiones de sangre ABO compatibles. Hasta ese instante todo sugería que el antígeno presente en el glóbulo rojo del Macacusrhesus y el hallado en los humanos era el mismo, por consiguiente, los correspondientes anticuerpos deberían poseer igual especificidad. Posteriores investigaciones demostraron que dichos antígenos eran diferentes; se determinó que la mayoría de los glóbulos rojos humanos contienen el antígeno del rhesus y además, otro diferente pero relacionado con éste. A sugerencia de Levine, se conservó la denominación de factor Rh para el antígeno del humano y se asignó el nombre de LW (Landsteiner-Wiener) al antígeno común al hombre y al mono. Desde entonces, los estudios realizados en el campo del Rh se han efectuado con el suero proveniente de humanos. El descubrimiento del factor Rh ha significado un aporte extraordinario de la inmunohematología a la medicina clínica, porque permitió conocer y prevenir muchas de las reacciones hemolíticas transfusionales. Asimismo, permitió conocer la etiopatogenia y desarrollar la profilaxia de la enfermedad hemolítica del recién nacido ANTÍGENOS DEL SISTEMA Rh El sistema Rh es el grupo sanguíneo más complejo ypolimórfico de la membrana del glóbulo rojo. Está compuestopor más de 49 antígenos definidos por métodosserológicos siendo los más importantes D, C, c, E y e que construyen el tronco fundamental del sistema. Estos antígenos y sus correspondientes anticuerpos, son los responsables del 99% de los problemas clínicos que se presentan en el sistema Rh. 27

36 Estos antígenos pueden presentar alteraciones en suexpresión dando origen a fenotipos débiles y parciales. El Antígeno D El antígeno D es después de los antígenos A y B el más importante en la medicina de transfusión. La presencia del antígeno D está determinada por el gen d que es amorfo por lo que no se ha podido demostrar la existencia de un antígeno d ni un anticuerpo anti-d.(7) Una diferenciaimportante con el sistema ABO es que cuando este antígeno no se halla en la membrana del eritrocito, en el suero o plasma de la persona no aparecen anticuerpos anti-d en forma natural. Para que dichos anticuerpos se formen, el individuo D negativo debe ser expuesto a eritrocitos D positivos por medio de una transfusión de sangre o de un embarazo, que son generalmente de la clase IgG. Actualmente, cuando se hablade Rh positivo o Rh negativo se refiere a la presencia o ausencia del antígeno D en la membrana del glóbulo rojo respectivamente. Se debe tener presente que el antígeno D puede presentar variantes débiles, por ello las células que no muestran aglutinación directa con los antisueros comerciales anti-d no deben ser clasificadas como Rh negativo hasta que se realicen pruebas adicionales para determinar la presencia del antígeno D débilmente expresado. Antígeno D-débil Cuando se necesita de pasos adicionales para demostrar el antígeno D en la membrana del eritrocito, se dice que se estafrente a un D-débil o una variante D u. La expresión débil del antígeno D en la membrana del hematíe puede deberse a dos tipos de situaciones: (7) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

37 En primer lugar, la condición puede ser heredada y es lo que se conoce como D-débil o D u hereditario inicialmente conocido como de bajo grado, el cual es el producto de un gen que codifica la síntesis de un antígeno de expresión débil. La determinación del antígeno en este caso debe hacerse por medio de la prueba de la antiglobulina indirecta (Coombs indirecto). En segundo lugar, la expresión débil del antígeno D puede deberse a una supresión de un gen perfectamente normal, por otro alelo. Por ejemplo, los genes (dce) y (dce) situados en el cromosoma opuesto (posición trans) algunas veces afectan la expresión del antígeno D. Esta forma de D u fue denominada como de alto grado, debido a la reacción débil de aglutinación que presentan las células con algunos tipos de reactivos anti-d. La importancia de la expresión débil del antígeno D en transfusión, radica en la polémica que existe entre diferentes autores sobre la situación del individuo D-débil como receptor de sangre. Algunos autores sostienen que el individuo D-débil debe ser transfundido con sangre Rho (D) negativa, ya que si la causa de esa situación es la ausencia de una o más subunidades del antígeno D, el receptor podría desarrollar anticuerpos contra esas subunidades al ser transfundido con sangre Rho (D) positiva.(8) Sin embargo esta posibilidad no es tan factible como en teoría parece, sin embargo, Argall y colaboradores reportaron en 1953 la presencia de anticuerpos anti-d en un individuo D u positivo. Otros piensan que el individuo D-débil puede ser transfundido con sangre Rho (D) positiva sin riesgo de ser inmunizado y que utilizar sangre Rho (D) negativa en estos pacientes es realizar un mal uso de la escasa existencia de sangre de este tipo. Así mismo, todo donante D-débil debe ser considerado como Rho (D) positivo y la unidad de sangre o sus componentes debe ser transfundida a receptores Rho (D) positivo. (8) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

38 Antígeno D-parcial El antígeno D está constituido por nueve subunidades genéticamente establecidos, si alguna de esas subunidades no se sintetiza, la molécula del antígeno D se expresa débilmente en la membrana del glóbulo rojo. Algunas personas que han perdido parte del complejo antigénico D, pueden desarrollar aloanticuerpos anti-d que no reaccionan con sus propias células. Anteriormente, la pérdida de una parte del complejo antigénico D se le denominó D mosaico o variante D, actualmente es mejor referirse como D-parcial. Los Antígenos C, c, E, e Después del "D" los antígenos C, c, E y e son los de mayor importancia en el Sistema, estos 5 antígenos son los responsables de más del 99% de los problemas clínicos relacionados con dicho sistema; ya que algunos individuos que carecen de la expresión de alguno de ellos, pueden cuando son inmunizados, producir anticuerpos contra el antígeno faltante. Antígenos "C" y "c": El antígeno "C" tiene una frecuencia aproximada del 68% en lapoblación general, frente a una frecuencia del 81% del antígeno "c", esteúltimo es el más inmunógeno luego del D y como tal es causante de riesgo en la Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal (E.N.F.N.). Antígenos "E" y "e": El antígeno "E" tiene una frecuencia del 27% en la población generalmientras que el "e" ronda cercano al 98%. En el comercio existen antisueros específicos para cada uno de estos antígenos, lo que facilita su determinación en la membrana del eritrocito disminuyendo el riesgo de aloinmunización posttransfusional. 30

39 2.3. NOMENCLATURA Tres nomenclaturas diferentes se usan para designar los antígenos del sistema Rh. La importancia de conocerlas es que algunas publicaciones utilizan una u otra o una combinación de ellas. Dos de las tres nomenclaturas surgen de las teorías que explican el control genético de la síntesis de los antígenos del sistema Rh.(9) Teoría de Fisher-Race De acuerdo a la teoría de Fisher-Race, los antígenos Rh son producidos por tres pares de genes alelos, ubicados en tres locus tan íntimamente ligados o unidos en el cromosoma, que ellos nunca se separan y pasan de generación en generación como una unidad o complejo genético. En esta forma, el hijo hereda un complejo genético proveniente del cromosoma paterno y otro complejo del cromosoma materno. Por ejemplo: si el padre es DCe/dce, el hijo podrá heredar el complejo DCeódce pero nunca una combinación tal como dce. Tal combinación sólo podría ocurrir en caso de entrecruzamiento cromosómico y este fenómeno no se ha demostrado que ocurra en el sistema Rh, precisamente debido a la estrecha unión que existe entre los locus. De los tres locus, uno estaría ocupado por los genes alelos D y d. Los múltiples estudios realizados indican que no existe un antígeno d que pudiese ser considerado como el producto del gen d. Un concepto reciente expresa que en este locus existen dos genes, uno de ellos produce el antígeno D pero el otro no lo produce. Además, se sabe de otros genes que podrían ocupar este locus, algunos de ellos serían responsables de la producción de ciertas piezas del mosaico que conforman el antígeno D. En el segundo locus, se encontrarían los alelos C y c, en el tercer locus estarían los genes E y e. Una interpretación más reciente de la teoría original de los tres locus estrechamente ligados, es que los tres grupos de genes que normalmente se comportan como alelomorfos, ocupan tres sublocus dentro de un locus único. (9) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

40 Teoría de Wiener Wiener sostuvo siempre que el modo de heredarse los antígenos del sistema Rh era completamente diferente. El mantuvo la hipótesis que el control genético del sistema era ejercida por un solo gen. La herencia de este gen resultaría en la producción de un aglutinógeno, el cual podría estar compuesto de una variedad infinita de factores; dentro de este concepto, establecía que un aglutinógeno y un factor sanguíneo no son la misma cosa. (10) De acuerdo a esta teoría, un factor es un inmunógeno y puede estimular la producción de un anticuerpo específico con el cual puede reaccionar. Wiener no aceptó la presencia de genes alelos que controlan la producción de factores sanguíneos. En su teoría estipula que algunos genes tales como R 1, R 2 y R 0 determinan la producción de un aglutinógeno, en el cual, el factor Rho está incluido, mientras que los genes r, r, r conducen a la formación de otro aglutinógeno que no incluye el factor Rho como uno de sus miembros. En las teorías nombradas, se observa que cada autor utiliza una terminología diferente para identificar tanto los genes como los antígenos o factores presentes en el glóbulo rojo. Fisher y Raceutilizan la terminología CDE, que refleja el concepto de que cada gen determina la producción de un antígeno y emplea el mismo símbolo para designar tanto el gen como el antígeno correspondiente, aunque cuando se refiere al gen, se escribe en letra cursiva para diferenciarlo. Wiener, por otro lado, introduce la denominación Rh-hr, empleando símbolos diferentes con sobrescritos y subescritos para identificar los genes, los aglutinógenos y los factores sanguíneos, siendo difícil su entendimiento y memorización, porque los símbolos usados tratan de expresar la máxima información. Para el mejor entendimiento de las nomenclaturas de Wiener, Fisher-Race y su conversión mutua, las siguientes equivalencias pueden ayudar en su comprensión. (10) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

41 R = D R 1 = DC R 2 = DE r = d r = dc r = de Los antígenos c y e no tienen representación especial pero forman parte del complejo genético como se expresa a continuación. Ro = Dce R 1 = DCe R 2 = DcE r = dce r = dce r = dce En 1962 Rosenfield y colaboradores proponen una nueva nomenclatura numérica, basada en la presencia o ausencia de los antígenos en el hematíe. Esta nomenclatura no presenta información genética, sino el comportamiento serológico de los hematíes frente a antisueros específicos, dándole igual importancia a los resultados positivos como a los negativos. Para denominar los antígenos se les da un número a cada uno según el orden en que fueron reportados y se utiliza el símbolo Rh: seguido del número para expresar la presencia del antígeno en la membrana del glóbulo rojo. Si el antígeno está ausente se utiliza la misma denominación pero el número va precedido del signo menos (-). Por ejemplo, si los hematíes dan una reacción positiva frente al antisuero anti-rh1 (anti-d), se nombra como Rh:1; por el contrario, si la reacción es negativa indicaría la ausencia del antígeno y se anotaría Rh:-1. Las reacciones débiles tales como las observadas en el D u se anotan como Rh w :1, en donde w (weak) equivale a débil ANTICUERPOS DEL SISTEMA Rh Los anticuerpos que se producen en este sistema, a diferencia del sistema ABO es que casi siempre son el resultado de una isoinmunización bien sea por transfusiones, abortos o embarazos. (11) (11) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

42 Los antígenos que con mayor frecuencia causan inmunización por su alto poder inmunógeno son los antígenos D seguidos por el c y E. Los anticuerpos que se producen son de la clase IgG, que generalmente requieren para su determinación de potenciadores de la reacción antígeno-anticuerpo y normalmente para su detección es necesario realizar la prueba de la antiglobulina humana. Los anticuerpos del sistema Rh, particularmente el anti-c y anti-e suelen presentar una reacción más fuerte con hematíes homocigotos (cc y EE) para el antígeno que con hematíes heterocigotos (Cc y Ee). La importancia de los anticuerpos del sistema Rh se basa en que por ser inmunoglobulinas de tipo G (IgG) provocan reacciones hemolíticas transfusionales severas y fatales así como la enfermedad hemolítica del recién nacido Rh NULO En 1961, Vos y colaboradores y en 1964 Levine y colaboradores informaron el hallazgo de muestras de sangre que carecían de todos los antígenos del sistema Rh en los hematíes. Al realizar estudios en los familiares de uno de los casos, se observó que aunque el individuo había recibido los complejos genómicos de sus padres y que de igual forma podía transmitirlos a sus descendientes, algo impedía que en sus hematíes se expresaran los antígenos del sistema.(12) Para indicar la ausencia de todos los antígenos del sistema Rh se empleo el término Rh nulo. En los individuosrh nulo sus hematíes presentan una vida media menor, lo cual conlleva a diferentes grados de anemia, al observar los hematíes en un extendido periférico, éstos presentan forma de copa (estomatocitos), lo cual pone en evidencia que la ausencia de los antígenos del sistema Rh en el hematíe conduce a defectos de membrana y por consiguiente aladisminución de las células rojas en la circulación. (12) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

43 2.6. DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO D DEL SISTEMA Rh UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA La determinación Rh positivo y Rh negativo hace referencia a la presencia y ausencia correspondientemente del antígeno D del sistema Rh en la membrana del hematíe PRINCIPIO DEL MÉTODO El principio se basa en la aglutinación directa de los hematíes por el anticuerpo específico. La aglutinación de los hematíes ocurre en dos fases, en la primera el anticuerpo se une al antígeno correspondiente en la membrana de la célula (fase de sensibilización); seguidamente en la segunda fase se produce la aglutinación de los hematíes sensibilizados. Cuando el antígeno está bien expresado en las células las dos fases ocurren casi simultáneamente, viéndose la aglutinación macroscópica en pocos segundos. Cuando el antígeno se encuentra débilmente expresado en la célula, la fase de aglutinación no ocurre y para evidencia la reacción antígeno-anticuerpo se necesita recurrir al suero antiglobulina humana MÉTODO EN PORTAOBJETOS PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO D Materiales, Reactivos y Muestra Portaobjetos. Lámpara con temperatura de 37 C. Palillos o aplicadores desechables. Un lápiz graso. Pipetas de transferencia. Antisuero comercial anti-d. Control de reactivo Rh: El reactivo control de Rh, en términos generales, es una mezcla de todos los elementos y aditivos que contiene el antisuero anti-d excepto el anticuerpo mismo. Sangre anticoagulada con EDTA, heparina, ACD, CPD, CPDA-1. Glóbulos rojos lavados y suspendidos en SSF (ver pág. 12). 35

44 Sangre coagulada puede utilizarse siempre y cuando del coágulo logren desprenderse suficientes hematíes, los cuales serán lavados y suspendidos en SSF (ver pág. 12) Ejecución del Ensayo a. Realizar una suspensión de eritrocitos al 35-45% (ver pág. 12). b. Marcar dos láminas portaobjetos así: Una como anti-d y otra como control. c. Encender la lámpara, cuya temperatura deberá ser de 37 C. d. Colocar en el calentador los portaobjetos marcados. e. Dejar calentar los portaobjetos durante 5 minutos. Si no se dispone de un calentador eléctrico los portaobjetos se pueden calentar sobre la llama de una lámpara de alcohol antes de iniciar el ensayo. Probar la temperatura sobre el dorso de la mano; el calor deberá ser soportable. f. Depositar en los portaobjetos: Lámina anti-d Lámina Control Sueroanti-D 1 gota 1 gota Suspensión de eritrocitos 35% 1 gota Control de reactivo Rh 1 gota g. Mezclar individualmente con un palillo o aplicador cubriendo un área de 2-4 cm de diámetro. h. Mover suavemente hacia delante y hacia atrás la lámpara. i. Observar la presencia o ausencia de aglutinaciónen un tiempo no mayor de 2 minutos. j. Anotar los resultados Interpretación de los Resultados Reacción Positiva.- Rh positivo, en el centro y la periferia de la mezcla se observa claramente un gran número de pequeñas aglutinaciones de eritrocitos. Reacción Negativa.-Rh negativo. A toda muestra con resultado negativo se le debe realizar el test para determinar la expresión débil del antígeno D (variante D u ). Se exceptúan las muestras de sangre provenientes de recién nacidos. 36

45 MÉTODO EN TUBO PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO D UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Una gradilla para tubos. Un lápiz graso. Pipetas de transferencia. Bañomaría o incubadora de calor seco a 37 C. Una centrífuga. Antisuero comercial anti-d. Reactivo control de Rh. Preparar una suspensión de eritrocitos al 2% en SSF Ejecución del Ensayo A. Realizar una suspensión al 2% con SSF de los hematíes a analizar (ver pág. 12). B. Marcar dos tubos de 75 x 12mm, uno como anti-d y otro como control Rh. Incluir la identificación de la muestra (nombre o número de registro del paciente o donante). C. En un tubo de ensayo pequeño colocar y mezclar bien: Tubo anti-d Tubo Control Sueroanti-D 1 gota 1 gota Suspensión de eritrocitos 2% 1 gota Control de reactivo Rh 1 gota D. Incubar: Sin centrifugación, se recomienda emplear este método. Colocar el tubo a 37 C en un bañomaría o una incubadora durante 60 minutos. Con el empleo de la centrífuga (método rápido), centrifugar los tubos a 3.400rpm por segundos. E. Observar la presencia o ausencia de aglutinación: Examen macroscópico, contra un fondo blanco bien iluminado.examinar el líquido que se encuentre en el fondo del tubo de ensayo, colocar éste en posición casi horizontal. 37

46 Examen microscópico,en caso de duda, calentar un portaobjetos, aspirar una gota del sedimento de eritrocitos con una pipeta Pasteur y preparar un frotis, observar en el microscopio (empleando el objetivo x 10). F. Anotar los resultados Interpretación de los Resultados Reacción Rh positiva.- Se observan pequeñas aglutinaciones de eritrocitos en un líquido claro. Reacción Rh negativa.- Los eritrocitos permanecen suspendidos y no se observan aglutinaciones. A toda muestra con resultado negativo se le debe realizar el test para determinar la expresión débil del antígeno D (variante D u ). Se exceptúan las muestras de sangre proveniente de recién nacidos DETERMINACIÓN DE LA EXPRESION DÉBIL DEL ANTÍGENO D Algunos hematíes presentan el antígeno D débilmente expresado en su membrana (variante D u ), razón por la cual al reaccionar con los antisueros anti-d en lámina o en tubo no muestran reacciones de aglutinación PRINCIPIO DEL MÉTODO Para demostrar la presencia del antígeno D débilmente expresado, es necesario realizar la prueba de la antiglobulina indirecta. No todos los antisueros anti-d son apropiados para realizar la prueba de variante D u, bien sea por que el fabricante especifique que el reactivo no muestra reacciones confiables con las células D u, o porque el reactivo contenga otros anticuerpos que podrían reaccionar con antígenos eritrocitarios diferentes al D y ser detectados en la fase de antiglobulina.(13) (13) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

47 La prueba variante D u se realiza a todo donante o receptor de sangre que en la prueba en lámina o en tubo arroje un resultado negativo para el antígeno D (Rho). Se excluyen las muestras de recién nacidos Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Una gradilla para tubos. Un lápiz graso. Pipetas de transferencia. Bañomaría o incubador de calor seco a 37 C. Una centrífuga. Lámpara de lectura. Antisuero anti-d. Suero de antiglobulina humana. Reactivo control de Rh. Células sensibilizadas con IgG. Solución salina fisiológica 0.9% SSF. La muestra debe cumplir los mismos requisitos anotados para la determinación del antígeno D por los métodos en lámina y en tubo Ejecución del Ensayo a) Marcar dos tubos de 75 x 12mm así: D u y control. Incluir la identificación de la muestra (nombre o número de registro del donante o receptor). b) Lavar las células a analizar 2-3 veces con SSF y hacer una suspensión al 2-5% (ver pág. 12). c) Dispensar una gota de las células en cada uno de los tubos debidamente identificados. d) Al tubo marcado D u, agregar una gota de anti-d. e) Al tubo marcado control dispensar una gota del reactivo control de Rh. Si se dispone de antisueros anti-d monoclonales de baja concentración proteica no adicione ningún reactivo a este tubo. f) Mezclar e incubar ambos tubos por minutos a 37 C. g) Centrifugar a rpm por segundos. 39

48 h) Resuspender suavemente el botón de células y observar la presencia o ausencia de aglutinación contra un fondo blanco bien iluminado o una lámpara de lectura. Si se observa aglutinación en el tubo marcado D u y no en el control en este pasó, la muestra será clasificada como D+ (Rh positivo) y no necesitará proseguir la prueba hasta la fase de antiglobulina. i) Si no se observó aglutinación en el paso anterior, o las células muestran una aglutinación dudosa, lavar 3-4 veces con abundante SSF teniendo en cuanta en el último lavado de decantar completamente la salina. j) Añadir a cada tubo dos gotas de suero antiglobulina humana. k) Mezclar y centrifugar segundos a rpm. l) Resuspender suavemente el botón de células y observar la presencia o ausencia de aglutinación. Anotar los resultados. Aglutinación en la fase de antiglobulina en el tubo D u indica que los hematíes poseen el antígeno D débilmente expresado (D u positivo), mientras que la no aglutinación indica la usencia del antígeno D y de su variante Du (ver el cuadro). El tubo control no debe presentar aglutinación en este paso. m) Si no se observa aglutinación en el paso anterior, añadir una gota de células sensibilizados con IgG a cada uno de los tubos. Recentrifugar y leer, en este paso se debe observar aglutinación (1-2+) en ambos tubos Interpretación de los Resultados TUBO D u TUBO CONTROL INTERPRETACION Hematíes a analizar con anti-d Hematíes a analizar con reactivo control de Rh 0 0 D u Negativo + 0 D u Positivo + + Prueba no válida 0 = No aglutinación; + = Aglutinación Nota: Los hematíes D u positivo deben ser considerados como Rh positivos, sin embargo es conveniente en el informe resaltar la condición del antígeno D débilmente expresado. Por ejemplo, si un individuo es de grupo sanguíneo A y la prueba en lámina o en tubo para el antígeno D arroja resultados negativos con prueba variante D u positiva, lo más conveniente será informarlo como: A D u positivo (A D u +) o A Rh positivo débil. 40

49 2.8. DIFICULTADES EN LA DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO D UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Estas dificultades que se presentan en la determinación del antígeno D están relacionadas a las reacciones falsas positivas o falsas negativas debidas a diferentes causas. En el sistema Rh no existe una prueba sérica o inversa que compruebe los resultados obtenidos en la prueba directa, de tal suerte que el analista debe prestar especial cuidado en su determinación para no cometer errores. El cuadro muestra las causas de falsos positivos y falsos negativos más comunes en la práctica en lo que tiene que ver con la determinación del antígeno D del sistema Rh. CAUSAS DE RESULTADOS FALSOS POSITIVOS Cantidades anormales altas de proteínas plasmáticas en el suero del individuo que causan agregación espontánea (Rouleaux) de las células. Individuos con anemia hemolítica autoinmune cuyos hematíes están fuertemente sensibilizados con IgG. Esta situación reduce las cargas de superficie de los hematíes favoreciendo su agregación espontánea. MODO DE RESOLVER LA DIFICULTAD Lavar 2-3 veces los hematíes con solución salina fisiológica y realizar la prueba bien sea en lámina o en tubo. Realizar Coombs directo a las células con el fin de comprobar la autosensibilización. Hacer elución del anticuerpo y repetir la prueba con los glóbulos rojos libres del anticuerpo. Individuos con altos títulos de aglutininas frías que ocasionan agregación espontánea de los hematíes. Excesiva velocidad y tiempo de centrifugación cuando se realiza la prueba en tubo. Contaminación bacteriana o química de las muestras o reactivos Lavar 2-3 veces los hematíes con solución salina fisiológica y realizar la prueba en lámina o en tubo. Calibrar las centrífugas serológicas definiendo periódicamente los tiempos de centrifugación óptimos, así como la velocidad de centrifugación. Solicitar muestra recién obtenida del paciente y repetir la prueba. Almacenar adecuadamente los reactivos controlando periódicamente los refrigeradores. Verificar periódicamente que los reactivos no presente turbidez. 41

50 CAUSAS DE RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS MODO DE RESOLVER LA DIFICULTAD Actividad de los reactivos disminuida. Chequear al inicio del día la actividad del anticuerpo con células apropiados D+ y D-. Chequear el reactivo de antiglobulina con células apropiadas (control de Coombs) cuando se realice la variante D u. Almacenar adecuadamente los reactivos. No utilizar reactivos cuya fecha de vencimiento haya expirado. Temperatura inadecuada. Algunos reactivos anti-d necesitan de calor para que la reacción antígeno-anticuerpo sea más evidente. Cuando realice la prueba en lámina, precaliéntelas a C para que la mezcla de células y reactivos alcance rápidamente la temperatura de 37 C. Es aconsejable leer el inserto del reactivo que el fabricante provee. Mala interpretación de los resultados. La reacción de aglutinación de las células D+ con los antisueros anti-d suele ocurrir en los primeros 30 segundos. Sin embargo no se debe reportar un resultado como negativo hasta que hayan transcurrido uno o dos minutos. Este tiempo de lectura lo encontrará especificado en el inserto del reactivo. No adición del suero anti-d o adición de otro Los antisueros anti-d no son coloreados y aunque no antisuero o reactivo. es muy frecuente podría confundirse con otro reactivo de igual apariencia; como la albúmina. Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de

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52 CAPÍTULO III RECOLECCIÓN, PREPARACIÓN,ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE COMPONENTES SANGUÍNEOS 3.1. SELECCIÓN DEL DONANTE DE SANGRE La seguridad de la transfusión de sangre o de sus componentes comienza con la selección apropiada del donante. Uno de los objetivos principales de la transfusión es cuidar que la donación de sangre no perjudique la salud del donante, y reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas tanto como sea posible en el receptor. Para lograr este objetivo, se hace necesario implementar múltiples estrategias que permitan minimizar los riesgos de transmisión de infecciones tales como: Diseñar y desarrollar programas de promoción de la donación voluntaria y repetida de sangre. Implementar mecanismos eficaces de selección del donante. Mermar las transfusiones innecesarias. Minimizar la exposición del receptor a múltiples donantes. Realizar controles biológicos de las unidades de sangre donadas (pruebas de tamizaje para HIV, HBV, HCV, sífilis, chagas, etc.). La selección adecuada del donante debe estar basada tanto en criterios de protección del donante como en criterios de protección del receptor CRITERIOS DE PROTECCIÓN DEL DONANTE Se refiere a todos aquellos medios y criterios orientados a certificar que la donación de sangre no representa ningún riesgo para la salud y el bienestar del donador.dentro de estos criterios se incluyen: 44

53 A. Edad: Según la ley para ser donante de sangre se requiere ser mayor de 18 años y menor de 65 años. Para los donantes menores de 18 años debe existir la autorización de la persona responsable del menor, mientras que para los donantes mayores de 65 años debe mediar la autorización del médico. Para los donantes de sangre autóloga no existe límite de edad para donar. B. Peso: El peso mínimo para donar sangre se ha establecido en 50Kg. Un peso igual o mayor a éste es el adecuado para donar una unidad de sangre (450 ± 45ml), además del volumen extraído para las pruebas infecciosas y pretransfusionales requeridas (30ml aproximadamente). Para pesos entre 45 y 50Kg se debe usar equipos para extraer menor volumen (405 ml o menos), los cuales tienen la cantidad adecuada de anticoagulante para el volumen de sangre a extraer. También se puede reducir la cantidad de anticoagulante de un equipo normal transfiriéndolo a una de las bolsas piloto pero conservando siempre la relación de sangre con respecto al anticoagulante. Para saber con precisión la cantidad de anticoagulante que se debe remover de la bolsa primaria a la piloto se puede usar la siguiente fórmula: X= cantidad de anticoagulante a remover peso donante Kg x 63 ml X=63 ml 50 Kg Por otra parte, la cantidad de sangre a extraer con relación al peso del donante se calcula así: Y= cantidad de sangre a extraer. peso donate Kg x 450 ml Y= 50 Kg En el caso de la donación autóloga, no hay límite de peso estricto. (14) C. Temperatura: La temperatura oral no debe exceder a 37,5 C. D. Pulso: Entre 50 a 100 pulsaciones por minuto. Debe contarse como mínimo durante 30 segundos y su percepción debe ser regular. Los deportistas pueden ser admitidos con menor de 50 pulsaciones por minuto de frecuencia cardiaca. (14) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

54 E. Presión Arterial: La presión sanguínea sistólica debe estar entre mmHg y la presión sanguínea diastólica entre mmHg. Valores por fuera de estos rangos deben ser evaluados después de un descanso del donante. Si los valores aumentados permanecen, el médico debe concretar si acepta o difiere la donación de sangre. Si los valores de presión arterial se encuentran entre los rangos mencionados se debe evaluar la presión diferencia, la cual se obtiene de la diferencia entre la presión diastólica y la sistólica. Si se obtiene un valor menor de 30 o mayor de 90 el donante debe ser diferido y revisado por el médico. Los donantes permitidos con historia clínica de hipertensión arterial que estén controlados con medicamentos, pueden ser aceptados siempre y cuando su tensión arterial se encuentre dentro de los límites permitidos y no estén recibiendo otros medicamentos para problemas cardíacos o estén en riesgo de sufrir falla cardíaca. F. Hemoglobina y Hematocrito: Los valores de hemoglobina y hematocrito para hombre y mujeres son: Hemoglobina (g/dl) Hematocrito (%) Hombres Mayor o igual 13,5 Mayor o igual 41 Mujeres Mayor o igual 12,5 Mayor o igual 38 Estos valores indican que la extracción de sangre en las personas no va a provocar efectos adversos como son las reacciones vasovagales. Algunos bancos de sangre han decidido en disminuir estos valores para lograr reclutar un número mayor de donantes. Valores de hemoglobina mayores de 17,5 g/dl o hematocrito mayor de 52% requieren ser revisor por el médico y la donación de sangre debe ser diferida. Para los donantes autólogos, la hemoglobina no debe ser menor a 11 g/dl y el hematocrito no debe ser inferior de 33%. G. Ocupación: Es necesario preguntar sobre la ocupación del donante lo cual permite crear y emplear criterios para su protección. Los deportistas, operadores de maquinaria pesada, trabajadores de la construcción que regularmente trabajan en andamiosdeben ser diferidos al fin de semana o a los días de descanso para realizarles la extracción sanguínea. Además se debe pedir a estas personas que no inicien sus actividades antes de las 12 horas después de la donación. Para los pilotos de aviones se aplica el mismo criterio, pero sus actividades deben iniciar después de 72 horas después de la donación. H. Intervalo ente las Donaciones: Este período oscila entre las 8 y 16 semanas entre cada donación. Cuando se trata de donación de plasma o plaquetas por aféresis, el intervalo entre una donación y otra debe ser de 48 horas. 46

55 Para las donaciones de sangre autóloga, el intervalo entre una donación de sangre total y otra no debe ser inferior a 72 horas, y la última donación debe hacerse por lo menos 3 ó 4 días antes de la intervención quirúrgica. I. Ingesta de Alimentos: Para donar sangre la persona debe evitar encontrarse en ayunas. Algunos bancos de sangre piden no haber ingerido alimentos por lo menos dos horas antes de la donación para impedir la obtención de plasmas lipémicos. Aunque no se ha comprobado que el aumento de lípidos en el plasma ocasione reacciones alérgicas al receptor, mientras que al donante sí pueden traer efectos no deseados. J. Trasnocho: Es conveniente tener en cuenta el ciclo de sueño-vigilia del donante. Si trabaja en la noche (ciclo sueño-vigilia invertido) o no durmió la noche anterior, se puede aceptar la donación si el individuo ha dormido por lo menos de 4 a 6 horas antes de ésta. K. Embarazo: Todo donante femenino debe ser interrogada sobre si está en embarazo o lo estuvo en las pasadas 6 semanas. Durante el embarazo no se puede donar sangre y sólo se puede hacerlo cuando hayan transcurrido 6 semanas después del parto normal. La excepción a esta regla sólo se hará en los casos que la sangre sea requerida para autotransfusión o para uso en el recién nacido, siempre bajo vigilancia médica. Si el parto fue por cesárea y ésta involucró transfusión de sangre o derivados se difiere 12 meses. L. Terapia con Medicamentos: Si el donante toma algún medicamento, se debe indagar la causa que lo acarreó a iniciar ese tratamiento. El interrogar sobre los medicamentos que toma el donante es una medida para su protección, mientras que otras veces es un criterio para la protección del receptor. Si el donante está bajo el tratamiento de drogas para trastornos cardiovasculares, el diferirlo constituye una medida de protección para su salud y bienestar. Si el tratamiento que está tomando es antibacteriano el diferirlo se constituye más que todo en un criterio para proteger al receptor. Si el individuo es consumidor frecuente de aspirinas o las consumió en los tres días anteriores a la donación, la unidad de sangre no debe ser utilizada para fraccionamiento de plaquetas. Es conveniente que exista en el banco de sangre una lista en la que se incluyan los nombres comerciales y genéricos de los medicamentos más comunes y si el donante debe ser aceptado, esta lista debe ser actualizada. 47

56 Nombre Comercial Nombre Genérico Indicación Aceptación Acromicina Tetraciclina Antibiótico No Ampicilinas Ampicilina Antibiótico No Artane Trihexifenidil Antiparkinsoniano No Atromid Clofibrato Antilipídico No Coumadin Warfarina Sódica Anticoagulante No Demerol Meperidina Analgésico narcótico No Dabinese Clorpropamida Normoglucemiante oral No Digoxina Digoxina Cardiotónico No Eritromicina Eritromicina Antibiótico No Fenobarbital Fenobarbital Sedante No Gantanol Sulfanilamido-isoxazol Antibacteriano No Gantrisin Sulfixoxazol Antibacteriano No Hidergina Dihidroergocornina Trast. Circ. Cerebrales No Dihidroergokriptina Dihidroergocristina Ilosone Eritromicina Antibiótico No Inderal Propanolol Cardiovascular No Indocid Indometacina Antiinflamatorio Analgésico No Isordil Dinitrato de isosorbitina Vasodilatador coronario No Kaon Potasio Hipopotasemia No Lasix Furosemida Diurético No Lomotil Difenoxilato Diarreas No Macrodantina Nitrofurantoína Antibacteriano No Marax Efedrina, Teofilina Asma No e Hidroxina Medrol Metilprednisolona Corticosteroide No Minocin Minociclina Antibiótico No Nembutal Pentobarbital Barbitúrico No Nitroglicerina Nitroglicerina Vasodilatador coronario No Omnipen Ampicilina Antibiótico No Orinase Tolbutamida Normoglicemiante No 48

57 Nombre Comercial Nombre Genérico Indicación Aceptación Ovulen Etinodiol y mestranol Contraceptivo oral No Paregórico Elixir Tintura de opio Diarrea No Penicilinas Penicilina Antibiótico No Peritrate Pentaeritritol Vasodilatador coronario No Prednisona Prednisona Corticosteroide oral No Quinidina Quinidina Arritmias cardiacas No Seconal Secobarbital Barbitúrico No Serpasol Reserpina Antihipertensivo No Tanderil Oxifenbutazona Antiinflamatorio No Tedral Teofilina, Efedrina, Asma No Fenobarbita Terramicina Oxitetraciclina Antibiótico No Tigan Trimetobenzamida Antiemético No Tolinase Tolazamida Normoglicemiante No Vibramicina Doxiciclina Antibiótico No M. Antecedentes Quirúrgicos: Los antecedentes quirúrgicos del donante son usados a veces como criterio para su protección o para la protección del receptor. ANTECEDENTES QUIRÚRGICOS En las cirugías menores o que no involucraron transfusión de sangre o hemoderivados. En el caso de las cirugías mayores y que involucraron transfusión. Los tratamientos dentarios que involucran riesgo de bacteremia. Las cirugías dentales en las cuales se utilizó anestesia general. Las cirugías dentales en las cuales se utilizó anestesia local. Cuando al donante se le ha practicado una biopsia. TIEMPO A DIFERIR Por tres meses o hasta la plena recuperación del individuo. Por 12 meses Se difieren por una semana Difieren por un mes Se difiere por una semana Se debe diferir hasta saber el resultado, el cual deberá ser negativo para malignidad. 49

58 N. Historia de Enfermedades: Es conveniente que el médico del banco de sangre realice una listas de las enfermedades que impiden la donación así como el tiempo a diferir la donación. Estos listados son útiles cuando el médico se encuentra ausente. El cuadro muestra algunas enfermedades y el tiempo que difiere la donación para asegurar el bienestar del donante. ENFERMEDADES EN EL DONANTE CARDIOVASCULARES Enfermedad coronaria. Infartos. Enfermedad cardiaca reumática. Insuficiencia cardiaca congestiva. Antecedentes de by-pass coronario. Cirugía de varices. GASTROINTESTINALES Enfermedad hepática degenerativa. Ulcera péptica gástrica o duodenal. Pólipos rectales. Hemorroides. Colitis ulcerativa. Cáncer. HEMATOLÓGICAS Trastornos hereditarios de la coagulación. Alteraciones morfológicas de los hematíes. Leucemia, Linfomas, Talasemias. Porfirias. Anemia de células falciformes. Anemia aplástica. Anemia ferropriva. RESPIRATORIAS Infecciones virales o bacterianas agudas. TBC pulmonar activa. TBC pulmonar tratada. Cáncer de pulmón. Asma. TIEMPO A DIFERIR LA DONACIÓN Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. 6-2 meses*. Definitivamente meses* después del episodio agudo. Aceptar si está asintomático. Aceptar si está asintomático. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. Definitivamente. 6 meses previo control. 2 meses post-tratamiento. Definitivamente. 2 años en los cuales las radiografías sean estables y no haya habido tratamiento. Definitivamente. 30 días post-crisis. 50

59 URINARIAS Infecciones vías urinarias bajas. Hasta su curación. Infecciones vías urinarias altas. 1 semana post-tratamiento y curación. Enfermedades crónicas (glomerulonefritispielonefritis) Definitivamente. Litiasis. Aceptar si está asintomático y sin tratamiento. REUMÁTICAS Artritis reumatoidea. Definitivamente. Lupus eritematoso sistémico. Definitivamente. Fiebre reumática. 5 años post-control y sin secuelas. Crisis gotosa. 2 meses. NEUROSIQUIATRICAS Enfermedades cerebro-vasculares. Definitivamente. Enfermedades mentales. Definitivamente. Epilepsia o convulsiones. Aceptar previo chequeo médico. Mareos. Aceptar previo chequeo médico. Neurocirugía con secuelas. Definitivamente. Neurocirugía sin secuelas. 1 año. *=Dependiendo si la cirugía involucró transfusión de sangre o derivados. Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de CRITERIOS DE PROTECCIÓN DEL RECEPTOR Hace hincapié a todos aquellos procedimientos que empleados al donante tienen como objetivo disminuir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas e incrementar los efectos benéficos de la transfusión en el receptor. a. Apariencia General del Donante: El donante debe tener un aspecto general visiblemente sano y saludable. Es normal que el donante sienta nerviosante el hecho de donar sangre, pero si está muy nervioso es preferible diferirlo hasta que se calme. Los individuos que se encuentren bajo los efectos del alcohol o drogas deben ser diferidos hasta que el efecto haya pasado, pero si la persona es adicta a estas sustancias deben ser rechazados como donantes. Es importante observar si el donante tiene señas de pinchazos en los brazos, esto puede indicar la adicción a drogas intravenosas lo cual lo anularía como donante. 51

60 b. Temperatura:La temperatura oral no debe exceder los 37,5 C. c. Inmunizaciones y Vacunas:Se debe preguntar al donante acerca de las vacunas que ha recibido y la fecha de su aplicación. Algunas de las vacunas exigen diferir al donante por períodos variables de tiempo, mientras que otras no necesitan tal precaución. El cuadro muestra las vacunas más frecuentes y el tiempo recomendado para diferir al posible donante de sangre. VACUNAS E INMUNIZACIONES TIEMPO A DIFERIR Rabia. 12 Meses Hepatitis B no derivada de humanos. No diferir Vacunas con virus vivos atenuados: Rubéola. 2 semanas Sarampión. 2 semanas Paperas. 2 semanas Fiebre amarilla. 2 semanas Influenza. 2 semanas Polio. 2 semanas Vacunas con microorganismos muertos: Cólera. No diferir Difteria. No diferir Haemophilusinfluenzae. No diferir Polio. No diferir Tétanos. No diferir Tifoidea. No diferir Tifo. No diferir Inmunoglobulinas. No diferir BCG. 4 semanas Gammaglobulina especifica anti HBV. 12 meses Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de d. Terapia con Hemoderivados:Ya que la sangre implica un riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas, los individuos que han recibido transfusiones de sangre total o derivados plasmáticos deben ser diferidos como donantes por un tiempo no menor de un año. 52

61 e. Enfermedades Infecciosas:El objetivo principal de la selección de donantes es disminuir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas tanto como sea posible. Para conseguir este objetivo es necesario interrogar al posible donante sobre las enfermedades infecciosas que ha padecido o padece actualmente. De la misma forma se debe averiguar si el donante ha estado en contacto íntimo con personas que padezcan o que tengan alto riesgo de sufrir enfermedades infecciosas, o si ha viajado o procede de zonas endémicas para algún microorganismo en particular. ENFERMEDAD INFECCIOSA-RIESGO Hepatitis viral. Ictericia de causa desconocida. Infección por HIV, HTLV I/II, HCV. Infección por citomegalovirus. Dengue. Gripe o virosis común. Sífilis o gonorrea. Infecciones bacterianas. Blastomicosis. Histoplasmosis. Babesiosis y Chagas. Leishmaniasis. Toxoplasmosis. Malaria. Malaria por especia Malarie. Relación íntima con persona seropositiva para HIV. Relación íntima con persona positiva para hepatitis. Relaciones sexuales con prostitutas. Víctima de violación. Tatuajes, acupuntura, perforación de orejas. Inmigrantes de Haití y África. Homosexuales. Transfusión de sangre o componentes. Internos de instituciones penitenciarias. Inoculación accidental con sangre o fluidos corporales. Viajeros a zonas endémicas de malaria. TIEMPO A DIFERIR Definitivamente Definitivamente Definitivamente 2 años 6 meses 1 semana 12 meses Hasta su curación Definitivamente 12 meses Definitivamente Definitivamente 2 años 3 años Definitivamente Definitivamente Definitivamente 12 meses 12 meses 12 meses Definitivamente Definitivamente 12 meses Definitivamente 12 meses 6 meses 53

62 ENFERMEDAD INFECCIOSA-RIESGO TIEMPO A DIFERIR Originario de zonas endémica de malaria. 3 años Originario de zona endémica de chagas. Definitivamente Adictos a drogas intravenosas. Definitivamente Familiares que conviven con pacientes de hemodíalisis. Definitivamente Más de un compañero (a) sexual al año. Definitivamente Bisexuales. Definitivamente Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de f. Estilo de Vida: Es importante que el estilo de vida delapersona sea investigado ya que con la indagación se puede emitir juicios de valor sobre si se acepta o aplazar al donante. Cuando se averigua sobre el estilo de vida, se está en cierta forma invadiendo su privacidad, y en tal sentido la persona tiene el derecho constitucional de no responder a las preguntas que se le expongan. Habitualmente se pregunta sobre el abuso del alcohol y las drogas, así como por los hábitos sexuales. En cuanto a los hábitos sexuales, se debe interrogar sobre el número de compañeros (as) sexuales al año, homosexualismo, bisexualismo y relaciones sexuales frecuentes con prostitutas. Se debe interrogar sobre las enfermedades de transmisión sexual como la sífilis, la gonorrea y el Sida entre otros. Las preguntas deben ser bien elaboradas y se le debe dar a la persona la seguridad de que la información que suministre es de carácter confidencial. Legalmente la persona puede rehusarse a contestar las preguntas, en tal caso, es conveniente diferirlo poniéndole de manifiesto que sin llenar este requisito no puede ser aceptado como donante INFORMACIÓN QUE DEBE PROVEER EL DONANTE DE SANGRE La información que suministra el donante al banco de sangre es variada. Incluye desde los resultados de las pruebas de laboratorio hasta la información confidencial acerca de la vida privada del individuo. Esta información se obtiene a través de la realización de la historia clínica del donante. Para elaborar la historia clínica del donante se deben ejecutar dos pasos específicos: 54

63 A) Entrevista del Donante Aunque en el examen físico se realizan preguntas claves al posible donante, es necesario realizar una entrevista al donante y la información quede consignada en la historia clínica. En la historia clínica pueden quedar registrados los resultados del examen físico así como las respuestas que el donante dé a las diferentes interrogantes. Básicamente la información que proporciona el donante es: Edad. Sexo. Nombres y apellidos. Dirección y teléfono de residencia y/u oficina. Antecedentes de donaciones anteriores. Antecedentes transfusionales. Antecedentes obstétricos. Antecedentes de inmunizaciones y vacunas. Antecedentes de enfermedades infecciosas. Raza. Procedencia. Ocupación. Escolaridad. Tipo de donación: si es dirigida, condicionada, autóloga. Estilo de vida. B) Examen Físico del Donante El examen físico del donante se lo debe realizar en el banco de sangre el médico presente o en su defecto una enfermera o el analista. Observar la apariencia general del donante. Determinar la tensión arterial. 55

64 Determinar el pulso. Determinar la temperatura oral. Determinar el peso. Determinar valores de hemoglobina y/o hematocrito. Interrogar sobre enfermedades graves que padezca o haya padecido el donante. Interrogar sobre terapia con medicamentos. Examinar el sitio de venopunción para descartar lesiones que indiquen abuso de drogas intravenosas. Interrogar sobre tatuajes, acupuntura o perforaciones para aretes o pendientes. Una vez que se le ha realizado la entrevista y el examen físico al posible donante, el profesional de la elección decidirá de acuerdo con los resultados y respuestas obtenidas si el individuo es aceptado como donante, se lo difiere por un tiempo determinado o se rechaza definitivamente. Si la persona es aceptada como donante; es obligación del bando de sangre suministrarle información básica sobre el procedimiento de obtención de la sangre entre otros aspectos REACCIONES A LA DONACIÓN DE SANGRE Cuando la donación de sangre se realiza en personas de peso adecuado y en buenas condiciones de salud, las reacciones adversas a la donación son muy escasas. Su frecuencia es aproximadamente de 1% y generalmente se presentan en personas de bajo peso, en quienes la cantidad estándar de sangre extraída representa una significativa proporción de su volemia (volumen total de sangre circulante de un individuo humano, que es de aproximadamente de 5-6 litros en varones y en las mujeres de 4 a 5). La reacción más común es la lipotimia (algunos de los síntomas frecuentes son vértigo, cansancio, palidez, cefalea, trastornos visuales, sudoración excesiva, y ocasionalmente dolor estomacal), causada por una respuesta neurofisiológica a la pérdida de sangre, agravada por factores de tipo psíquico. 56

65 El componente psicológico está claramente demostrado en aquellas personas que se marean o desmayan a la sola vista de la sangre y puede ser contagioso cuando ocurre en donaciones masivas. El desmayo es frecuente también en personas quienes donan por primera vez.es conveniente estar alerta a cualquier síntoma asociado a una reacción adversa en el donante y mantener en el banco de sangre un equipo de emergencia para sortear cualquier eventualidad de este tipo. El equipo mínimo de emergencia que se debe mantener en un banco de sangre puede observarse en el cuadro. EQUIPOS Y MATERIALES MEDICAMENTOS Equipo de oxígeno. Solución salina fisiológica. Equipo de intubación orofaringea. Soluciones glucofisiológicas. Equipos de administración de líquidos endovenosos. Drogas: Jeringas con agujas de diferentes calibres. Vasopresoras. Bolsas de papel para los casos de hiperventilación. Vasodilatadores coronarios. Toallas. Anticonvulsionantes. Equipo de cirugía menor cuando no se dispone de salas Broncodilatadores. de cirugía en el hospital. Antiheméticos. Sedantes. Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de Los síntomas más frecuentes son: Mareo, agotamiento, palidez, arcadas, sudoración y vómito. En otras ocasiones el donante puede llegar a desmayarse y sufrir convulsiones. Las reacciones adversas más frecuentes asociadas a la donación de sangre pueden observarse en el cuadro. REACCIÓN ADVERSA Síncope vasovagal. Incluye síntomas: Palidez, sudoración, piel fría. Visión borrosa, mareos, náuseas. Vómitos, perdida de la conciencia. MODO DE PREVENIRLA Mejorar las condiciones del donante en cuanto a stress emocional y ansiedad. Antes de la donación interrogar sobre si el donante ha comido algo y ha dormido por lo menos cuatro horas. Distraer al donante con charla amistosa, revistas, música, tv. 57

66 REACCIÓN ADVERSA MODO DE PREVENIRLA Hiperventilación. Invite al donante a respirar en una bolsa de papel y a que mejore su frecuencia respiratoria. Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de El procedimiento ante cualquier síntoma o signo de reacción adversa a la donación de sangre es como sigue: a) Detener la donación retirando inmediatamente el torniquete y el equipo de flebotomía al donante. b) Adecuar la posición del donante de tal modo que los pies queden elevados y la cabeza baja. c) Aflojar las ropas del donante. d) Verificar que respire adecuadamente, sugerir que no se hiperventile. e) Si el donante se está hiperventilando, colóquelo a respirar en una bolsa de papel, esto evitará que pierda CO 2 y que ocurran contracciones musculares o espasmos tetánicos. f) Tomar los signos vitales (tensión arterial, frecuencia cardíaca) periódicamente hasta que el donante se recupere. g) En caso de convulsiones, evitar que la persona se lastime. h) En caso de náuseas, indicar que respire profundamente. i) Si los síntomas persisten o son severos, es conveniente que la persona sea atendida por el médico del servicio. Hay que recordar que una de las funciones del banco de sangre es lograr que el donante regrese, por este motivo se debe minimizar en lo posible las reacciones adversas en el donante.para evitar que se generen las reacciones adversas durante la donación se necesita en gran medida que el ambiente del área de donación sea agradable y ventilado, que el personal seasimpático y cortés, que el donante consiga ser distraído con elementos como música, televisión o conversaciones agradables.es necesario diferir a los donantes que manifiesten preocupación, fatiga o excesivo nerviosismo, ya que es un aspirante a presentar una reacción post-donación y esto puede contribuir a que otros donantes deserten de su intento de donar. 58

67 3.6. RECOLECCIÓN DE SANGRE PARA TRANSFUSIONES UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA ÁREA DE DONACIÓN Se recomienda que el área de donación en un banco de sangre debe estar ubicada en el primer piso del hospital y de preferencia debe tener acceso directo desde la calle. Ésta área debe permanecer limpia, bien iluminada y cómodamente ventilada. El personal que se ocupa en el área de donación de sangre debe estar bien calificado, debe ser amable y brindar la suficiente seguridad y confianza de tal manera que la donación se convierta en una experiencia satisfactoria y agradable. En el área de donación deben existir por lo menos tres ambientes bien diferenciados para poder brindar comodidad y privacidad al donante: Recepción del Donante: En este el donante espera ser atendido y recibe información sobre algunos aspectos básicos de la donación. Área de Chequeo Médico: Puede ser un consultorio donde el médico, en su defecto la enfermera o el laboratorista realiza el examen físico y la historia clínica del donante. Área de Flebotomía o Sangría: En este ambiente es donde se realiza la extracción de la Sangre y se toman las muestras adicionales para la realización de las pruebas pretransfusionales. No es bueno que los donantes que esperan ser atendidos vean el proceso de extracción ya que para algunas personas esto puede ser un motivo de deserción EQUIPOS Y MATERIALES NECESARIOS EN LA SALA DE DONACIÓN El equipo que se emplea para la obtención de la sangre debe estar bien organizado para que certifique un procedimiento seguro y eficiente. Camillas o sillas para donación. Balanzas. 59

68 Tensiómetro. Estetoscopio. Tijeras. Pinzas mezcladoras y hemostáticas. Torniquetes. Guantes. Tubos de 13x100mm. Sistema cerrado de bolsas para extraer sangre. Gasas o torundas de algodón estériles. Esparadrapo. Jabón quirúrgico. Jabón yodado. Alcohol al 70%. Botiquín de primeros auxilios y elementos para reanimación PREPARACIÓN DE LA PUNCIÓN VENOSA A. Preparación de la punción venosa: Visualmente se selecciona una vena firme y grande en una zona de piel libre de lesiones, para lo cual se recomienda: Inspeccionar ambos brazos usando el torniquete o inflando el mango de presión sanguínea entre 40 a 60mmHg. Marcar la vena más prominente. (Es útil pedir al donante que cierre y abra la mano algunas veces). Retirar el torniquete y preparar el sitio de la punción. B. Identificar la bolsa para la extracción de sangre y los tubos para las pruebas pretransfusionales a utilizar con el número de registro del donante o con un código de barras si dispone de equipos automatizados. C. Invitar al donante a la camilla o silla de donación de tal modo que se sienta cómodo y relajado. D. Inspeccionar el sitio de venopunción (antebrazo) y elegir una vena de buen calibre. E. Limpiar la piel del sitio de venopunción utilizando para ello jabón quirúrgico, luego jabón yodado y por último alcohol al 70%. La limpieza debe hacerse en una área de 4-5 cm con movimientos circulares de adentro hacia afuera y utilizando pinzas y gasas o torundas de 60

69 algodón estériles. Una vez limpio el sitio no puede volver a palparse la vena. Si la punción no va a realizarse inmediatamente cubrir el área desinfectada con una gasa estéril. F. Colocar el torniquete para lograr una buena presión en la vena e indicar al donante a que abra y cierre al mano continuamente a proporcionarle una pelota de goma para que realice el ejercicio. G. Tomar la bolsa de plástico elegida e identificada en el paso N 1 y retirar el aditamento que cubre la aguja. Es conveniente antes de realizar este paso sellar el conducto de la bolsa con una pinza hemostática para evitar que penetre aire. Hacer la punción inmediatamente, la punción debe ser limpia (en el primer intento) para evitar la formación de coágulos. H. Fijar la aguja a la piel del donante con un esparadrapo. I. Retirar la pinza hemostática que se coloco en el paso N 6 para que la sangre comience a fluir al interior de la bolsa. Mezclar suavemente los primeros mililitros de sangre con el anticoagulante. J. Colocar la bolsa en la balanza. Estas balanzas detienen el flujo de sangre cuando se ha recolectado la cantidad preestablecida. Durante el proceso de llenado de la bolsa, agitar (suavemente) varias veces el contenido para asegurar una buena mezcla del anticoagulante con la sangre. K. Una vez que se ha llenado la bolsa, sellar el conducto con un nudo o una grapa a una distancia de 7-10cm por debajo de la aguja. L. Colocar una pinza hemostática a unos 2cm de la grapa o nudo y cortar el conducto entre ellos, liberando de esta manera la unidad de sangre del brazo del donante. M. Cortar el conducto ente el nudo o grapa y la pinza hemostática. N. Llenar los tubos (13x100mm) para la prueba pretransfusionales con sangre del donante abriendo la pinza hemostática. Una vez llenos los tubos volver a cerrar la pinza par que el flujo de sangre se detenga. O. Retirar el torniquete. P. Retirar la aguja y colocar en el sitio una gasa o torunda estéril. Hacer que el donante presione por algunos minutos el sitio de punción. Q. Con una pinza mezcladora, exprimir hacia la bolsa la sangre que se encuentra en el conducto. Repetir la operación 3-4 veces hasta que la sangre se halla mezclado con el anticoagulante. 61

70 R. Llevar la sangre inmediatamente a la sección de separación de componentes y los tubos para las pruebas pretransfusionales a la sección de inmunohematología. S. Registre cualquier evento anormal en la historia clínica del donante PREPARACIÓN DE COMPONENTES SANGUÍNEOS El donante de los sistemas de bolsas plásticas para la recolección y de aparatos de centrifugación de alta velocidad ha permitido que la sangre pueda ser separada en sus diferentes componentes: Glóbulos Rojos. Plaquetas. Leucocitos. Plasma. Crioprecipitado de factor VIII y Fibrinógeno. Para la separación de los componentes sanguíneos es necesario disponer de: Un área limpia y bien iluminada. Centrifuga refrigerada. Balanza. Material de goma para equilibrar las copas. Bolsas de recolección de sangre conectadas en circuito cerrado y bolsas de transferencia. Extractor de plasma. Pinzas hemostáticas. Pinzas exprimidoras. Tijeras. Sellador eléctrico o grapas metálicas. Etiquetas e identificación de los diversos componentes. 62

71 PREPARACIÓN DE CONCENTRADOS DE GLÓBULOS ROJOS UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Los concentrados de glóbulos rojos se preparan a partir de sangre total, bien sea por centrifugación inmediata después de donada o por sedimentación después de 24 a 48 horas de almacenada a 1-6 C.Para preparar concentrados de glóbulos rojos es conveniente que la sangre sea extraída mínimo en bolsas plásticas dobles, lo que permite realizar la separación de los eritrocitos dentro de un sistema cerrado.(15) Si la sangre que se va a utilizar para este procedimiento es fresca (no más de 4 a 6 horas de donada), el plasma puede ser congelado a -18 C o menos, obteniéndose como subproducto el plasma fresco congelado (PFC). Los concentrados de hematíes deben almacenarse en neveras a temperatura entre 1-6 C. La fecha de expiración del concentrado globular es de 35 días cuando el anticoagulante usado es CPDA-1, siempre y cuando el sistema cerrado no haya sido quebrantado y el hematocrito no sobrepase del 80%. Si el hematocrito es superior a 80%, los glóbulos rojos se envejecen en forma acelerada y sobreviven pobremente en la circulación una vez transfundidos. Este factor se puede controlar midiendo el hematocrito de las unidades que van a ser descartadas por cualquier razón.si la separación del plasma se hace en circuito abierto, los glóbulos rojos deben transfundirse en un tiempo no mayor de 24 horas. Cumplido ese período, deben ser descartados Técnica de Preparación a. Centrifugar la unidad de sangre a rpm por 5 minutos. La centrifuga debe estar a 4-5 C, excepto cuando se desee obtener plaquetas como producto secundario. b. Colocar cuidadosamente la unidad de sangre centrifugada en el extractor de plasma de tal modo que no se altere la interfase eritrocitos-plasma. (15) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

72 c. Si la sangre fue colectada en bolsa doble, romper el sello de la bolsa primaria de tal forma que el plasma fluya a la unidad satélite. Si fue colectada en bolsa triple o cuádruple, selle con un nudo las bolsas restantes de tal suerte que quede una disponible para recibir el plasma. Si la sangre fue colectada en bolsa sencilla retirar el plasma usando una bolsa de transferencia. En este caso el sistema cerrado es violado y el concentrado de hematíes debe transfundirse en las siguientes 24 horas. El hematocrito final del concentrado de glóbulos rojos debe estar entre 70 y 80%, esto se logra extrayendo de la unidad primaria 225 a 250ml de plasma. Es conveniente utilizar balanzas calibradas para medir la cantidad de plasma extraído, tomando con referencia que 1ml de plasma pesa aproximadamente 1,03 gramos. d. Una vez extraído la cantidad adecuada de plasma, suspender el flujo haciendo un nudo o colocando una grapa o pinza hemostática en el tubo piloto que comunica ambas bolsas. e. Sellar el tubo piloto en dos o tres sitios cercanos, preferiblemente con un sellador eléctrico. Si no se dispone de sellador eléctrico utilizar grapas metálicas. f. Con una tijera hacer un corte en uno de los espacios sellados para separar la bolsa primaria de la satélite PREPARACIÓN DE CONCENTRADOS DE PLAQUETAS Para la preparación de concentrados de plaquetas a partir de sangre completa, ésta no debe exceder las 8 horas desde la donación y debe permanecer a C hasta que las plaquetas hayan sido obtenidas. Los concentrados de plaquetas pueden prepararse mediante dos fases de centrifugación a C. En la primera fase de centrifugación, a baja velocidad produce el plasma rico en plaquetas (P.R.P.). Posteriormente el plasma rico en plaquetas se somete a la segunda fase de centrifugación, a alta velocidad con el fin de producir un concentrado de plaquetas más unidad de plasma pobre en plaquetas (P.P.P), por lo que la segunda centrifugación, se realiza a mayor tiempo pero a menor velocidad para no dañar las plaquetas (3.300rpm x 20 minutos). 64

73 Una vez conseguido el concentrado plaquetario, la bolsa debe permanecer en completo reposospor 1-2 horas a temperatura del laboratorio (20-24 C), y sólo en aquel momento la masa plaquetaria debe ser resuspendida en el plasma residual por inversión suave y delicada, hasta que la suspensión sea homogénea. En ningún instante las plaquetas deben ser manipuladas con violencia, ya que produciría elrompimiento de los grumos, lo que conduce al consiguiente daño. La fecha de expedición de la unidad de plaquetas depende del tipo de plástico de la bolsa que las contiene. El plástico de que están fabricadas las bolsas debe ser permeable al oxígeno. Las bolsas plásticas de primera generación (poco permeables), permiten un almacenamiento de los concentrados de plaquetas por un período de 72 horas. Por su parte, las bolsas de de segunda generación de poliolefina o de cloruro de polivinilo, permiten por el tipo de plástico, el grosor del mismo y la mayor superficie de intercambio de gases, un tiempo de almacenamiento de los concentrados de plaquetas hasta de 5 días Técnica de Preparación A) La sangre debe ser colectada en sistemas cerrados de bolsas plásticas, preferiblemente bolsas triples o cuádruples. B) Centrifugar la unidad de sangre en el menor tiempo posible después de haber sido donada. La centrífuga debe estar a temperatura de C. aunque existen diferentes protocolos de centrifugación, se sugiere que se realice entre a rpm por un tiempo comprendido entre 5 y 8 minutos. C) Colocar cuidadosamente la unidad de sangre centrifugada en el extractor de plasma de tal manera que no se altere la interfase paquete globular-plasma. D) Hacer un nudo o poner una grapa metálica en todos los conductos que comunican las bolsas satélites con la principal, excepto en uno de ellos, de tal modo que quede una bolsa satélite disponible para recibir el plasma rico en plaquetas (PRP). E) Romper el sello de la bolsa primaria para que el PRP comience a fluir al interior de la bolsa satélite destinada para ello. F) Sellar y cortar el conducto que comunica la bolsa primaria con las satélites, rotular el concentrado de glóbulos rojos y almacenarlo a 1-6 C. 65

74 G) Centrifugar el PRP a C a mayor velocidad. Se recomienda a rpm por un tiempo de 8 a 10 minutos. H) Después de la segunda fase de centrifugación, colocar cuidadosamente la bolsa que contiene las plaquetas en el extractor de plasma. I) Aflojar el nudo o quitar la grapa del conducto que comunica las bolsas satélites y transferir el plasma a una de ellas. Dejar en la bolsa que contiene las plaquetas un volumen de 50 a 60 ml de plasma. J) Sellar y cortar el conducto que comunica la unidad de plaquetas con la satélite, rotular adecuadamente marcando el tipo de producto, la fecha y hora de preparación, al igual que la fecha y hora de vencimiento. La unidad satélite que contiene el plasma puede ser congelada inmediatamente a -18 C ó -30 C para la obtención de plasma fresco congelado. K) Dejar reposar e concentrado de plaquetas sobre un mesón (la etiqueta de la unidad hacia abajo) por 1-2 horas antes de almacenarlas en los equipos especiales de rotación de plaquetas PREPARACIÓN DE PLASMA FRESCO CONGELADO El plasma fresco congelado (PFC) resulta como subproducto de la preparación del concentrado de hematíes o de las plaquetas. El PFC se prepara a partir de sangre completa. Su preparación y posterior congelación debe realizarse antes que la unidad de sangre complete 6 horas de haber sido recolectada, y su congelación y almacenamiento se realiza a -18 ó -30 C. El período de almacenamiento es de un año sin que pierda sus propiedades terapéuticas. Para ser transfundido, el PFC debe ser descongelado entre 35 y 37 C y conservarseposteriormente bajo refrigeración (1-6 C) hasta el momento de la transfusión.una vez descongelado, el plasma mantiene sus propiedades hasta por 24 horas bajo refrigeración indicada. Si el plasma no es transfundido en ese tiempo, no debe volver a congelarse. Los dispositivos de plasma fresco congelado que se preparen deben permanecer correctamente identificadas con etiquetas que mencionen el tipo de producto, su fecha de preparación y vencimiento, el grupo sanguíneo ABO y Rh, y el registro del donante a que pertenece. 66

75 Una unidad de plasma debe tener un peso bruto (bolsa y pilotos) de 236 a 288 gramos, lo que equivale a un volumen de plasma de 200 a 250ml Técnica de Preparación a) Recolectar la sangre en bolsas dobles o triples. b) Centrifugar entre 1 a 6 C por 5 minutos. c) Pasar a la bolsa satélite 225ml de plasma (232g). Usar una balanza para determinar la cantidad precisa. d) Sellar el tubo de transferencia en varios segmentos hasta la base de la bolsa, respetando el número serial. e) Identificar la unidad de plasma con la siguiente información: Volumen de plasma. Grupo ABO y Rh. Investigación de anticuerpos irregulares. Resultado de las pruebas para HBsAg, Chagas, SIDA, Sífilis, fecha de extracción y expiración. f) Cortar el tubo de transferencia entre dos puntos sellados. El tubo dividido en segmentos debe enrollarse y fijarse a la unidad de plasma, los cuales pueden ser útiles par controles posteriores que se deseen practicar. g) Congelar inmediatamente según se especificó, asegurándose de que la congelación se produjo dentro de las 6 horas de extraída la sangre PREPARACIÓN DE CRIOPRECIPITADO El crioprecipitado se puede preparar del PFC en cualquier momento de su conservación, pero su vencimiento será al término de los 12 meses desde del momento en que se efectuó la recolección de la sangre.cuando el PFC se descongela entre 1 a 6 C, se obtiene un precipitado de color blanquecino, este precipitado está conformado por algunas proteínas plasmáticas que por acción del frió precipitan. Los estándares internacionales especifican que cada unidad de crioprecipitado obtenida a partir de sangre total debe contener las siguientes cantidades de las proteínas que la integran: 67

76 Factor VIII o o factor antihemofílico (FAH) Factor de Von Willebrand Fibrinógeno Factor XIII IU % del presente en la unidad de sangre mg % del presente en la unidad de sangre Se ha encontrado que los plasmas de grupo A, B o AB dan mejor rendimiento de Factor VIII que aquellos de grupo O. Puede ser obtenido de sangre recolectada en ACD, CPD y CPDA-1, pero se ha observado que le ACD permite recuperar mayor cantidad de Factor VIII que los otros anticoagulantes. Es conveniente señalar que la temperatura del plasma descongelado no debe ser superior a 2 C, de lo contrario se perderá una cantidad importante de Factor VIII en el líquido sobrenadante, porque éste se disuelve. Por esta razón el procedimiento debe realizarse rápidamente para obtener el mayor rendimiento.es beneficioso que el crioprecipitado sea congelado antes que transcurra una hora de haberse descongelado completamente la unidad de plasma de la cual se obtuvo.(16) Para ser transfundido, el crioprecipitado debe ser descongelado a C en bañomaría, cuidando que no se contaminen con el agua del baño. Una vez descongelado, debe conservarse a temperatura ambiente y ser transfundido antes que transcurran 4-6 horas. Si el crioprecipitado descongelado no es transfundido, no debe volverse a congelar Técnica de Preparación A. La unidad de sangre debe ser obtenida en bolsa triple a través de una adecuada técnica de flebotomía. B. Centrifugar la unidad de sangre a rpm por 5-8 minutos antes que transcurran 6 horas de haberse practicado la flebotomía. La centrífuga deberá estar a 4 C. C. Colocar la unidad de sangre centrifugada en el extractor de plasma cuidando de no mezclarla. Hacer un nudo o sellar con una grapa metálica el conducto de una de las bolsas satélites de tal modo que quede la otra disponible para recibir el plasma. (16) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

77 D. Transferir el plasma a la unidad satélite elegida. La cantidad de plasma a transferir es como mínimo 200 ml (206g), cuidando en todo caso que la unidad de glóbulos rojos quede con un hematocrito del 70-80%. E. Sellar el tubo piloto que comunica la unidad principal con las satélites, cortar por uno de los sellos y refrigerar el concentrado de hematíes entre 1-6 C. F. Congelar rápidamente las bolsas satélites (una de las cuales contendrá el plasma obtenido) a -18 C o menos. Dado que el plasma deberá estar congelado en un tiempo de una hora como máximo después de iniciada la congelación, es conveniente utilizar congeladores de -30 ó -70 C. la congelación del plasma debe completarse antes que transcurran 6 horas de haberse obtenido la unidad de sangre total. G. Descongelar la unidad así tratada en el refrigerador (1-6 C). El proceso de descongelación tarda aproximadamente 14 a 18 horas. El tiempo preciso para concentrar las proteínas precipitadas es cuando en la unidad de plasma aún se observen pequeños cristales de hielo. Una demora entre el descongelamiento del plasma y su posterior centrifugación para concentrar las proteínas precipitadas puede producir una pérdida de la actividad del factor antihemofílico. H. Centrifugar rápidamente el plasma descongelado a rpm durante 5-8minutos. La centrífuga deberá estar a 4 C. Este procedimiento hará que las proteínas precipitadas por el frío, se adhieran al fondo de la bolsa. I. Colocar la bolsa que contiene el crioprecipitado sobre una superficie plana, o en forma invertida o en el extractor de plasma y transferir todo el plasma excepto 15 a 30ml a la otra bolsa satélite. Este plasma que se transfiere a la otra bolsa satélite es el plasma simple. J. Sellar el tubo piloto que comunica ambas bolsas, cortar por uno de los sellos y congelar rápidamente el crioprecipitado (debidamente etiquetado) a -18 C o menos, (preferiblemente a -30 ó -70 C) PREPARACIÓN DE PLASMA SIMPLE Es el plasma residual que queda después que se le ha extraído el Factor VIII; contiene albúmina, globulinas y otros factores de coagulación a excepción de los Factores VIII, von Willebrand y Fibrinógeno.De igual manera, se puede prepara a partir de sangre total en cualquier instante de su almacenamiento, hasta el quinto día antes de la fecha de vencimiento. 69

78 El plasma simple se debe conservar bajo refrigeración (1-6 C) o en congelación a -18 C adecuadamente etiquetado para no ser confundido con el plasma fresco congelado. Puede ser usado para resuspender los glóbulos rojos y producir sangre completa. El producto restante se ha denominado sangre completa modificada. En realidad, este producto cumple las mismas funciones que la sangre completa conservada en el refrigerador por más de 48 horas, en la cual, no hay plaquetas funcionales y el nivel de Factor VIII es muy pobre. La mejor forma de usar el plasma simple es adicionarlo a los glóbulos rojos cuando existe la solicitud de sangre completa, teniendo siempre la precaución de que el plasma sea isogrupo con los glóbulos rojos, de lo contrario éstos se hemolizarán. La fecha de vencimiento es la misma de la unidad de sangre total de la cual se consiguió. Actualmente lo bancos de sangre preparan y guardan poca cantidad de este hemoderivado CONSERVACIÓN DE SANGRE COMPLETA Y GLÓBULOS ROJOS La integridad de los glóbulos rojos ha sido por mucho tiempo el motivo principal de la preservación de la sangre, sin que ello haya significado el restarle importancia a los otros constituyentes. Es esencial señalar que el depósito adecuado de los glóbulos rojos está directamente relacionado con su metabolismo, su función en el transporte de oxígeno y su sobrevida después de transfundidos. Los métodos de preservación requieren de la adición de sustancias químicas, las cuales permiten conservar o mantener algunas de sus funciones.(17) El glóbulo rojo es una célula sin núcleo que no se divide y en efecto no puede sintetizar ácidos nucléicos, proteínas, ni lípidos, pero, mantiene activo el metabolismo de la glucosa, el cual suministra la energía suficiente para realizar funciones esenciales para: a. El cambio de gases (O 2 CO 2 ). b. Conservar la forma y la integridad de la membrana. (17) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

79 c. Preservar la hemoglobina bajo la forma reducida. d. El transporte de los iones a través de la membrana. UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA El glóbulo rojo maduro tiene un sistema enzimático bien desarrollado que le permite utilizar la glucosa como fuente de energía necesaria para su funcionamiento. Contiene también, compuestos como nucleótidos, entre los que se encuentran bases púricas y pirimídicas combinadas con fosfatos y ribosas. El más significativo de estos nucleótidos es el ATP, que se genera por el metabolismo de la glucosa y tiene como función el mantener la integridad de la membrana y de esta forma, certificar la sobrevida del glóbulo rojo. En el glóbulo rojo, el metabolismo de la glucosa se realiza casi en su totalidad por la vía anaeróbica o de Embden-Meyerhof, el cual la convierte en piruvato o lactato. Del metabolismo de cada molécula de glucosa se generan dos moléculas de adenosintrifosfato (ATP), dos de ácido láctico y además, 2,3, difosfoglicerato (2,3,DPG). Una pequeña parte de la glucosa es metabolizada a través de la vía pentosa-fosfato, que requiere de oxígeno. Aquí la glucosa es transformada en CO 2, con la generación de una coenzima denominada nicotinamida adenina dinucleótido fosfato(nadph). Este agregado es importante para conservar la hemoglobina en la forma reducida y proteger los eritrocitos contra la acción oxidante de una variedad de drogas. Existe una estrecha interrelación entre el metabolismo de la glucosa, la producción de ATP y la energía necesaria para mantener la viabilidad del glóbulo rojo. Por estas razones, su preservación debe ser hecha en un medio que leproporcione suficiente glucosa como fuente energética y prevenir todos los factores que obstruyen en el metabolismo glicolítico, con el fin de impedir el deterioro durante el depósito y asegurar su viabilidad una vez transfundidos REFRIGERACIÓN DE LA SANGRE Es primordialindicar que la temperatura de conservación juega un papel importante en el mantenimiento del delicado balance bioquímico del eritrocito, ya que ejerce un efecto inhibitorio sobre ciertas enzimas, vigilando de esta forma el metabolismo de la glucosa. 71

80 Por otro lado, la refrigeración adecuada disminuye la difusión de bacterias que podrían haber ingresado en la unidad durante la punción venosa. La sangre completa y los glóbulos rojos deben ser depositados únicamente en refrigeradores especialmente diseñados para este fin. La temperatura óptima para su adecuada conservación oscila entre 1 C y 6 C, la cual debe ser mantenida en toda las áreas del refrigerador, aceptándose fluctuaciones no mayores de 2 C dentro de estos dos extremos. Estos aparatos emplean el sistema de ventilación y tienen espacios de circulación que permiten mantener la temperatura dentro de los límites señalados en todas las áreas. Además, deben estar provistos de termómetros y alarmas audiovisuales, así como de un sistema de registro permanente de temperatura. El termómetro sensor del sistema de registro y el de la alarma audiovisual deben estar colocados en un envase plástico que contenga una mezcla de glicerol al 10% en agua destilada. (18) Cuando se produce algún cambio de temperatura fuera del rango de 1 a 6 C las alarmas deben activarse automáticamente. La fuerza eléctrica para el sistema de alarmas debe estar separada de la del refrigerador. Se considera necesario utilizar además dos termómetros del tipo mercurio, los cuales se colocan en envases plásticos que contengan entre 350 a 500ml de solución de glicerol/agua destilada al 10%. Uno de ellos, se coloca en la parte superior y el otro en la parte inferior del refrigerador; la temperatura en ellos no debe variar en más de 2 C y deben ser controlados periódicamente. Interiormente el aparato debe conservarse muy limpio y bien iluminado para facilitar la observación de la sangre, de los termómetros y del sistema de refrigeración. Dentro del refrigerador sólo puede guardarse la sangre donada, reactivos celulares empleados para la clasificación y muestras de sangre provenientes de donante y receptores, que deben estar bien tapadas e identificadas. Las superficies de los refrigeradores deben ser limpiadas regularmente con soluciones germicidas. Para ello pueden emplearse compuestos fenólicos. (18) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

81 La sangre no debe mantenerse fuera del refrigerador innecesariamente y cuando por razones específicas haya que hacerlo, junto con la unidad de sangre es necesario sacar uno de los termómetros, con el fin de controlar las variaciones de temperatura. Cuandola temperatura en el termómetro haya subido a 6 C, la sangre debe retornarse al refrigerador rápidamente. No debe dejarse abierta la puerta del refrigerador, pues estanegligencia acarrea cambios bruscos en la temperatura.en cuanto al espacio, el refrigerador debe estar dividido en áreas claramente señaladas para colocar la sangre: Sangre no-clasificada. Sangre clasificada. Sangre en observación o cuarentena, que es aquella que ha sido regresada porque no fue usada, o bien, sangre que muestra alteraciones en el plasma que sugieren hemólisis, contaminación, etc CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE LAS PLAQUETAS Durante los últimos años ha surgido un gran interés en el desarrollo de métodos para la conservación de plaquetas, tanto en estado líquido como congeladas. Esta situación refleja la necesidad de mantener un depósito suficiente de plaqueta para cubrir las crecientes demandas clínicas. En la medida en que se ha conocido mejor la estructura de las plaquetas y las condiciones que inducen a cambios en su morfología, viabilidad y función, se han desarrollado procedimientos de conservación y se han ido definiendo los parámetros que interfieren en el mantenimiento de las características vitales de las plaquetas durante su depósito. En la conservación de plaquetas hay dos aspectos de gran importancia que deben ser tomados en cuenta: Su sobrevida después de ser transfundidas. La actividad hemostática, medida por su capacidad para acortar el tiempo de sangría en el paciente trombocitopénico. 73

82 Los estándares de la Asociación Americana de Bancos de Sangre recomiendan que se deban hacer todos los esfuerzos para que las plaquetas se conserven durante el transporte entre 20 a 24 C. Esta temperatura se puede conseguir midiendo la temperatura ambiente y preparando un envase que contenga algunos trozos de hielo.en el comercio existen envases especiales que mantienen la temperatura deseada, pero requieren de una fuente de poder. Algunos autores recomiendan que cuando las plaquetas van a ser transportadas a grandes distancias y se hace difícil mantener la temperatura de 22 C y la aglutinación, se pueda refrigerar, pero se deben transfundir antes de las 24 horas de su recolección.(19) CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DEL PLASMA FRESCON CONGELADO Y DEL CRIOPRECIPITADO El plasma contiene albúmina, globulinas, factores de coagulación, agua y electrolitos. Algunos de los factores de coagulación (V y VIII) son termolábiles, por lo cual, para preservar su actividad, deben mantenerse congelados. El plasma fresco congelado, mantenido normalmente a -18 C o más bajo mantiene una acción óptica hasta por 12 meses; más allá de este período el Factor VIII puede perder actividad a tal grado que no está en condiciones para tratar la hemofilia A. Para el uso se debe descongelar a 37 C y transfundirlo en las siguientes 2 horas. No debe recongelarse pues deja de ser plasma fresco congelado. El crioprecipitado puede ser congelado igualmente a -18 C por 12 meses, desde la fecha de extracción de la sangre. Su potencia se conserva mejor si se congela y mantiene a -30 C. Para el uso debe ser descongelado rápidamente en bañomaría a 37 C, teniendo el cuidado de resuspenderlo completamente en el residuo de 10 a 15ml de plasma. Una vez preparado, debe administrarse lo más pronto posible. No debe ser recongelado. (19) Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela

83 Tanto para la conservación del plasma congelado como del crioprecipitado deben usarse controles para conocer si en un momento dado, estos productos fueron descongelados y vueltos a congelar. Los congeladores usados deben estar provistos de alarmas y registros gráficos que permitan conocer los cambios de temperatura que se hayan producido. 75

84

85 CAPÍTULO IV PRUEBAS PRETRANSFUNSIONALES Y EFECTOS ADVERSOS A LA TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA 4.1. PRUEBA DE LA ANTIGLOBULINA De los sistemas serológicas usados para demostrar la presencia de antígenos o anticuerpos de grupos sanguíneos, la prueba de antiglobulina humana o de Coombs es considerada como la más eficiente y de mayor valor en el banco de sangre. Se cree que el principio de la prueba de la antiglobulina fue inicialmente descrito por Moreschi en Sin embargo, la prueba sólo fue introducida en medicina transfusional hasta el año de 1945 cuando Coombs, Mourant y Race demostraron que por medio de ésta se podía detectar anticuerpos no aglutinantes anti-rh en el suero. Posteriormente los mismos autores demostraron la utilidad de la prueba para determinar la sensibilización in-vivo de los hematíes por anticuerpos, en niños que sufrían enfermedad hemolítica.(20) El suero antiglobulina se elabora inyectando colonias de conejos con gammaglobulina humana purificada para obtener antiglobulina humana y otras colonias son inyectadas con componentes purificados del complemento (C3), para originar anticuerpos específicos contra ellos (anti-c3 con actividad anti-c3d y con otros determinantes de C3). El conejo así sensibilizado con las globulinas humanas originará anticuerpos contra la IgG humana y contra el componente C3 del complemento (C3b + C3d). Si a los hematíes humanos sensibilizados in vivo o in vitro con IgG y/o C3d se los pone a reaccionar con el suero antiglobulina, éstos serán aglutinados demostrando la reacción antígeno-anticuerpo. En sinopsis, el principio de la prueba de la antiglobulina es determinar la sensibilización de los hematíes in vivo o in vitro por anticuerpos no aglutinantes (IgG) y /o fracciones del complemento (C3d). (20) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

86 La sensibilización de los glóbulos rojos se puede producir en dos formas: a) In vivo, es decir, cuando la reacción entre el antígeno y su correspondiente anticuerpo se efectúa en el organismo, mientras ambos están circulando, como por ejemplo, en casos de anemia hemolítica autoinmune, enfermedad hemolítica del recién nacido. b) In vitro, la sensibilización de los glóbulos rojos por el anticuerpo se realiza en un tubo de ensayo en el laboratorio, donde se mezclan e incuban eritrocitos adecuados con el suero en estudio. Si en el suero existen anticuerpos contra los antígenos presentes en los eritrocitos, se producirá la reacción antígeno anticuerpo y los glóbulos rojos quedarán sensibilizados PRUEBA DE LA ANTIGLOBULINA DIRECTA Principio del Método Esta prueba es también conocida como Coombs directo y su principio es determinar la sensibilización de los hematíes in vivo por anticuerpos no aglutinantes (IgG) y/o fracciones del complemento, específicamente C3d.(21) La prueba es útil para confirmar el diagnóstico de la enfermedad hemolítica del recién nacido(ehrn), la anemia hemolítica autoinmune(ahai), la anemia hemolítica inducida por medicamentos y en la investigación de las reacciones postransfusionales. La prueba de antiglobulina directa es sencilla de realizar y para tener resultados de calidad sólo basta con lavar escrupulosamente los hematíes para evitar interferencias, de igual forma es de vital importancia seguir al pie de la letra las instrucciones del fabricante del reactivo Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Pipetas de transferencia. (21) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

87 Un lápiz graso. Una centrífuga. Lámpara de lectura. Una gradilla para tubos. Suero de Coombs. Células control de Coombs (Las células control de Coombs son hematíes sensibilizados con IgG humana sirve para controlar la actividad del suero antiglobulina y la calidad del lavado de las células). Glóbulos rojos a analizar Ejecución del Ensayo a. Lavar y preparar suspensiones al 2-5% de los glóbulos rojos a analizar (ver pág. 12). b. En un tubo de 75 x 12mm dispensar: Tubo 1 Suspensión de hematíes 2-5% Suero de Coombs 1 gota 2 gotas c. Mezclar y centrifugar a 3.400rpm por segundos. d. Retirar el tubo y observar la presencia o ausencia de aglutinación con la ayuda de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado. e. Si no se observa aglutinación, incubar el tubo por 5-10 minutos a temperatura de laboratorio. f. Centrifugar para volver a leer. g. Colocar una gota de control de Coombs a los negativos, centrifugar y leer. Nota: Luego de la incubación a temperatura ambiente, algunos resultados pueden volverse positivos debido a sensibilización por complemento (C3d) óiga. Reportar resultado en número de (+) de aglutinación o negativo en su caso. 79

88 Interpretación Si la prueba de antiglobulina muestra aglutinación, se interpreta positiva, significa que hubo sensibilización in vivo de los eritrocitos y se informa: prueba de antiglobulina o de Coombs directo positiva, señalando en cruces la intensidad de la reacción, el cual va desde débil (d) hasta 4+. Si no hubo aglutinación, la prueba es negativa y significa que no existe autosensibilizacióneritrocitaria. La prueba de antiglobulina negativa será valida, solamente, si la prueba control de Coombs es positiva. En este caso, se informa: prueba de antiglobulina o de Coombs directo negativa PRUEBA DE LA ANTIGLOBULINA INDIRECTA Principio del Método El principio de la prueba de la antiglobulina indirecta, también conocida como Coombs indirecto es determinar la presencia de anticuerpos incompletos en un suero, los cuales actúan sobre determinados tipos de hematíes, detección de antígenos no demostrables por otras técnicas (Du). En la practica, los hematíes y el suero que contiene los anticuerpos y el complemento son incubados (tiempo y temperatura adecuados) bajo la acción de un potenciador que generalmente es albúmina, soluciones de bajo poder iónico o policationes. Seguidamente los hematíes son lavados para eliminar las inmunoglobulinas y/o el complemento no unido.posteriormente se hacen reaccionar los hematíes con el suero antiglobulina. Si estos hematíes son aglutinados por el suero antiglobulina humano, demuestra que han sido sensibilizados in vitro por anticuerpos tipo IgG y/o por complemento (C3d) Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Un lápiz graso. Pipetas de transferencia. Una centrífuga. 80

89 Lámpara de lectura. Bañomaría. Una gradilla para tubos. Suero antiglobulinapoliespecífico (anti-igg, C3d). Células control de Coombs (Las células control de Coombs son hematíes sensibilizados con IgG humana y sirven como control para la prueba. En especial controlan la actividad del suero antiglobulina y la calidad del lavado de las células). Suspensión de hematíes al 2-5%: Siempre usar GR 2-5% SSF tipo O Rh positivo, los que pueden ser preparadas de 5 ó 10 tipos diferentes de muestras O Rh positivas ó Células Rojas del 2-5% preparadas comercialmente, también llamadas Pantallas (Selectogen: nombre comercial). Suero fresco del paciente Ejecución del Ensayo A) Lavar y preparar suspensiones al 2-5% de los glóbulos rojos a analizar (ver pág. 12). B) Identificar dos tubos I y II, colocar: Tubo I Tubo II Glóbulos Rojos 2-5% I 1-2 gotas Glóbulos Rojos 2-5% II 1-2 gotas Suero del Paciente 2-3 gotas 2-3 gotas C) Agregar: Tubo I Tubo II Albúmina Bovina 2 gotas 2 gotas D) Mezclar, centrifugar 2000rpm durante 1-2 minutos y leer con la ayuda de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado. E) Incubar a 37 C por 30 minutos. F) Centrifugar y leer con la ayuda de una lámpara de lectura o contra un fondo blanco bien iluminado. G) Si no se observa hemólisis ni aglutinación, lavar los glóbulos rojos cuatro veces (ver pág. 12). 81

90 H) Si la prueba sigue siendo negativa, agregar: Tubo I Tubo II Suero Coombs 2 gotas 2 gotas I) Mezclar centrifugar y leer. J) En el caso que la prueba resulte negativa añadir una gota de control de Coombs, centrifugar y leer Interpretación de los Resultados Prueba de antiglobulina negativa + prueba control de Coombs positiva: Prueba de antiglobulina negativa. Prueba de antiglobulina negativa + prueba control de Coombs negativa: Prueba no válida Grado de Aglutinación de los Hematíes en la Prueba de la Antiglobulina Directa e Indirecta Grado de Aglutinación de los Hematíes en la Prueba de la Descripción Antiglobulina Directa e Indirecta 0 No hay aglutinación visible de los hematíes macro y microscópicamente después de agitar suavemente el tubo. d (w) La aglutinación de los hematíes después de agitar suavemente el tubo es escasa y a veces dudosa. Al observar al microscopio, se observan eritrocitos que aglutinan mientras que otros no lo hacen. 1+ El botón de hematíes se divide en numerosos pedacitos después de agitar suavemente el tubo. El fondo se observa muy coloreado (rojizo). 2+ El botón de hematíes de divide en varios trozos pequeños después de agitar suavemente el tubo. El fondo se observa coloreado (rojizo). 82

91 Grado de Aglutinación de los Hematíes en la Prueba de la Descripción Antiglobulina Directa e Indirecta 3+ El botón de hematíes se divide en varios trozos grandes después de agitar suavemente el tubo. El fondo es claro (verde). 4+ El botón de hematíes permanece intacto o se divide en dos o tres trozos después de agitar suavemente el tubo. El fondo es claro (verde claro si se usa suero antiglobulina coloreado). Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de PRUEBAS CRUZADAS Principio del Método Las pruebas cruzadas son pruebas sencillas pero de gran cuidado, que tienen como objetivo garantizar la compatibilidad serológica (in-vitro) entre la muestra de sangre del receptor y la unidad de sangre que se le pretende transfundir. La eficacia de las pruebas cruzadas radica en la afinidad que existe entre las pruebas de compatibilidad ejecutadas in-vitro y la sobrevida de los hematíes en la circulación del receptor. El propósito de las pruebas de compatibilidad es prevenir la transfusión de sangre incompatible, por lo tanto las pruebas cruzadas deben certificar: La compatibilidad ABO y Rh entre el receptor y la unidad que se pretende transfundir. Que en el suero del receptor no existan anticuerpos de importancia clínica contra los antígenos eritrocitarios del donante. Que en el plasma de la unidad de sangre no existan anticuerpos de importancia clínica contra los antígenos eritrocitarios del receptor. Las pruebas cruzadas han sido divididas en dos clases: 83

92 La prueba cruzada mayor: Es la más importante y tiene como objetivo determinar que en el suero del receptor no existan anticuerpos de importancia clínica contra los antígenos eritrocitarios del donante. La prueba cruzada menor: En esta se intenta determinar que en el suero o plasma del donante (unidad de sangre) no existan anticuerpos contra los hematíes del receptor. Esta prueba se puede dejar de realizar siempre y cuando el banco de sangre realice detección de anticuerpos inesperados de todos sus donantes. La ejecución de la prueba cruzada requiere de la realización de unos procedimientos previos entre los cuales se cuentan: La clasificación hemática ABO y Rh del receptor y el donante. La clasificación ABO sérica o inversa del receptor y el donante. El rastreo de anticuerpos inesperados a los donantes. Una vez realizados estos pasos previos, la prueba cruzada puede simplificarse a un solo tubo por unidad de sangre a cruzar (prueba cruzada mayor) Materiales, Reactivos y Muestra Tubos de 75 x 12mm. Portaobjetos. Lámpara de lectura. Pipetas de transferencia. Palillos o aplicadores desechables. Una centrífuga. Reloj alarma. Bañomaría. Antisueros comerciales Anti-A, Anti-B, Anti-A,B y Anti-D. Potenciadores: Puede usarse albúmina bovina al 22-30%, medios de bajo poder iónico (LISS), polietilenglicol (PEG)opolicationes (Polibreno, protamina). Suero antiglobulina humano monoespecífico (Anti-IgG) o poliespecífico (Anti-IgG, C3d), según el potenciador utilizado. 84

93 Células control de Coombs (sensibilizadas con IgG humana). Solución salina fisiológica 0.9% (SSF). Células pantalla I-II: Son células cuya composición antigénica es conocida y se usan para determinar la presencia de anticuerpos inesperados. De la unidad de sangre se toman hematíes cortando un segmento del tubo piloto de que está provista la bolsa plástica de recolección de sangre. La muestra del paciente debe ser:muestra anticoagulada con EDTA la cual servirá para rechequear los grupos sanguíneos ABO y Rh y para el autocontrol.muestra de suero que será utilizada para la prueba cruzada mayor y el rastreo de anticuerpos inesperados Ejecución del Ensayo a) Marcar tubos de 75 x 12mm: PCM = para la prueba cruzada mayor de cada unidad a transfundir. CI = para el rastreo de anticuerpos del paciente con células I. CII = para el rastreo de anticuerpos del paciente con células II. Auto = para el autocontrol de las células del paciente. Marcar además los tubos con la identificación de la unidad de sangre y del paciente (nombre o registro). b) Realizar una suspensión al 5% en solución salina fisiológica de las células del receptor (ver pág. 12). c) Realizar una suspensión al 5% en solución salina fisiológica de las células de la unidad de sangre (ver pág. 12). d) Verificar que el suero del receptor esté libre de células y no esté hemolizado. e) Dispensar células y suero en los tubos marcados en el primer paso según la siguiente tabla: ELEMENTO TUBOS PCM CI CII AUTO Células del paciente suspendidas al 5% en SSF 1 gota Suero del paciente 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas Células del donante suspendidas al 5% en SSF 1 gota Células I 1 gota Células II 1 gota 85

94 Una vez estén los elementos que van a reaccionar en cada tubo, la prueba cruzada al igual que el rastreo de anticuerpos inesperados en el paciente se realiza en las siguientes fases: f) Fase de salina a temperatura ambiente Una vez dispensadas las células y el suero en los tubos correspondientes, centrifugar por segundos a 3.400rpm. Resuspender suavemente los botones de células para evidenciar la presencia o ausencia de aglutinación macroscópica. Utilizar una lámpara de lectura o un fondo blanco bien iluminado. Este paso sirve para determinar la presencia de aglutininas frías. Dado que la mayoría de aglutininas frías diferentes a las del sistema ABO carecen de importancia clínica, esta fase puede ser omitida. g) Fase de potenciador a 37 C Añadir a todos los tubos LISS en cantidad indicada por el fabricante del reactivo ó 1-2 gotas de albúmina bovina al 22-30%. Mezclar e incubar a 37 C por 30 minutos. Si utiliza LISS incubar minutos o el tiempo que indique el fabricante del reactivo. Este paso se ejecuta para promover la sensibilización de los hematíes con anticuerpos no aglutinantes (IgG). Una vez cumplido el tiempo de incubación, centrifugue los tubos a 3.400rpm por segundos. Examinar el sobrenadante para evidenciar la presencia de hemólisis. Anotar los resultados. Resuspender suavemente los botones de células para evidenciar la presencia o ausencia de aglutinación macroscópica. Utilizar una lámpara de lectura o un fondo blanco bien iluminado. Anotar los resultados. h) Fase de lavado Lavar las células 3-4 veces con suficiente solución salina fisiológica. Para realizar un buen lavado tener en cuenta: Llenar los tubos con solución salina fisiológica hasta 1cm por debajo de la boca. Para lavar centrifugar a 3.400rpm por 1 minuto. Decantar completamente la solución salina fisiológica entre lavado y lavado. Resuspender suavemente el botón de células antes de iniciar un nuevo ciclo de lavado. 86

95 i) Fase de antiglobulina humana (AGH) Añadir a los tubos (libres de residuo de SSF) 2 gotas de suero antiglobulinapoliespecífico. Mezclar suavemente. Centrifugar los tubos a 3.400rpm por segundos. Resuspender suavemente los botones de células para evidenciar la presencia o ausencia de aglutinación macroscópica. Utilice una lámpara de lectura o un fondo blanco bien iluminado. Anotar los resultados. Si es necesario, verificar los resultados observando una alícuota al microscopio. j) Fase de control A los tubos en los cuales no se observa aglutinación de los hematíes añadir 1 gota de células sensibilizadas con IgG (células control de Coombs). Centrifugar a rpm por segundos. Resuspender suavemente los botones y observar la presencia de aglutinación (1+ a 2+). Anotar los resultados. Si no observa aglutinación en esta fase la prueba no es válida y debe repetirse desde el comienzo Interpretación de los Resultados Se considera que existe compatibilidad serológica entre el suero del paciente y los hematíes del donante si en el tubo marcado como prueba cruzada mayor (PCM) no se observa hemólisis y/o aglutinación en ninguna de las fases anotadas, excepto en la de control. La ausencia de hemólisis y/o aglutinación en los tubos marcados CI y CII indica que el paciente no posee anticuerpos inesperados detectables contra los antígenos expresados en esas células pantalla. Observar aglutinación en el tubo marcado Auto (autocontrol) puede indicar que el paciente posee autoanticuerpos sensibilizando sus propios hematíes. El cuadro muestra algunas de las posibilidades de los resultados que se pueden obtener al realizar los procedimientos de la prueba cruzada y rastreo de anticuerpos inesperados en el receptor, e indica si la sangre puede o no ser transfundida y que otros procedimientos se deben efectuar. 87

96 Lectura de los tubos en la fase de AGH INTERPRETACIÓN CONDUCTA PCM CI CII AUTO El suero del receptor no posee anticuerpos La unidad de sangre puede contra los antígenos de los hematíes del ser transfundida. dónate y de las células pantalla I y II. Los hematíes del receptor no están autosensibilizados son IgG y/o C3d El suero del receptor no posse anticuerpos La unidad de sangre puede contra los antígenos de los hematíes del ser transfundida. sonante y las células pantalla I y II. Hacer elución de los Los hematíes del receptor están hematíes del receptor e sensibilizados con autoanticuerpos. El identificar el autoanticuerpo antígeno para el cual está dirigido el a partir del eluato. autoanticuerpo no se encuentra en los hematíes del donante ni en las células pantalla I y II El receptor tiene uno o más aloanticuerpos La unidad de sangre puede en el suero dirigidos contra uno o más ser transfundida. antígenos presentes en las células I y II. Identificar el o los El receptor no posee aloanticuerpos contra aloanticuerpos. los antígenos de los hematíes del donante El receptor tiene La unidad de sangre puede autoanticuerpossenbilizando sus hematíes. ser transfundida. Es posible que el antígeno para el cual está Realizar la identificación del dirigido el autoanticuerpo esté presente en autoanticuerpo y descartar las células I y II, sin embargo no se puede la presencia de descartar la presencia de aloanticuerpos aloanticuerpos. contra los antígenos de las células I y II. El receptor no posee aloanticuerpos contra los antígenos de los hematíes del donante El receptor tiene autoanticuerpos La unidad de sangre no sensibilizando sus hematíes. puede ser transfundida. Es posible que el antígeno para el cual está Realizar la identificación de dirigido el autoanticuerpo esté presente en autoanticuerpos y descartar las células I, II y en las del donante. Sin la presencia de 88

97 embargo, no se puede descartar la presencia aloanticuerpos. de aloanticuerpos contra los antígenos de las células I, II y del donante Presencia de uno o más aloanticuerpos La unidad de sangre no dirigidos contra uno a más antígenos puede ser transfundida. presentes en las células I, II y del donante. Realizar la identificación de aloanticuerpos En algunas ocasiones, pueden ocurrir La unidad de sangre no reacciones positivas en las pruebas cruzada puede ser transfundida. pero no en el rastreo de anticuerpos Dependiendo de la fase en inesperados. Esto puede deberse a que se detecte la anticuerpos clínicamente significativos en el incompatibilidad podría ser receptor contra los antígenos eritrocitarios necesario realizar: del donante. El o los antígenos para el cual están dirigidos el o los anticuerpos no se encuentran en las a) Rechequeo de clasificación ABO del receptor y donante. células I y II. Sin embargo, y dado que las b) Realizar Coombs directo células I y II poseen los antígenos de mayor importancia clínica, esta situación debe ser investigada. a las células del donante. c) Identificar el aloanticuerpo en el suero del receptor. PCM = Prueba cruzada mayor; CI = Células pantalla I; CII = Células pantalla II; Auto = Autocontrol; 0 = No aglutinación; + = Diferentes grados de aglutinación. Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de COMPLICACIONES INFECCIOSAS DE LA TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA El objetivo más importante en la transfusión sanguínea es reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas tanto como sea posible. Sin embargo, por ser la sangre un producto biológico obtenido de humanos, ese riesgo nunca podrá ser igual a cero. Dentro de las complicaciones infecciosas asociadas a la transfusión sanguínea, se encuentra la transmisión de enfermedades infecciosas virales, bacterianas y parasitarias. 89

98 Actualmente el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas de origen viral como la hepatitis B y C, el HIV y el HTLV-I, ha mermado considerablemente debido a las pruebas de tamizaje de marcadores infecciosos que se le realizan a todas las unidades de sangre donadas y a una mejor y adecuada selección de los donantes voluntarios y repetidos. Otros agentes infecciosos virales como el Citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr (EBV) y el virus de la hepatitis D (HDV o agente delta), no son determinados de rutina en las unidades de sangre donadas, razón por la cual la transfusión de sangre o sus derivados siempre implica un riesgo para el receptor.(22) Elcontagio de las unidades de sangre donadas por agentes bacterianos, normalmente ocurre en el momento de la recolección de la sangre debido a una incorrecta sepsia del área de venopunción. La propagación bacteriana ocurre durante laetapa de almacenamiento, siendo mayor en los componentes que son almacenados a temperatura de laboratorio como las plaquetas, en comparación con los componentes que son refrigerados o congelados. La transfusión de sangre contaminada con bacterias conlleva a una septicemia que lo puede conducir a la muerte, o puede causar reacciones severas y fatales que son el reflejo de endotoxinas producidas por microorganismos gran-negativos como las Pseudomonassp., Citrobacterfreundii, Escherichiacoli y Yersiniaenterocolitica. La transmisión de la espiroqueta Treponema pallidum, agente etiológico de la sífilis es muy raro que ocurra, porque para determinar su presencia se realizan rutinariamente exámenes (VDRL RPR) y porque este microorganismo sobrevive pocos días en la sangre almacenada entre 1 y 6 C. La transmisión de agentes infecciosos parasitarios a través de la sangre se encuentra en los casos de malaria y la enfermedad de Chagas.Una manera de evitar la transferencia de malaria, es diferir temporalmente como donante de sangre a los individuos que residan o visiten zonas endémicas. (22) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

99 Es conveniente recordar que los plasmodium sobreviven al menos una semana en los hemoderivados que se almacenan a 4 C.Por otra parte, la transmisión a través de las transfusiones sanguíneas, de la enfermedad de Chagas o Trypanosomiasis Americana, causada por el Trypanosomacruzi debe considerarse en aquellas áreas urbanas en las que la enfermedad es endémica. El Trypanosomacruzi es un protozoario que se ha encontrado de manera endémica en centro y sur América.(23) 4.4. COMPLICACIONES NO INFECCIOSAS DE LA TRANSFUSÍON SANGUÍNEA Las complicaciones no infecciosas de la transfusión sanguínea contienen una serie de reacciones adversas que van desde leves hasta fatales para el paciente.las reacciones adversas a la transfusión sanguínea pueden ser divididas en agudas y tardías. REACCIÓN TRANSFUSIONAL MEDIADA INMUNOLÓGICAMENTE NO MEDIADA INMUNOLÓGICAMENTE AGUDA Reacción transfusional hemolítica. Reacción transfusional febril. Reacción transfusional alérgica. Reacciones anafilácticas. Daño pulmonar agudo. Hemólisis. Sepsis. Sobrecarga circulatoria. Complicaciones en la transfusión masiva (Coagulopatíadilucional, CID, Inmunomodulación de la respuesta alteración en la función de la inmune. hemoglobina, etc.). Reacción transfusional hemolítica. Aloinmunización. Transmisión de enfermedades infecciosas: Refractoriedad a la transfusión de HIV 1, 2. TARDIA plaquetas. HTLV-I. Enfermedad del injerto contra el Hepatitis B, C, D. huésped. CMV. Inmunomodulación de la respuesta Malaria, Chagas. inmune. Sepsis bacteriana. Fuente:El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Colombia. Enero de (23) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

100 4.5. COMPLICACIONES AGUDAS DE LA TRANSFUSÍON SANGUÍNEA MEDIADAS INMUNOLÓGICAMENTE A. Reacción Transfusional Hemolítica Aguda Se refiere al cuadro clínico que presenta el receptor debido a la destrucción de los glóbulos rojos, secundaria a una reacción antígeno-anticuerpo con la activación del complemento in vivo. La hemólisis sucede en el espacio intravascular y los síntomas son duros y se presentan tras la transfusión de los primeros mililitros de sangre incompatible.esta reacción transfusional se presenta por la infusión de sangre ABO incompatible en el receptor. En este caso, los síntomas son severos y pueden conducir al paciente a la muerte. Los síntomas y signos más comunes son: Fiebre, escalofríos, hipotensión, náuseas, vómito, fatiga, dolor en el sitio de la punción, dolor en el pecho, cefalea y hemoglobinuria. En los casos severos se presenta sangramiento, shock y la muerte. La activación del complemento y las plaquetas incita la producción de aminas vasoactivas (histamina y serotonina), que contribuyen a generar hipotensión. La hipotensióncreadaestimula una respuesta del sistema nervioso simpático, liberando catecolaminas que causan vasoconstricción en órganos como los riñones, bazo y pulmones. El factor de Hageman activado ejerce sobre el sistema de las kininas formando bradikinina, lo que aumenta la permeabilidad capilar y origina una falla sistémica en la presión arterial. La activación del mecanismo intrínseco de la coagulación a través del factor de Hageman puede llevar a la formación de trombina en la microcirculación, lo que perjudica los tejidos y órganos. De igual forma, se provoca un consumo de fibrinógeno, plaquetas y factores V y VII y se liberan productos de la degradación de la fibrina lo que conduce eventualmente a una coagulopatíaintravascular diseminada (CID). 92

101 La más importante consecuencia de la reacción hemolítica aguda intravascular (RHAIV), es la falla renal producido por la hipotensión sistémica, la vasoconstricción y la formación de trombina intravascular. La principal causa de la reacción hemolítica aguda intravascular es la transfusión de sangre ABO incompatible debido a un error en la identificación del receptor en el momento de la toma de muestra para las pruebas de compatibilidad, o a la mala identificación en el momento de la transfusión. La frecuencia de las reacciones hemolíticas agudas se ha estimado en 1 por cada unidades de sangre transfundidas, estas reacciones transfusionales pueden ocurrir también cuando se transfunden grandes volúmenes de plasma ABO incompatible, por ejemplo, cuando se transfunde plasma de grupo O a un receptor A o B. Los síntomas y signos observados en este caso son generalmente menos severos. Por otro lado, las reacciones transfusionales hemolíticas agudas debida a anticuerpos diferentes a los del sistema ABO se caracterizan por ser menos severas, debido a que la hemólisis por lo general ocurre en el espacio extravascular. B. Reacción Transfusional de Tipo Febril La fuente más frecuente de este tipo de reacción transfusional es la presencia de anticuerpos presentes en el receptor dirigidos contra antígenos presentes en linfocitos, granulocitos y plaquetas. Los individuos más aptos a este tipo de reacción transfusional son mujeres multíparas y pacientes con historia de transfusiones crónicas. Algunas reacciones febriles han sido relacionadas a la transfusión de componentes sanguíneos en los que se han generado citokinas durante el almacenamiento. Estaconsecuencia ha sido demostrada en la infusión de concentrados de plaquetas. La reacción febril puede comenzar a los minutos de iniciada la transfusión, así como horas después de haberse completado la misma. 93

102 El incremento de la temperatura es de 1 C o más, pero puede también observarse incrementos tan bajos como 0,5 C. La frecuencia estimada de las reacciones febriles es de 0,5-1,5% y están acompañadas por escalofríos.una manera eficaz para prevenir las reacciones febriles es el uso de filtros desleucocitadores, los cuales retienen selectivamente los leucocitos de los componentes celulares. El tratamiento de las reacciones febriles está orientado a disminuir los síntomas, los cuales responden a antipiréticos. Es conveniente que ante una reacción febril, se suspenda la transfusión sanguínea, sobre todo cuando no sea posible determinar si los síntomas y signos observados están asociados a reacciones hemolíticas o por contaminación bacteriana de la sangre. C. Reacción Transfusional de Tipo Alérgico Las reacciones alérgicas a la transfusión sanguínea, generalmente se presentan como un brote, urticaria y prurito. Este tipo de reacción ocurre entre el 1-2% de todas las transfusiones. La principal causa de las reacciones alérgicas es la presencia de anticuerpos IgE dirigidos contra inmunoglobulinas contenidas en el plasma transfundido. Igualmente, la presencia de sustancias solubles en el plasma transfundido (alimentos, medicamentos, etc.) pueden ser la causa de algunas reacciones alérgicas.para prevenir las reacciones alérgicas de esta clase, se puede administrar antihistamínicos antes de la transfusión. En casos severos y reincidentes es conveniente para el paciente la administración de glóbulos rojos lavados. D. Reacciones Anafilácticas Este tipo de reacción comienza después de la infusión de los primeros mililitros de sangre. Los síntomas están asociados a la afección de varios sistemas entre los cuales están el tracto respiratorio, el sistema circulatorio, la piel y el sistema gastrointestinal. Los síntomas más comunes son: Vómito, náuseas, broncoespasmo, fatiga, hipotensión y urticaria. 94

103 La reacción anafiláctica, aunque no muy común, acontece en individuos deficientes de IgA y que han formado anticuerpos anti-iga.se ha considerado que las reacciones anafilácticas debido a la presencia de anticuerpos anti-iga ocurren en un caso de cada unidades transfundidas. E. Daño Pulmonar Agudo Asociado a la Transfusión Es un suceso del que no se conoce con claridad su frecuencia y que probablemente poco se reporta en la transfusión sanguínea. Radica en una insuficiencia respiratoria aguda en el paciente, el cual muestra a los rayos X edema pulmonar sin evidencia de falla cardíaca.los síntomas incluyen escalofríos, fiebre, cianosis e hipotensión. La etiología del daño pulmonar parece estar asociada a múltiples mecanismos entre los que se cuenta la transfusión pasiva de anticuerpos contra los granulocitos o los antígenos HLA del receptor. Estos anticuerpos reaccionan con los granulocitos del receptor y luego se depositan en los capilares pulmonares causando inflamación y aumento de la permeabilidad de la microcirculación pulmonar, lo que conduce a entrada de líquido en el espacio alveolar. (24) La mayoría de casos involucra anticuerpos en el plasma del donante dirigido contra los granulocitos del receptor. El caso contrario, es decir, anticuerpos en el receptor contra los granulocitos transfundidos muy ocasionalmente han producido daño pulmonar agudo COMPLICACIONES AGUDAS DE LA TRANSFUSÍON SANGUÍNEA NO MEDIADAS INMUNOLÓGICAMENTE a. Hemólisis La hemólisis de los hematíes no mediada inmunológicamente sucedehabitualmente por inadecuado almacenamiento de la sangre a temperaturas extremas. (24) DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de

104 Igualmente, la hemólisis puede ocurrir cuando la sangre a transfundir es mezclada con medicamentos o soluciones hipotónicas, cuando es transfundida a presión son agujas de pequeño calibre o por su mal empleo en los equipos de circulación extracorpórea. Los síntomas y signos observados en la hemólisis no mediada inmunológicamente no son tan característicos como las reacciones mediadas por anticuerpos. Pero, la causa de la hemólisis debe ser investigada para corregir las fallas y para tener la seguridad de que en la hemólisis no están involucrados mecanismos inmunes. b. Sepsis La sepsis asociada a la transfusión sanguínea es producida por la transfusión de sangre obtenida de donantes con bacteriemias transitorias asintomáticas o por la contaminación bacteriana de la sangre por inapropiada limpieza de la piel del sitio de venopunción. Entre los microorganismos asociados a sepsis postransfusional se hallan la Yersiniaenterocolítica, Salmonella sp., Staphylococcusepidermidis y Bacilluscereus. Los componentes sanguíneos implicados en sepsis postransfusional son las plaquetas, debido a su temperatura de almacenamiento la cual ayuda al crecimiento bacteriano. Los síntomas y signos clínicos en pacientes que han recibido componentes sanguíneos contaminados dependen del número de microorganismos transfundidos. Normalmente los síntomas se observan entre 0-30 minutos de iniciada la transfusión e incluyen cefalea, ansiedad, escalofríos, vómito y diarrea. En casos graves puede ocurrir shock, coagulación intravascular diseminada, falla cardíaca congestiva y la muerte. Cuando se sospecha de un suceso de este tipo, se deben ordenar hemocultivos al paciente y comparar los resultados con los cultivos realizados a los componentes involucrados en la reacción. c. Sobrecarga Circulatoria La transfusión sanguínea puede conducir a sobrecarga circulatoria, principalmente en aquellos pacientes con enfermedad cardíaca o renal o en pacientes normovolémicos con anemia crónica. 96

105 Los síntomas y signos clínicos incluyen: Fatiga, taquicardia, dolor de cabeza, hipertensión y falla cardiaca congestiva. Para evitar las reacciones por sobrecarga circulatoria, los componentes a transfundir pueden ser divididos en volúmenes más pequeños y transfundirse a goteos lentos en un tiempo igual o superior a 4 horas. d. Complicaciones en la Transfusión Masiva Se define como el reemplazo de la volemia total del individuo en un lapso de 24 horas o menos. Diversas complicaciones pueden ocurrir durante y después de la transfusión masiva de hemoderivados. Entre las complicaciones agudas se cuentan: La coagulopatíadilucional, coagulación intravascular diseminada, hipocalcemia, hiperkalemia, hipotermia, disminución del 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG), lo que conduce a una pobre liberación del oxígeno a los tejidos. 97

106 BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA DUEÑAS, Víctor Hugo. El Banco de Sangre. Teoría, Principios y Procedimiento. 2ª edición, Universidad del Valle Programa Editorial, Impreso en Cali, Colombia. Enero de Dr. LINARES, Jesús. Inmunohematología y Transfusión Principios y Procedimientos. 1ª edición, Impreso por cromotip C.A., Caracas, Venezuela Organización Panamericana de la Salud. Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud. Publicación Cientifica No. 439, Tomo II, Washington, D.C.,EUA Dr. LYNCH, Mattnew. Métodos de Laboratorio. 2ª edición, Editorial Interamericana, S.A. de C.U. México CISCAR, Federico y FARRERAS, Pedro. Diagnóstico Hematológico Laboratorio y Clínica. Tomo I. 3ª edición, Editorial JIMS, Barcelona IRWIN A. OPPEN HEIM. Manual para Tecnólogo de Laboratorio. Editorial Médica Panamericana. Argentina

107 CONCLUSIÓN GENERAL Gracias al trabajo de investigación realizado se pudo comprender que la indagación complementaria solicitada al laboratorio clínico por un médico para confirmar o descartar un diagnóstico es denominado análisis clínico o prueba de laboratorio También se logro comprender que el análisis clínico se interpreta mediante valores de referencia establecidos para cada población y requiere de una interpretación médica. Los autores de los libros y páginas de internet estudiados indican que algunos de los aspectos que se emplean para tal explicación son: la especificidad, la sensibilidad, el valor predictivo, la exactitud, precisión y validez, así como la preparación y recogida de la muestra o el rango de referencia. La era de la globalización y tecnificación han conseguido que actualmente en los laboratorios, dominan los analizadores clínicos automatizados, computarizados y especializados en diferentes campos analíticos como: hematología, hemograma, bioquímica clínica, urianálisis, microbiología y genética entre otras. Fue de suma importancia analizar y comprender que gracias al estudio del sistema ABO, se describen los diferentes grupos sanguíneos presentes en la población humana. Se puede definir los grupos formados de la siguiente manera: El grupo O, no contiene ningún aglutinógeno en sus hematíes y posee en cambio dos aglutininas sérica a y b. Sus hematíes no pueden ser aglutinados por otros sueros, pues se trata del grupo de donadores universales. El grupo A posee el aglutinógeno eritrocítico A y la aglutinina b. El grupo B posee la aglutinina a y el aglutinógeno B. El grupo AB, posee ambos aglutinógenos en sus eritrocitos, pero el suero no posee aglutininas; el suero de estas personas, por consiguiente no aglutinan ninguna sangre humana, por lo cual pueden recibirla indistintamente de cualquier persona, considerados como receptores universales. Con el continuar de la investigación bibliográfica y los conocimientos recibidos en la facultad de Bioquímica fue fácil entender la existencia de subgrupos de los tipos de sangre. 99

108 CONCLUSIONES ESPECÍFICAS UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA a) Describir y determinar el Sistema ABO: Me interesé en aprender que el sistema ABO es el más importante dentro del estudio de los grupos sanguíneos descubierto por Landsteiner, quien indico que los glóbulos rojos humanos se aglutinaban al ponerlos en reacción con el suero proveniente de otras personas, con lo cual se explico las causas de incompatibilidad sanguínea. Se logró concluir que existen cuatro tipos de glóbulos rojos: A, B, AB y O.El grupo A posee el antígeno A y el anticuerpo anti-b, dentro del antígeno A se encuentran los subgrupos A 1 y el A 2. El grupo B, presenta el antígeno B y el anticuerpo anti-a, dentro los subgrupos del antígeno B se hallan B 3, B x y B el. El grupo Oposee el antígeno H y los anticuerpos anti-a y anti-b. El grupo AB cuenta con los dos antígenos A y B pero carece de anticuerpos anti-a y anti-b en su suero. Dentro de las técnicas para realizar la determinación de los antígenos ABO en la superficie de los hematíes se encuentran los métodos por medio de antisueros y de eritrocitos estandarizados, en tanto que los métodos para determinar los anticuerpos del sistema ABO se hallan la determinación de los anticuerpos anti-a y anti-b y el método para la determinación de los subgrupos de A: A 1 y A 2. b) Indicar los métodos de determinación del Sistema Rh. Aprendí que el sistema Rh es el segundo más importante del estudio de los grupos sanguíneos. Las personas cuyas células son aglutinadas por el suero anti-rhesusson clasificadas como Rh positivo y como Rh negativo. De igual manera conocí las diversas técnicas para realizar una adecuada prueba, dentro de estos análisis encontramos la determinación del antígeno Dtanto en placa de hemoclasificación,como en tubo de ensayo y la determinación de la expresión débil del antígeno D. Igualmente conocí que todo muestra con resultado negativo en el sistema Rh se le debe realizar el test para determinar la expresión débil del antígeno D (variante D u ), exceptuando las muestras de sangre provenientes de recién nacidos. 100

109 c) Identificar los procesamientos de los componentes sanguíneos UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Aprendí las diferentes técnicas, con los que se separan los componentes sanguíneos que se emplean en el Banco de Sangre; entre estos compuestos que se emplean para las transfusiones encontramos concentrados de glóbulos rojos, concentrados de plaquetas, plasma fresco congelado, el crioprecipitado, plasma simple, los que son administraddos de acuerdo a su requerimiento. Todos estos componentes requieren de una adecuada conservación, para evitar su contaminación, alteración y posterior pérdida de su acción, dicha conservación se realiza mediante refrigeración adecuada mediante un sistema de alarmas y termómetros de mercurio, revisando y limpiando periódicamente este equipo. Para una adecuada obtención de tales componentes es conveniente tener en cuenta que se debe saber bien la clase de unidad sanguínea que se va a obtener, para esto es necesario realizar una entrevista y examen físico adecuado al donante. d) Valorar los efectos adversos a la transfusión sanguínea. Al realizar las transfusiones sanguíneas se debe tener presente los efectos adversos que podrían presentar los receptores, el objetivo básico en la transfusión sanguínea es reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas tanto como sea posible. Sin embargo, por ser la sangre un producto biológico obtenido de humanos, ese riesgo nunca podrá ser igual a cero. En lo posible hay que evitar que este proceso llegue a ser traumático para el paciente, para posteriores transfusiones. Dentro de estos efectos adversos encontramos las complicaciones infecciosas con lo cual se puede transmitir enfermedades infecciosas virales, bacterianas y parasitarias.las complicaciones no infecciosas, que pueden ser agudas como son las reacciones hemolíticas, febriles, alérgicas, daño pulmonar, hemólisis, sobrecarga circulatoria, al igual que pueden ser tardías como la transmisión de enfermedades entre ellas HIV 1, 2; Hepatitis B, C, D;CMV,malaria, chagas, sepsis bacteriana. 101