ESTUDIA UN DÍA BIOTECNOLOGÍA EN LA UMH

Transcripción

1 ESTUDIA UN DÍA BIOTECNOLOGÍA EN LA UMH Asignatura: Práctica: Extracción y electroforesis de ADN Profesores: Pedro Robles y Víctor Quesada 1

2 Introducción Se denomina Biotecnología a la utilización de los seres vivos, partes de estos, o los procesos que en ellos ocurren para generar productos de interés. La obtención del yogur a partir de la leche, o la del vino a partir del mosto de las uvas, es biotecnología. Ambos procesos utilizan microorganismos, bacterias o levaduras en este caso, para llevar a cabo fermentaciones. Se puede decir que la biotecnología alimentaria es la más antigua, pues es una actividad milenaria llevada cabo ya por culturas como la egipcia. Los avances sobre los conocimientos de la composición, estructura y función de los ácidos nucleicos, ADN y ARN, hace que a finales del siglo XX surja la biotecnología molecular, o moderna, basada en la manipulación de los ácidos nucleicos para producir proteínas en el interior de células eucariotas o procariotas. La producción de insulina humana en el interior de bacterias a las que se había introducido el gen que codifica dicha proteína, fue el primer gran hito de la biotecnología molecular, y permitió salvar muchas vidas humanas. 1ª parte. Electroforesis de ácidos nucleicos Con esta práctica vamos a aprender los primeros pasos de cualquier proceso biotecnológico que implique el uso y manipulación del ADN: su aislamiento y visualización. Los ácidos nucleicos, en particular el ADN, son los portadores de la información que necesitan las células para llevar a cabo sus funciones. Habitualmente son moléculas muy largas, cargadas negativamente, compuestas de unidades denominadas nucleótidos. Las cantidades pequeñas de ADN no pueden ser visualizadas a simple vista. Además, cuando se obtiene ADN de una determinada muestra biológica o como resultado de una prueba que genera copias de esta molécula, el ADN suele encontrarse en una disolución acuosa que contiene moléculas de ADN de distintos tamaños que no pueden distinguirse a simple vista. Con la finalidad de visualizar el ADN y separar unas moléculas de otras, se realiza una electroforesis. Se trata de una técnica de separación de moléculas que consiste en hacer migrar a los ácidos nucleicos a través de una matriz porosa formada por un gel de agarosa (un polisacárido obtenido a partir de algas). Con el siguiente protocolo vamos a aprender cómo realizar una electroforesis de ácidos nucleicos en un gel de agarosa. MEDIDAS DE PRECAUCIÓN EN EL LABORATORIO Aunque ninguno de los reactivos que se utilizarán en esta práctica es particularmente tóxico, todas las manipulaciones se llevarán a cabo con las manos protegidas por guantes de laboratorio desechables. Igualmente, utilizaremos batas desechables para proteger nuestra ropa y no mancharnos. Etapas del proceso de preparación de un gel de agarosa: se encuentran registradas gráficamente en el panel fotográfico que encontrarás al final de este guión 1. Pesar 0,5 g de agarosa que contendrá el gel. A mayor cantidad de agarosa más denso será el gel y menor el tamaño de los poros. Las moléculas grandes de ácidos nucleicos migran con más dificultad que las pequeñas a través de los poros, de manera que al transcurrir posteriormente la electroforesis se irán separando por su tamaño. 2. Depositar la agarosa en un matraz de vidrio de 200 ml. 3. Añadir a la agarosa 50 ml de tampón de electroforesis: una disolución salina que permite el paso de la corriente eléctrica a través del gel. La agarosa no es soluble en este tampón a temperatura ambiente. La concentración de agarosa en nuestro gel es del 1% (0,5 g/50 ml). 2

3 4. Disolver la agarosa en el tampón de electroforesis mediante calor, utilizando un microondas. Se calentará el matraz con la agarosa y el tampón hasta que la agarosa se disuelva completamente. Se evitará que hierva para que la disolución no rebose del matraz. 5. Preparar un portageles sellado por ambos extremos utilizando un sellador. Se trata de una cubeta que contendrá la agarosa disuelta en el tampón. En uno de los extremos del portageles se colocará un peine con el número de dientes y el tamaño adecuado para producir los agujeros (pocillos) en los que se cargarán las muestras a analizar. El peine que utilizaremos en nuestro gel posee 6 dientes. 6. Adicionar a la agarosa líquida 2 microlitros de un agente intercalante denominado Safeview. Se empleará para ello una micropipeta, un instrumento que se usa en los laboratorios para manejar volúmenes muy pequeños, del orden de los microlitros (1 microlitro = 1 µl= 10 6 l). Utilizaremos una micropipeta que permite tomar volúmenes de entre 2 y 20 µl y se le acoplará en su extremo una punta desechable de color marillo. El Safeview es una sustancia que se introduce en el interior de las moléculas de ácido nucleico y que permitirá visualizarlas en el gel tras su irradiación con luz ultravioleta. A diferencia de otros agentes intercalantes el Safeview no es mutagénico. 7. Verter la agarosa líquida en el portageles ayudándose de un guante grueso de tela o un papel para no quemarnos. 8. Esperar unos minutos para que el gel se solidifique a temperatura ambiente. A continuación retirar el peine con mucho cuidado tirando de él hacia arriba. Sacar el portageles de la pieza selladora. Etapas de la electroforesis 9. Introducir el gel en una cubeta de electroforesis, que consta de un receptáculo para el gel y para el tampón de electroforesis, y de una tapa. En sus extremos, la cubeta presenta un polo negativo (negro) y uno positivo (rojo). El gel se orientará de forma que los pocillos queden más próximos al polo negativo que al positivo. 10. Rellenar la cubeta con el mismo tampón de electroforesis empleado en la preparación del gel. Comprobar que el gel queda completamente cubierto por el tampón de electroforesis. 11. Preparar las muestras de ácidos nucleicos que proporcionará el profesor y que se someterán a electroforesis. Para ello se añadirá a cada una de ellas un tampón de carga. Se trata de una mezcla de dos colorantes azulados y de una sustancia de elevado peso molecular (ficoll). Los colorantes ayudan a la manipulación de las muestras y permiten visualizar su movimiento durante la electroforesis. El ficoll aumenta la densidad de las muestras y ayuda a que entren en los pocillos del gel. 12. Cargar las muestras en el gel utilizando una micropipeta. Para pipetear las muestras utilizaremos una micropipeta que permite tomar volúmenes de entre 2 y 20 µl y se le acoplará en su extremo una punta desechable de color amarillo. En cada uno de los pocillos se depositará (cargará) una muestra diferente con un volumen final de 12 µl. En uno de los pocillos se cargará una muestra correspondiente al marcador de peso molecular, una colección de moléculas de ADN de tamaño conocido que permite calcular (aproximadamente) los tamaños de las moléculas de ADN de las muestras por comparación de su migración. En la siguiente página se muestra una fotografía del marcador de peso molecular utilizado en esta práctica. 3

4 Foto de una Micropipeta 13. Una vez cargado el gel, cerrar la cubeta de electroforesis con la tapa haciendo coincidir los respectivos polos (rojo con rojo y negro con negro). La cubeta está conectada a una fuente de electroforesis que permite seleccionar el voltaje al que realizar la electroforesis. Cuanto mayor sea el voltaje, las muestras migrarán más rápidamente hacia el polo positivo (rojo). Para geles pequeños como el que vamos a utilizar seleccionaremos un voltaje de 100 V. 14. Tras unos treinta minutos, observar la migración de las muestras. Los colorantes azules habrán migrado hacia el polo positivo al estar cargados negativamente, al igual que los ácidos nucleicos de las muestras. Aunque no podemos verlos directamente en el gel, la migración de los colorantes nos sirve como referencia para inferir el desplazamiento de los ácidos nucleicos. 15. Finalmente, extraer el gel de la cubeta de electroforesis e introducirlo un documentador de geles. Se trata de un aparato que consta de una fuente de luz ultravioleta que se encuentra en el interior de una cámara oscura conectada a una cámara fotográfica. El Safeview unido a los ácidos nucleicos del gel absorbe la energía de la luz ultravioleta y la devuelve en forma de luz verde que es captada por la cámara y nos permite visualizarlos en un monitor. Se imprimirá una fotografía del gel que entregará el profesor y se interpretará siguiendo sus explicaciones. Fotografía del gel de agarosa tras electroforesis (a la derecha se muestra el marcador de peso molecular) 4

5 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Calle 1: Calle 2: Calle 3: Calle 4: Calle 5: Calle 6: 2º parte. Extracción de ADN de fresas. Además de la electroforesis, en esta práctica vamos a aprender a extraer ácidos nucleicos de una manera casera, empleando un procedimiento muy sencillo que cualquiera puede llevar a cabo en su casa y que ejemplifica a la perfección los procedimientos de extracción más laboriosos realizados en los laboratorios de Genética. Protocolo de extracción de ADN a partir de fresas: se encuentra registrado gráficamente en el segundo de los paneles fotográficos que encontrarás al final de este guión. 1. Preparación de los materiales para llevar a cabo la extracción a partir de fresas: 2 fresas Agua Detergente líquido para platos Alcohol de botiquín Sal Un colador Unos vasos y cucharillas de plástico Una bolsita de plástico para congelación con cierre zip 2. Introducir una o dos fresas en el interior de la bolsa de plástico y cerrar bien. 3. Machacar las fresas con ayuda de las manos. Resulta más fácil si se hace con el puño con cuidado de no romper la bolsa. De este modo preparamos el tejido de fresa para la extracción de ADN. 4. En un vasito de plástico poner un par de dedos de agua y media cucharilla de detergente para el lavavajillas. 5. A continuación añadir a la mezcla una cucharilla de sal. 6. Remover la mezcla con la cucharilla hasta que se disuelva la sal. La mezcla constituye lo que se denomina disolución de lisis. 7. Añadir la disolución de lisis a las fresas machacadas y mezclar bien con la mano. La disolución de lisis rompe las células de la fresa fundamentalmente debido a que el detergente disuelve las membranas celulares constituidas por lípidos. 5

6 8. Colocar un colador sobre un vaso de plástico limpio y hacer pasar a través de la malla el lisado generado en el paso anterior. Al filtrar el lisado estaremos eliminando gran parte de los desechos resultantes de la ruptura del tejido de la fresa y los trozos más grandes de fruta. 9. En el vaso se encontrará un líquido denso que entre otros componentes contiene el ADN en disolución. Para precipitarlo, añadiremos un chorro de etanol de 96 (el alcohol que se encuentra en todos los botiquines). Habitualmente, se utiliza un volumen de etanol similar al de la disolución. El ADN es soluble en agua, pero no lo es en etanol, de manera que al añadírselo, y ayudado por los cationes de sodio aportados por la sal en la disolución de lisis, el ADN aglutina formando un precipitado. 10. Al añadir el etanol veremos que se forman dos fases en el vaso, una más densa de color rosa en el fondo y otra superior más transparente con el etanol. 11. En la fase con el etanol aparecerán unas fibras de color blanquecino y aspecto gelatinoso. 12. Éstas podrán ser observadas con mayor claridad si las retiramos de la disolución con ayuda de unas pinzas. La masa gelatinosa es principalmente ADN y como podrás observar se ha obtenido mucho, incluso visible a simple vista partiendo solamente de dos fresas. Esto es así debido a que las células de la fresa contienen mucho ADN. NOTAS: 6

7 Preparación de un gel de agarosa y electroforesis de ácidos nucleicos

8 Extracción de ADN de la fresa