Aplicación de biotecnología vegetal en el desarrollo de técnicas para la reproducción de plantas

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1 PROYECTO. Aplicación de biotecnología vegetal en el desarrollo de técnicas para la reproducción de plantas con importancia económicas S I P DIRECTORA: Dra. Silvia Evangelista Lozano PROGRAMA. Biotecnología por cultivo de células vegetales para la producción de metabolitos secundarios y propagación de plantas de interés económico RESUMEN. Con base en el objetivo planteado que consistió en la aplicación de técnicas de propagación por semilla en especies como cempazúchil (Tagetes erecta L.), helechos y orquídeas; así como vegetativa en buganvilla (Bougainvillea glabra Choise), que son plantas con importancia económica ornamental. Además de la utilización de sustratos alternativos para la aclimatización y producción de planta sana y de calidad. En lo que se refiere al cempazúchil se obtuvieron resultados satisfactorios en los estudios de germinación exponiendo las semillas en diferente calidad de luz (roja, azul, blanca y en la oscuridad). Las plantas también expuestas bajo malla policromática (roja, azul, gris y negra). Las semillas con mayor velocidad de germinación bajo luz roja y azul; las plantas con mayor número de inflorescencias, diámetro de capítulo y mayor porcentaje de xantofilas las expuestas bajo malla roja. Las especies de helechos silvestres Adiantum poiretii Wikstr (Planta herbácea con rizoma rastrero; escamas lanceoladas, concoloras; pecíolo glabro; lámina de 1-4 x 7-1 cm, deltada a lanceolada, 2-3 pinnada, glabra, segmentos semicirculares o flabelados; soros 2-8 por segmento); Asplenium muenchii A. R. Sm. (Planta herbácea con rizoma rastrero; escamas ovadas, clatradas; pecíolo sulcado adaxialmente; lámina de x -11 cm, deltada a lanceolada, 3-pinnado-pinnatífida, yema escamosa al nivel de la ultima pinna apical, pinnas ovadas); Asplenium sessilifolium Desv. (Planta herbácea rupícola o epifita con rizoma erecto; escamas deltadas, clatradas; lámina de x cm, elíptica, 1-pinnado-pinnatífida, pinnas ovadas). Se colectaron esporas y después de la aplicación de cinco protocolos de desinfectación, se logró la germinación; lo que dio lugar a realizar pruebas de viabilidad con lo que se obtuvieron mejores resultados fue con el Reactivo de Mutzing, prueba generada para helechos, así como la germinación en sustrato como perlita y medio MS. En la determinación de algunas condiciones de regeneración in vitro y ex vitro de la orquídea silvestre: Trichocentrum Laelia eyermaniana Rchb, las cuales fueron germinadas y aclimatizadas; la primera se obtuvieron protocormos y se indujo multibrotación mediante el corte transversa, así como el protocormo completo, obteniéndose mayor número de protocormos y plantulas (32) con ácido naftalenacético 1

2 (ANA) y bencil amino purina (BAP). La aclimatización del mayor número de plantas de ambas especies fue en fibra (base del pecíolo) de palma soyate. Con referencia a la micropropagación y aclimatización en cuerno de alce de logro el escalamiento y aclimatización, lo cual fue comprobado con análisis de clorofila, estomas y mediciones periódicas de las plántulas. En buganvilla se mantuvieron en invernadero, micropropagaron y se aclimatizaron; en el área de Laboratorio de Propagación ex Vitro, se cuenta con plantas. Todos estas actividades y resultados obtenidos fueron presentados en congresos nacionales e internacionales; además de generar tesis: cinco a nivel licenciatura y tres a nivel Maestría. Los escritos de las tesis de maestría están en revisión de los comités avalados por el Colegio Académico de Maestría del CEPROBI. La vinculación con los productores nos llevó también a iniciar trabajos con la propagación de gladiolo (Gladiolus X Gladiolus); esto se justifica ya que Morelos es uno de los estados con mayor producción de esta flor de corte, vendiendo par el mercado nacional e internacional; en esta área se dio un curso de 2 horas y se pusieron a funcionar dos invernaderos de 24 m 2, con alta densidad de cormos; así también con un control extremo fitosanitario; la producción de flor fue de alta calidad (más de 1 flores por vara, con floración completa) y completamente sana. Este fue un proyecto altamente satisfactorio, ya que se lograron las metas y financiamiento de la Fundación Produce de Guerrero. Reconociéndose al Instituto Politécnico Nacional como una de las Instituciones que transfiere la información que se genera en los Laboratorios. 2

3 INTRODUCCIÓN. En la cadena sistema producto ornamentales, la propagación es una actividad redituable; esto obedece al grado de competitividad, el cual está determinado por los costos de producción, que dependen de las materias primas, clima, mano de obra, infraestructura, demanda y desarrollo del mercado, apoyo gubernamental, variables económicas y las oportunidades. Actualmente la demanda está abierta, solamente que se requieren plantas libres de patógenos y adaptadas a condiciones de semisombra. Otra oportunidad es el estudio de sustratos diferentes a los tradicionales como es la hojarasca "tierra de hoja", que trae como consecuencias el saqueo de este material de los bosques. La turba en combinación con otros materiales inertes, presentes en el mercado y en la región. Además ahorro de agua y disminución en la cantidad de solución nutritiva que se desperdicia y que se va a las corrientes de agua; por el exceso termina por considerarse contaminante en el suelo El trabajar con las especies propuestas tuvo como fundamento: el cempazúchil, es una fuente de carotenoides para la industria de los alimentos; México es uno de los centros de origen de esta especie; las variedades que se utilizan tanto para la industria como ornamental son extranjeras (patentadas); los helechos, como los que aquí se estudiaron presentan arquitectura que los hace importantes como ornamentales, los que se comercializan en México el 8% son importados y patentados, el resto son saqueados de de sus áreas naturales de distribución. La importancia del estudio de las orquídeas silvestres está en que también por sus inflorescencias saqueadas. La solución más adecuada y deseable a esta problemática no es copiar o adaptar modelos extranjeros, sino establecer los propios. Estos modelos particulares emanados de la observación y el estudio de la realidad regional y nacional son los que conforman capacidades únicas, o sea, características distintivas a una determinada región fortaleciendo, de esta manera, sus capacidades para encarar la competencia. Así también la gestión del conocimiento en la transferencia de tecnología no debe ser ideológica, por el contrario, debe de ser dialéctica, para que a la par que mejore su calidad de vida dote, al sujeto, de los sentidos necesarios para adquirir una conciencia de clase basada en su propio devenir histórico y sus valores culturales 3

4 MÉTODOS Y MATERIALES. Mantenimiento de planta madre Regado y fertilizado de planta madre, siembra y resiembra in vitro de: buganvilia, orquideas, helechos y cempazúchil. Actividades necesarias para contar con materia prima. Los riegos se realizaron con la fórmula comercial Raizal R, a una concentración de.1%; cada tres días se realizaron germinaciones constantes de cempazúchil; las orquídeas y helechos las plantas madre. Escalamiento en la propagación Propagar a nivel piloto el cultivo de buganvilia in vitro, por microesqueje y estacas de 14 cm en condiciones de invernadero, colecta de esquejes, estacas, desinfección y preparación de sustrato. Inducción de brotación múltiple Se realizaron estudios diferentes concentraciones de ANA Y BAP para la inducción a la multibortación de protocormos de orquídea Trichocentrum carthagenence), con reguladores del crecimiento en protocormos completos y en cortes basales y apicales. A partir de cápsulas verdes indehiscentes, desinfectadas con hipoclorito de sodio (Cloralex R ) al 3 % durante 1 minuto; las semillas de Trichocentrum carthagenence (Jacq.) Sw., fueron sembradas en medio MS (Murashige & Skoog, 1962) al % más carbón activado (McKendrick, 2). Después de la germinación, los protocormos formados se seleccionaron dos grupos: el primero para evaluar el efecto de RCV, sobre un diseño factorial fueron sembrados por separado, protocormos completos, porciones apicales y porciones basales de los mismos, en medio MS al % más carbón activado adicionando BAP y ANA en concentraciones de.1 y.2 mg/l. se evaluó la formación de PLB s y número de plántulas El segundo grupo de protocormos, se sembró y resembró en medio Knudson C más carbón activado (Ammirato y col., 199), Plántulas de 12 meses de desarrollo in vitro, se transplantaron ex vitro en los sustratos: vermiculita, fibra (fruto) de coco, y por separado fibra (base del pecíolo) y hoja de palma soyate. Se evaluó como respuesta al sustrato, el número de plántulas sobrevivientes. Ambos grupos se incubaron a 24 + C, con fotoperiódo de 16/8 hrs. (luz/oscuridad). Obtención de gametofitos y fraccionado para la inducción de multibrotación y la obtención de esporofitos in vitro de helechos silvestres dos del Género Asplenium y uno del Adianto. Se sembraron las esporas en medio de cultivo y sustratos como agrolita, vermiculita y turba (sustratos por separado). Helechos La colecta de las plantas de helechos en estudio, así como la herborización y montaje se realizo siguiendo los parámetros descritos en el Manual de Herbario del Consejo Nacional de la Flora de México (Lot y Chiang, 1986) y por el INEGI ( La identificación de los ejemplares se realizo basándose en la obra The Pteridophytes of México (Mickel y Smith, 24), y se corroboro la identificación en el Herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, bajo la asesoría del curador del herbario, la M. en C. María de la Luz Arreguín Sánchez (Marzo del 26). 4

5 Al realizar la colecta de las plantas en campo se tomaron las siguientes variables ambientales: -Humedad relativa (HR) y temperatura (T), utilizando un higrótermometro (marca Taylor, modelo 14). -Intensidad luminosa (IL) con un cuántometro (marca Apogee modelo QMSW-SS). De las anteriores variables ambientales se tomaron de cada una tres lecturas al azar. En cuanto a parámetros físicos del lugar se determino el ph del suelo, para lo cual se tomo una muestra en campo de aproximadamente ½ Kg., posteriormente en el laboratorio se coloco 1 g de muestra por cada 7 ml de agua desioinizada, se homogeneizo, se paso por papel filtro y se tomo la lectura con un potenciómetro manual para sustratos (marca Testr 1 ). Se realizaron tres repeticiones por muestra. Además se registraron las coordenadas geográficas (latitud y longitud) y altitud con un GPS (marca Garmin modelo GPS III Plus), para descripción del área de estudio. También se estimo la abundancia de cada especie de estudio utilizando la escala de abundanciacobertura de Braun-Blanquet y se realizaron 3 transectos o líneas Canfield de 1m (con un flexometro de 1 m marca Truper ), con el objeto de determinar el Índice de Densidad Lineal DLi- y la Cobertura Lineal -CL- ( El realizar la descripción del sitio de colecta obedece a que se requirieron datos de condiciones ambientales para mantener en vivero las plantas madre colectadas de campo, así mismo de los requerimientos que se necesitaron para el mantenimiento in vitro de los explantes de hojas y la inducción de la germinación de las esporas. Protocolos de desinfestación de esporas. De las esporas colectadas se tomaron muestras para sembrarlas in vitro, los protocolos de desinfestación utilizados los que se describen (Cuadro 1) Cuadro 1. Protocolos de desinfestación. NÚMERO DESINFECTANTE -tipo y concentración- TIEMPOS DE EXPOSICIÓN min 1 NaOCl 1% 1 y 2 2 NaOCl 1% + Tween 8 1, 2, 3 y 4 3 NaOCl.% + Tween 8 1, 2, 3 y 4 4 NaOCl.% + Tween 8 + Estreptomicina 3, y 1 (Cox et al., 23) Aspersión con etanol al 96 % Se dejo evaporar NaOCl al 1% de cloro activo: 17 ml de cloro comercial (Clorox ) por cada 1 ml de agua. NaOCl al.% de cloro activo: 8. ml de cloro comercial (Clorox ) por cada 1 ml de agua. Tween 8: 3 gotas (aprox. 1 ml), por cada 1 ml de agua. Estreptomicina: 2 mg/ml. En los protocolos del 1 al 4 las muestras de esporas obtenidas de las frondas de los helechos se colocaron en bolsas de x cm hechas de tela tipo Magitel, las cuales se cerraron con un clip del No. 2 (Baco ). En el caso del protocolo 1 se coloco un sobre en un vaso de precipitado de 2 ml, los cuales contenían solución de NaOCl al 1% de cloro activo, y se mantuvo 1 minutos. Al termino del tiempo se sacaron y enjuagaron en agua desionizada estéril. A la par se hizo otra prueba pero manteniendo el sobre en la solución de cloro 2 minutos.

6 Para el protocolo 2 un sobre que se coloco en una solución de NaOCl al 1 % de cloro activo, que contenía 1 ml de Tween 8 (con la finalidad de romper la tensión superficial y permitir que el NaOCl penetre adecuadamente en los esporangios), se mantuvo 1 minutos y al final se enjuago con agua desionizada estéril. Se repitió el procedimiento a 2, 3 y 4 minutos. El protocolo 3 consistió en colocar un sobre en una solución de NaOCl al. % de cloro activo mas 1 ml de Tween 8, se mantuvo 1 minutos y al final se enjuago con agua desionizada estéril. Se repitió el procedimiento a 2, 3 y 4 minutos. La metodología descrita por Cox et al. 23, para la desinfectación de esporas fue la que se uso como protocolo 4. Por ultimo para el protocolo, se utilizo Etanol al 96 %, el cual se asperjo con un atomizador de 2 ml, directamente sobre los esporangios de las frondas de los helechos, dejándose evaporar Medios semisólidos de cultivo. Los medios semisólidos de cultivo que se utilizaron para la germinación de las esporas in vitro, fueron el medio de Murashige y Skoog -MS-, (Murashige and Skoog, 1962); el medio de Knudson -MK-, (Knudson, 1946) y el medio de Thompson -MT-, (Klekowski, 1969). El medio MS utilizado es el de la marca Sigma, de este medio se realizaron varientes (Ciuadro 2). Cuadro 2. Variantes del medio MS utilizadas. VARIANTE COMPONENTE DEL MS MS1 MS2 MS3 SALES 4.4 g/l 4.4 g/l 2.2 g/l 2.2 g/l SACAROSA 3 g/l 2 g/l 2 g/l - PHYTAGEL 2.2 g/l CARBÓN ACTIVADO 2.2 g/l ph En el caso del medio de Knudson se utilizo el de la marca Sigma, a una concentración de 21 g/l, con un ph de.8, sustituyendose el Agar por Phytagel a una concentración de 2.2 g/l. El medio de Thompson se elaboro según lo reportado por Mendoza-Ruiz (21), a un ph de.8 y el Agar también se sustituyo por Phytagel a una concentración de. g/l. Sustratos hortícolas. Se utilizaron los siguientes sustratos: - Maquique, (MAQ), raíces secundarias de helechos arborescentes. - Turba -peat moss Sunshine - (TUR). - Vermiculita -Hummert - (VER). - Agrolita -Polinal - (PER). - Sustrato para germinar esporas de helechos (SEH), según Luna, 22. Tanto para los medios semisólidos como para los sustratos se utilizaron frascos tipo Gerber, conteniendo aproximadamente 2 ml de cada medio y en el caso de los sustratos aproximadamente 1 g y 3-4 ml de agua desionizada estéril. Para medios semisólidos de cultivo se probaron los protocolos de desinfestación y para los sustratos solo el ultimo. La siembra de las esporas se llevo a cabo siguiendo la metodología 6

7 descrita por Montoya-Casimiro et. Al, 2. De cada medio se hicieron tres repeticiones y de los sustratos tres replicas con tres repeticiones. Todo el proceso de siembra de las esporas tanto en los medios como en sustratos se llevo bajo condiciones asépticas, en una campana de flujo laminar. Pruebas de viabilidad de esporas Se realizaron en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la UBIPRO de la FES-Iztacala, UNAM, bajo la asesoría del Dr. Ernesto Aguirre León. Las muestras de esporas de las especies en estudio se tamizaron usando tamices (marca ), con numero de malla 12, 6 y 4. Se colecto el tamizado y se guardo en viales de vidrio de ml, que se sellaron con Kleen-Pack y se guardaron en refrigeración (4- o C). Posteriormente se tomo una muestra de las esporas, se coloco en tubos ependoff de 1. ml (4 por cada especie), se les agrego. ml de los siguientes reactivos: -Tetrazolio - Diacetato de fluoresceína (DAF) - Azul de Evans - Reactivo de Mutzing Se dejo actuar 24 horas en el caso del Tetrazolio, Azul de Evans y Reactivo de Mutzing y por 1 min en el caso del DAF. Se realizaron observaciones en un microscopio óptico. En donde la prueba dio positivo fue con el Reactivo de Mutzing, por lo que se realizaron dos repeticiones más, contándose esporas en cada una Escalamiento en la propagación in vitro de helecho Se emplearon 1 frascos tipo Gerber con plántulas in vitro de helecho cuerno de alce (Platycerium bifurcatum, Sin. P. alcicorne) del laboratorio de Cultivo de Células Vegetales del Departamento de Biotecnología en el CEPROBI-IPN. Primeramente se utilizó un frasco para la siembra preliminar; ya dominada la técnica de siembra in Vitro, se trabajó con tres frascos, los cuales tenían 4 meses de haber sido sembrados. Este material se localiza en el cuarto de incubación bajo las siguientes condiciones: Temperatura 2 ± 1 ºc Fotoperiodo 16 horas luz 8 horas oscuridad Intensidad luminosa 3 lx. Preparación de medio de cultivo para helecho Reactivos. Sacarosa marca Fermont Fitagel marca Sigma Carbón activado 6-Benzilaminopurina citoquinina (BAP) Medio de cultivo El medio de cultivo MS (Murashige and Skoog, (1962)), está compuesto principalmente por sales, vitaminas y aminoácidos, Se utilizó el recomendado por Evangelista y Col. (24) (Cuadro 3), para realizar el escalamiento en la resiembra. 7

8 Cuadro 3. Componentes utilizados para la preparación de un litro de medio para helecho PRODUCTO M S (Murashige y Skoog, 1962) Sacarosa BAP Carbón activado Fitagel CANTIDAD 4.4 g 3 g.1 mg 2 g 2.2 g ph.8 Agua desionizada Aforado a un litro BAP (6-Benzilaminopurina citoquinina) Siembra In vitro de helecho cuerno de alce (Platycerium alcicorne sig. P. Bifurcatum) La metodología involucró dos experimentos, el primero para evaluar la cantidad de plántula obtenida en frascos tipo Gerber y el segundo para valorar el desarrollo de plántulas de cuerno de alce a los 2, 4, 6 y 8 días después de la siembra con tres explantes, de 1. y. cm 2. De acuerdo a la técnica propuesta por Evangelista et al., (24). Se extrajeron las plántulas con las pinzas y se colocaron en una caja de Petri con agua y se enjuagó el exceso de medio que contenían las plántulas. Se abrió otra caja Petri y en ella se volvieron a colocar las plántulas, con el bisturí se hizo el corte de rizoma; se flameó un frasco Gerber con su respectiva tapa y con la pinza se colocaron tres explantes de rizoma por cada frasco En la primera siembra, se realizaron las evaluaciones en cuanto a: número de frascos contaminados y frascos sanos y número de frondas en los explantes de 1. y. cm 2. Esta siembra fue de 6 frascos, 28 de cada tamaño de explantes (las evaluaciones se realizaron a los 2, 4, 6 y 8 días). Para la cuantificación del número de frondas por frasco, se evaluaron cinco frascos de cada tratamiento De manera particular se evaluaron las plántulas a los 8 días de los frascos con un explante, para esto se dividieron en chicas, medianas y grandes, siguiendo el criterio propuesto por Rodríguez Serrano, (26). A los 8 días se evaluó el tamaño y número de frondas obtenidas por frasco, listas para aclimatización, clasificándose en Chicas (.3 a.1.), medianas (1.3 a 1.8) y grandes (1.6 a más de 2cm). Se cuantificó el promedio y la desviación estándar Aclimatización de plántulas de helecho cuerno de alce, utilizando filtros de color, se uso azul, amarillo, rojo, testigos negro y blanco. Procedimiento para preparar sustrato para helecho de Platycerium alcicorne Los componentes utilizados en el sustrato fueron: agrolita, vermiculita y turba. La proporción de las cantidades a realizar, fue de v/v/v, hidratando con agua purificada mezclando perfectamente. Una vez obtenida la mezcla se tomó el ph y posteriormente la conductividad eléctrica del sustrato; sino estaba dentro de los rangos se ajustaba entre (6.-7. s). Ajustado el 8

9 ph y tomada la conductividad eléctrica, se colocaron las macetas dentro de la charolas para después llenarlas con el sustrato preparado, teniendo cuidado que las macetas no quedaran demasiado saturadas ya que la porosidad es importante para que nuestro sustrato se mantenga perfectamente hidratado (Figura 1). Figura 1. Mezclado del sustrato y llenado de macetas para el trasplante de platycerium alcicorne El transplante de plántulas de helechos (Platycerium alcicorne), provenientes de in vitro a charolas, se realizó en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional en el Laboratorio de Biotecnología de cultivo de células vegetales y el laboratorio de cultivo ex vitro, para después llevarlas a su aclimatización en el cuarto de incubación, ubicado en el mismo lugar, a una temperatura de 26 C y a una Humedad Relativa del 3%. Procedimiento para el transplante de plántulas de helechos Platycerium alcicorne de frascos tipo Gerber a charolas Primero se verificó en las charolas que el sustrato que tenían las macetas fuera el suficiente, para poder transplantar las plántulas de Platycerium alcicorne. Posteriormente se colocaron las tapas de la caja Petri con agua purificada (una de las tapas de la caja Petri con las plántulas), con objeto de quitarle el exceso de medio que tenían. Posteriormente se realizaron los cortes con ayuda de pinzas, quitando siempre lo maltratado y podrido que tenía la plántula. Una vez obtenidos los cortes, se colocaron en la otra tapa de la caja Petri, para que no se deshidrataran y subsiguientemente, se sembraron los cortes de las plántulas en las macetas, con el sustrato preparado anteriormente, cuidando que siempre quedaran al centro de la maceta, para que así la plántula aproveche todo el sustrato a su alrededor y enraíce perfectamente. Las plántulas fueron organizadas en la charola por tamaños, clasificándose como pequeñas, medianas y grandes. Una vez plantadas todas las charolas, se les agregó Raizal-4 R para que no se deshidrataran las plántulas sembradas, tanto la parte superior como en la inferior. La parte superior de las plantas se regó con el atomizador. Una vez regadas se taparon las charolas con los domos, para así mismo rotular cada charola con los datos que tenía de in vitro y la fecha en que se aclimataron y por último se colocaron en la cámara de incubación. 9

10 Preparación de solución nutritiva para riego La preparación de solución nutritiva para riego, se realizó en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional en el Laboratorio de Biotecnología de cultivo de células vegetales para después utilizarla en los helechos Platycerium alcicorne realizados anteriormente Aclimatización de plántulas Platycerium alcicorne expuestas a diferente filtros de luz La aclimatización de plántulas Platycerium alcicorne, se realizó en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional en el Laboratorio de Biotecnología de cultivo de células vegetales, para después colocar en el cuarto de incubación Las plántulas se evaluaron cada 1 días después del transplante, tomando en cuenta la longitud de las frondas y el número de hojas. Se presentaron los datos en promedio y la desviación estándar por tamaño. Se utilizó papel celofán (rojo, azul y papel aluminio). Forrando los domos con los colores: rojo, azul, como testigos el domo sin forro (transparente) y con forro de papel aluminio (negro), sellando con cinta mágica los domos. Las charolas con los tratamientos de color permanecieron en el cuarto de incubación (fotoperiodo de 16 horas luz), se registraron los datos de: temperatura, humedad, intensidad luminosa (dentro y fuera de las charolas). En la planta el número y tamaño de frondas. Los datos fueron valorados cada 1 días. El color se evaluó a los, 3, 6 días. Teniendo 3 repeticiones por tratamiento. Por tratamiento se evaluaron 36 muestras (12 plantas por charola, tomando las del centro). Las plantas expuestas a los filtros (papel celofán de color rojo, azul, como testigos el domo transparente y negro). Se tomaron muestras de la epidermis de las frondas de la parte axial (superficie de la fronda) y adaxial. Y se elaboraron preparaciones fijas para ser observadas al microscopio compuesto (1X); así también se evaluó el tamaño y forma de los estomas en el microscopio de imágenes Elaboración de preparaciones fijas Se tomó una hoja de cada charola, para después colocarle una capa fina de barniz (de uñas transparente) dejándolo secar y posteriormente con las unas pinzas se le quitó la capa fina de barniz colocándola en el portaobjetos (las muestras se deben tomar de la parte central de la hoja por que es ahí donde están creciendo los estomas), se extrajeron tres muestras por hoja tanto de la parte axial como de la parte adaxial, para después colocarles unas cuantas gotas de safranina (para teñir), dejando reposar por 2 minutos aproximadamente, se le quitó la safranina con papel higiénico, para después agregarle gelatina y colocarle el cubreobjetos, se sellaron las orillas con barniz y por último se rotula la preparación que se realizó con las datos de donde provenía. Evaluación de calidad de plantas y flores de cempazúchil Exposición de semillas para inducir la germinación en diferentes calidades de luz. En laboratorio (lámparas) y bajo malla policromática (azul, roja, negra y gris) Evaluación del desarrollo de plantas, intensidad de floración y contenido de carotenoides. 1

11 Para la investigación se utilizo semilla de Tagetes erecta de la Variedad Nana. Con lo que se aseguro la calidad del material en cuanto a porcentaje de germinación y homogeneidad en el desarrollo. Se realizaron dos experimentos uno en el que se evalúo la germinación, emergencia y crecimiento de la plántula bajo lámparas de luz de diferente calidad Se utilizaron 2 semillas por caja Petri de cada tratamiento ( repeticiones). Los datos se analizaron mediante Modelos Lineales Generalizados con el programa SAS. En cuanto a la emergencia y crecimiento se evaluaron los mismos tratamientos, con la técnica propuesta por Evangelista Lozano, et al. (1998), colocando semillas en macetas negras de 7 pulgadas con sustrato mezcla, elaborado con turba, agrolita y vermiculita (3-1-1 v/v), ph ajustado a.8 ±.3, porosidad del 86%, regadas a capacidad de campo con agua natural. La lectura de los datos se realizó cada 24 Hr durante 1 días. Con los datos obtenidos se evaluó color, altura de la planta y número de hojas definitivas. Establecimiento del cultivo de Tagetes erecta en invernadero La segunda etapa para evaluar el desarrollo, floración y contenido de carotenoides de inflorescencia de plantas expuestas bajo diferentes mallas de color. Las emillas fueron germinadas en charolas de de 38 cavidades con sustrato mezcla en el laboratorio de Propagación ex vitro del CeProBi-IPN. Plantas con tres hojas definitivas y con un tamaño de 12 ± 2cm (3 días de edad contando desde la siembra). Estas fueron trasladadas al Centro de Desarrollo Tecnológico de Tezoyuca del FIRA, ubicado en Tezoyuca, Municipio de Emiliano Zapata, Morelos. Aquí las plantas de Tagetes erecta se transplantaron en macetas de 7 pulgadas en una mezcla de sustrato que consistió en una mezcla de turba, agrolita y vermiculita en proporción 3:1:1 con un ph de.8 ± 2 y con una porosidad del 86%. El invernadero utilizado fue tipo casa sombra con 2. m de altura, la separación entre malla y malla fue de 12 metros con un porcentaje de sombra del de %. Las mallas utilizadas fueron Chromatinet de la marca Polysack, de los siguientes colores: negro, gris, azul y rojo. Color de la planta (cartas para tejidos vegetales Munsell), Aspecto general de la planta (calidad comercial de las plantas). En cada una de las mallas se midió, la temperatura, la humedad relativa (HR %) y la intensidad de luz que fue medida con una cuantómetro marca Apogee con un rango de -1 µmol de fotones m -2 s -1. Para la caracterización de los pigmentos en inflorescencias se realizó en inflorescencias las cuales se procesaron en el laboratorio de Biogeoquímica de la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la FES-Iztacala de la UNAM. Identificación y cuantificación de pigmentos mediante hplc en fase reversa y en gradiente Se realizó la identificación y cuantificación de las inflorescencias de los diferentes estados de desarrollo. La técnica utilizada fue cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC, para lo cual se utilizó un cromatógrafo de líquidos Hewlett Packard modelo 11 equipado con una bomba 11

12 cuaternaria y un detector UV-Vis con arreglo de diodos. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: Fase móvil constituyente de: a) Disolvente A: Acetonitrilo-Metanol-TRIS*HCl ph 8..1 M 18/12/4. (v/v, v/v, v/v). b) Disolvente B: Metanol-Hexano 8/ 2 (v/v, v/v, v/v) La elución fue en gradiente; iniciando con 1% del disolvente A durante min y en 2. min se cambia con el disolvente B al 1% manteniéndose durante 7. min teniendo un tiempo total de corrida de 1 min, con un flujo constante de 2. ml/min con un detector de arreglo de diodos a 47 nm y un barrido entre 3 y 7 nm. Para la identificación de pigmentos se realizó con una columna Allsphere ODS 1- µl Vinculación con productores Recorridos en viveros, entrevistas con productores sobre Impartición de conferencias, tallares y transferencia de tecnología de ornamentales. Se trabajo con productores del Estado de Guerrero, con Fundación produce de Guerrero. 12

13 RESULTADOS Mantenimiento de planta madre Se cuenta en el área de viveros, denominada dentro del Organigrama como LABORATORIO DE CULTIVO EX VITRO, con plantas madre de buganvilla de las variedades Sorpresa, Variegata, morada y San Vicente. Estas e4stan en desarrollo y constante mantenimiento, y son mostradas en cada visita que hacen productores, así como estudiantes. En Cempazúchil se trabajo con la Variedad nana para las pruebas de germinación y desarrollo y floración con diferente calidad de luz. Así también se trabaja en vinculación con el Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz, Investigador de la Universidad Chapingo, quien nos proporcionó ejemplares de plantas de una de sus selecciones, que hizo con fin ornamental que denominamos PORTE BAJO CHAPINGO, estas están en campo. Se realizaron nuevas plantaciones considerando las plantas proporcionadas como PROGENITORAS, se realizó colecta de semilla y se tiene la FILIAL 1 (F 1). esta en proceso de germinación para la Filial 2. a más tardar en el mes de junio del 27, se tendrán plantas de la F 4. En reunión de trabajo con el DR. Serrato, se acordo realizar el registro de la variedad, en la que estaremos como autores. Ya que estamos colaborando con la reproducción, toma de datos de tamaño de receptáculo, segregación, tamaño. Este es un trabajo de continuidad. Y forma parte de las metas del Proyecto Las orquídeas después de la obtención de las vainas, que posteriormente se utilizaron para siembra in vitro; se donaron, ya que por las condiciones ambientales, no era posible mantenerlas en el área. Las plantas madre de Helechos continúan dándoles mantenimiento. Para todas las plantas el mantenimiento cosiste en: regado cada semana o cuando requieran el riego, estas se mantienen con un contenedor que permite almacenar el agua y el regado es por capilaridad, también es un sistema desarrollado y probado en el CEPROBI. La solución de riego es un producto comercial a una concentración del.1% RAIZAL R. En buganvilla además de los riegos el mantenimiento consiste en realizar podas constantes, ya que se mantienen en condiciones de intemperie e invernadero (Figura 4). Figura 4. Primera imagen buganvilla Variedad Sorpresa, Segunda San Vicente y última muestra plantas en invernadero con sistema de riego por capilaridad (Sin gasto de energéticos). 13

14 Escalamiento en la propagación El material con que se cuenta es producto del escalamiento en la propagación, los microesquejes de buganvilla fue posible repetir los resultados en este caso ya con raíz en la segunda resiembra con en medio MS (Murashige and Skoot, 1962). Propagar a nivel piloto el cultivo de buganvilia in vitro, por microesqueje y estacas de 14 cm en condiciones de invernadero, colecta de esquejes, estacas, desinfección y preparación de sustrato. En cuanto al sustrato el mejor para el estaca de buganvilla es la Mezcla elaborada con: turba (6%), agrolita (2%), vermiculita calibre mediano (2%), y el ph ajustado a.8 ±.3. Este sustrato presenta características de ph, porosidad (8%), tales que permiten la aireación de las raíces, motivo por el que es posible reproducir estacas en bolsas sin perforaciones, con que se tienen un ahorro en solución nutritiva de riego y en mano de obra. Inducción de brotación múltiple Se realizaron estudios diferentes concentraciones de ANA Y BAP para la inducción a la multibortación de protocormos de orquídea Trichocentrum carthagenence), con reguladores del crecimiento en protocormos completos y en cortes basales y apicales. A los 4 meses, de la siembra, se formaron protocormos definidos. Los protocormos completos y con RGV se obtuvo mayor ganancia en peso fresco de PLB s y plántulas, que en las porciones apicales y basales (Cuadro 4). Cuadro 4. Resultados de peso y plántulas generadas de protocormos completos y porciones con RCV Tratamiento Corte/ mg/l ANA/ mg/l BAP P F(g) PLB s PF (g) Total ** Núm. plántulas. Apical.2 ANA /. BAP Basal. ANA/. BAP Completo.2 ANA /.2 BAP P. F.: peso fresco ** plantas y PLB s Trichocentrum carthagenence (Jacq.) Sw., presenta mayor sebrevivencia y desarrollo en fibra (base del pecíolo) de palma soyate. En cuanto a la obtención de gametofitos de helechos silvestres: Descripción del sitio de colecta. Con respecto a los ejemplares colectados en campo de las especies en estudio, se obtuvieron 2 plantas adultas con un duplicado cada una. Se lleno las formas LABC-1 (información del sitio de colecta) y LABC-2 (información de cada ejemplar), ambas propuestas por el INEGI ( para colectas de plantas en campo. A los ejemplares herborizados y montados, con base a lo establecido en Manual de Herbario del Consejo Nacional de la Flora de México, se les anexo las formas antes mencionadas. La mitad de los ejemplares se quedaron en el Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos Vegetales y la otra mitad se depositaran en el Herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Se identificaron los ejemplares colectados con ayuda de bibliografía especializada (Mickel y Smith, 24) y con la asesoría del curador del herbario, la M. en C. María de la Luz Arreguín Sánchez del 14

15 Herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN. El nombre científico de las especies en estudio es: Adiantum poiretii Wikstr.(Figura ) Asplenium muenchii A. R. Sm..(Figura 6) Asplenium sessilifolium Desv.(Figura 7) 6 7 Figura. Fronda de un individuo de Adiantum poiretii Wikstr Figura 6. Aspecto general de un individuo de Asplenium muenchii A.R. Sm Figura 7.. Aspecto general de un individuo de Asplenium sessilifolium Desv., Ges Con respecto al registro de las coordenadas geográficas (latitud y longitud) y altitud con el GPS (marca Garmin modelo GPS III Plus), los resultados se muestran en el Cuadro.. Cuadro. Ubicación geográfica del sitio de colecta ESPECIE Asplenium muenchii SITIO DE COLECTA (Edo. de Morelos) El Salto Tetela del Volcán COORDENADAS ALTITUD msnm N 18 o.21 WO 98 o A. R. Sm. Asplenium sessilifolium Desv. Adiantum poiretii Wikstr. Barranca Agua Bendita Jumiltepec Barranca Agua Bendita Jumiltepec En la parte de la estimación de la abundancia de cada especie de estudio utilizando la escala de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet y el Índice de Densidad Lineal DLi- y la Cobertura Lineal -CL- ( obtenidos por transectos (Cuadro 6). N 18 o.22 WO 98 o N 18 o.22 WO 98 o

16 Cuadro 6. Abundancia de las especies en estudio. ESPECIE Asplenium muenchii A. R. Sm. COBERTURA (Braun-Blanquet) TRANSECTOS (LINEA CANFIELD) INDICE DE DENSIDAD COBERTURA LINEAL LINEAL DLi CL 3.33±.7 1±.2.8±.1 Asplenium sessilifolium 3.66±.7 1.3±.2.8±.26 Desv. Adiantum poiretii 1.6±.7 1.3±.1.73±.2 Wikstr. Medias de tres determinaciones de cobertura con la escala de Braun-Blanquet y de tres transectos ± error estándar Establecimiento del medio semisólido de cultivo y sustrato hortícola adecuado para la germinación de las esporas in vitro. Los resultados de los protocolos de desinfestación de las esporas en los medios MS, K, MT y los sustratos hortícolas (MAQ, TUR, VERM, PER y SEH), en cada una de las especies se muestran en los Cuadros 7, 8 y 9: 16

17 Cuadro 7. Germinación de las esporas de Asplenium muenchii A. R. Sm. en medios y sutratos PROTOCOLO DE DESINFESTACIÓN MEDIO DE CULTIVO Y/O SUSTRATO GRADO DE GERMINACIÓN* DE LAS ESPORAS MS MS MS MK MT 4.66 MAQ 2.66 TUR VER 3 PER 1.66 SEH.66 Los datos son medias de la evaluación de tres frascos por cada tratamiento. 17

18 Cuadro 8. Germinación de las esporas de Asplenium sessilifolium Desv. en medios y sustratos PROTOCOLO DE DESINFESTACIÓN MEDIO DE CULTIVO Y/O SUSTRATO GRADO DE GERMINACIÓN* DE LASESPORAS MS MS MS MK MT MAQ 3 SEH.33 VER 2.66 PER 1.33 Los datos son medias de la evaluación de tres frascos por cada tratamiento 18

19 Cuadro 9. Germinación de las esporas de Adiantum poiretii Wikstr en medios y sustratos PROTOCOLO MEDIO DE CULTIVO Y/O GRADO DE GERMINACIÓN DE DESINFESTACIÓN SUSTRATO DE LASESPORAS MS MS MS MK MT 4 MAQ 2 SEH 1 VER 1.66 PER.66 Los datos son medias de la evaluación de tres frascos por cada tratamien El grado de germinación de las esporas (*) se evaluó usando una estimación porcentual subjetiva, basada en la respuesta de las esporas a cada protocolo de desinfestación, medio y/o sustrato. La escala es la siguiente: = Sin germinación, ya sea por contaminación del medio o sustrato, o por no presentarse germinación aún sin contaminarse el medio o sustrato. 1= Las esporas germinadas (que formaron gametófitos) cubren entre 2 y % del frasco de cultivo. 2= Las esporas germinadas (que formaron gametófitos) cubren entre y 7% del frasco de cultivo. 3= Las esporas germinadas (que formaron gametófitos) cubren entre 7 y 1% del frasco de cultivo (Figura 8). 19

20 Figura 8. Formación de gametofitos, como resultado de la germinación de las esporas, en medios de cultivo semisólidos y en sustratos hortícolas: A. Gametofitos de Adiantum poiretii Wikstr en medio MS, B. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. creciendo en medio MS,C. Gametofitos de Asplenium muenchii A. R. Sm en agrolita y D. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. sobre vermiculita Pruebas de viabilidad de esporas. Los resultados de someter las muestras de esporas a diferentes colorantes fueron negativos en tres de los cuatro colorantes: tetrazolio, diacetato de fluoresceína (DAF), Azul de Evans, obteniendo una reacción positiva solo con el Reactivo de Mutzing, cuyos resultados se muestran en el cuadro 1. Cuadro 1. Viabilidad de las esporas de los helechos en estudio, utilizando el reactivo de Mutzing. % ESPECIE VIABILIDAD Asplenium muenchii A. R. Sm 68.±12.3 Asplenium sessilifolium Desv. 73.4±7.8 Adiantum poiretii Wikstr 4.3±4.6 Los datos son promedios de tres repeticiones, ± desviación estándar. 2

21 En cada repetición se contaron esporas, separándolas en viables cuando la tinción fue total e inviables cuando no se observo tinción o fue parcial y de ahí se obtuvo el porcentaje de viabilidad. En cuanto a la descripción del sitio de colecta se obtuvieron datos de las variables ambientales y físicas del hábitat de cada especie (Cuadro 4), los cuales fueron usados en la germinación de las esporas, aclimatización de plantas madre de campo y de la siembra de explantes de hojas jóvenes y yemas apicales, sobre todo en lo que respecta a los datos de temperatura, humedad relativa y ph. Se identificaron las especies de estudio y se obtuvieron datos de su abundancia en los sitios de colecta (con los valores de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet, índice de densidad lineal DLi- y cobertura lineal-cl-), los cuales nos indican, en general, que las especies de estudio presentan una abundancia de baja a intermedia( 6-, lo cual es adecuado para fines de obtención de material para esporas o de explantes, además de que el impacto ecológico de las poblaciones de campo estaría en un nivel medio, en comparación si su abundancia fuera baja en todos los sitios de colecta. En lo referente a la aclimatización de las plantas madre de campo (es decir de plantas de campo que se seleccionaron como fuentes de esporas o explantes, que cubrían las características fenológicas más importantes de las especies en estudio y sobre todo aquellas para fines ornamentales), los resultados no fueron adecuados, ya que la generación de frondes jóvenes fue muy lenta, y esto redujo el no. de explantes disponibles, además de que no se formaron yemas o esporas. El no lograr una buena aclimatización de las plantas madre de campo posiblemente se debió a que las condiciones ambientales, sobre todo de temperatura y humedad relativa, de estas especies en campo (Cuadro 4), no son las que prevalecieron en el vivero ni en el cuarto de incubación. Es por ello que se decidió obtener explantes directamente de plantas de campo. En el establecimiento de el medio y/o sustrato de cultivo para la germinación de las esporas, los primero 4 protocolos de desinfestación, así como los medio MS1 y MS2 no generaron respuesta positiva, ya que los frascos con medio se contaminaban con hongos y bacterias y aquellos en lo que no se observo contaminación, tampoco se presento germinación de las esporas. Esto ultimo debido quizá a que el NaOCl daña la pared de las esporas, facilitando que penetre hasta la célula germinal, provocando que pierda su viabilidad. Es por ello que se decidió hacer pruebas de viabilidad de las esporas usadas en los cultivos (Cuadro 11), de los reactivos que se usaron el único que dio respuesta fue el de Mutzing, el cuál al contener carmín acético tiñe las esporas que contienen ácidos nucleicos, lo cual es un indicativo de viabilidad (Andrada et al.,1998). El protocolo que resulto favorable para la germinación de las esporas fuel el, así como el medio MS3 MK, MT y los sustratos hortícolas MAQ, SEH, VER y PER. El que germinaran las esporas utilizando el protocolo sugiere que el etanol no disminuye considerablemente la viabilidad de las esporas. Además de que resulta efectivo para controlar problemas de contaminación en los medios de cultivo y sustratos utilizados. 21

22 A pesar de obtener germinación adecuada tanto en medios de cultivo como en sustratos, la mayoría de los gametófitos formados no forman plántulas, lo cual se puede deber a varias causas: por influencia del medio o sustrato, de las condiciones ambientales de los mismos o por la información genética propia de cada especie, por lo que no se logro obtener explantes de hojas o rizomas de origen in vitro. Escalamiento en la propagación in vitro de helecho Producción de plantulas de helecho, en resiembras, para calcular el número de plantulas por frasco, provenientes de explantes de raíz a nivel piloto de helecho cuerno de alce. Otro tipo de factores externos al cultivo in vitro, que pueden modificar el desarrollo de las plantas, para el caso de Platycerium bifurcatum, serían: fotoperiodo, iluminación y temperatura y competencia por nutrientes, que pueden influir en el número de frondas formadas y su tamaño. En cuanto al número de frondas presentadas por los explantes de 1. (Grandes) y. cm 2 (pequeños), se cuantificó mayor cantidad en los explantes de 1. cm 2 (Cuadro 11). Las frondas de los explantes pequeños tuvieron un tamaño muy semejante como lo indica el dato de la desviación estándar. Sin embargo, para optar por una propagación masiva, se recomienda utilizar los explantes de rizoma con un tamaño que oscile en un centímetro cuadrado, ya que fueron las que presentaron mayor número de frondas Cuadro 11. Número de frondas por frascos con explantes de 1. y. cm 2 en la primera fase de siembra de Platycerium bifurcatum. NÚMERO DE FRONDAS POR MUESTREO (, 2, 4, 6 y 8 días) EN EXPLANTES DE 1. Y. cm FRASCOS PROMEDIO DESVEST A los 8 días es recomendable fraccionar los explantes, ya sea para resiembra o para llevarlos a la aclimatización. Debido a que en este tiempo están listos; además es importante considerar que por el número de frondas, se presenta competencia por los nutrientes y el espacio. Este análisis se complementó realizando la siembra con uno y con tres explantes, (Cuadro 12). A los 8 días los frascos con un explante presentaron 12.8 ± 3.76 frondas en promedio y los de 3 explantes 18.6 ± Los frascos con 3 explantes aunque presentaron mayor número de frondas, la mayoría presentó un tamaño pequeño (datos no presentados). 22

23 Cuadro 12. Número de frondas por frasco con uno y tres explantes de helecho cuerno de alce NÚMERO DE FRONDAS POR MUESTREO (, 2, 4, 6 y 8 días) CON UNO Y TRES EXPLANTES POR FRASCO DE 1. cm FRASCOS PROMEDIO DESVEST A los cuatro meses, las plántulas ya estaban aptas para ser transplantadas a sustrato (Cuadro 13). Cuadro 13. Número de plántulas obtenidas por frasco para aclimatización Número Tamaño de frondas frasco Chicas Medianas Grandes Total PROMEDIO DESVEST PORCENTAJE Se sugiere que debido al crecimiento de las frondas, cuando se requiera resembrar para mantenimiento in vitro, se coloquen tres explantes; no así, cuando se pretenda resembrar para aclimatizar las plántulas. En este último caso se recomienda colocar un solo explante por frasco, con lo que se dará mayor libertad de desarrollo a las frondas, evitando así el agotamiento del medio; ya que aunque sean menos plántulas, el tamaño es mayor. En frascos con plántulas de cuatro meses, es posible obtener un promedio de 32 plántulas con tamaño que va del chico al grande, y de acuerdo a lo reportado por Rodríguez-Serrano, (26), tienen mayor desarrollo las que tienen frondas medianas Aclimatización de plántulas de helecho cuerno de alce, utilizando filtros de color, se uso azul, amarillo, rojo, testigos negro y blanco. Se cuantifico el número de plantas sobrevivientes, número de frondas, longitud de la fronda más grande fértil, número de estomas, durante la aclimatización. Evaluación del número y desarrollo de frondas a los, 1, 3, 4 y 6 días durante la aclimatización con domo blanco (transparente), rojo, azul y negro (papel aluminio) A partir del transplante de plántulas a sustrato y durante las evaluaciones desde los hasta los 6 días, el número más alto de frondas formadas en promedio fue de 2.6 en el tratamiento azul, y el más bajo de 2 en el tratamiento rojo. En el Cuadro 14 se reportan los datos de cada uno de los 23

24 muestreos. Hubo plántulas que presentaron una sola fronda y la mantuvieron; otras ganaron frondas a los 1, 3 o 4 días después del transplante. También hubo algunas plántulas que sus frondas se marchitaron y se desprendieron; sin embargo, se observaron algunas plántulas excepcionales que de tener una fronda ganaron hasta 1 a los 6 días. En el caso del tratamiento negro, se dieron de baja las plántulas ya que no sobrevivieron en la oscuridad total. Cuadro 14. Total de frondas ganadas desde los hasta los 6 días en los diferentes tratamientos (CEPROBI, 26). Exposición de helechos a diferentes filtros de color Macetas Transparente Rojo Azul Negro Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Prom Baja Des. Est Baja Las charolas con filtro de color rojo presentaron en promedio 2 frondas a los 6 días con una desviación estándar de 2.. Mientras que la plantas con filtro azul tuvieron una ganancia de 2.6 frondas a los 6 días después del transplante y sujetas a 26 C y un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad. Es muy importante mencionar que el número de frondas por planta fue muy similar en este tratamiento no presentarán segregación (desviación estándar.7) (Cuadros 14). El productor en los compromisos de venta, ya que el número de frondas será parejo entre los helechos. La longitud de las plantas fue mayor en las expuestas al domo transparente (1.4), dato numérico diferente a las expuestas al filtro rojo y azul; estas dos últimas muy semejantes (Cuadro 1). Es posible que para la propagación comercial, se expongan las plántulas a filtro azul para obtener un mayor número de frondas y después de 6 días retirar el filtro para incrementar la longitud de estas, pudiendo ser el periodo de aclimatización de 6 a 9 días; considerando 3 días más sin filtro. 24

25 Cuadro 1. Longitud de frondas desde los hasta los 6 días en los diferentes tratamientos (CEPROBI, 26). Exposición de helechos a diferentes filtros de color Macetas Transparente Rojo Azul Negro Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Baja Prom Baja Des. Est Baja Las plántulas fueron medidas al inicio, por lo que se clasificaron como: chicas, medianas y grandes). A los 6 días, de acuerdo a los datos numéricos se observó que las plantas que presentaron una longitud de entre 1. a 2.3 cm al transplante fueron las que acumularon una longitud de 3. a 3.3 cm a los 6 días. En el Cuadro 16, se muestra el promedio de la intensidad luminosa durante los 6 días de observación, alcanzada de acuerdo a cada tratamiento. Mostrando que las charolas que tuvieron mayor intensidad luminosa fueron las de filtro blanco, debido a que por el filtro (transparente) absorbieron mayor luz, obteniendo el promedio más alto de µmol.m 2.seg -1, siguiéndole el tratamiento el rojo y azul con 7.4, y al final el tratamiento negro con un promedio de 1.8 µmol.m 2.seg -1 (tomando en cuenta que solo se evaluó una vez, ya que se dieron de baja antes de los 1 días después de su aclimatización) de intensidad luminosa. Cuadro 16. Promedio de la intensidad luminosa (µmol.m 2.seg -1 ) alcanzada en el cuarto de incubación de acuerdo a cada tratamiento (CEPROBI, 26). Tratamiento Muestreos cada 1 días dentro de cada charola (µmol.m 2.seg -1 ) Color de filtro Promedio Blanco Rojo Azul Negro µmol.m 2.seg -1 : Micro moles por metro al cuadrado por segundo a la menos uno (cantidad de fotones que llega a la superficie que se mide) Las charolas expuestas a mayor intensidad luminosa presentaron un mejor desarrollo debido posiblemente a que con la presencia de luz, se realizan las funciones de fotosíntesis, 2

26 incrementándose la longitud de las células; mientras que en la oscuridad se incrementa el número de células, reflejándose en el aumento en el número de frondas..- Las plántulas de helecho cuerno de alce expuestas, alcanzaron promedios de: - Filtro transparente 2.3 frondas y una longitud de 1.4 cm a los 6 días. - Filtro rojo 2. frondas y una longitud de 1.1 cm a los 6 días. - Filtro azul 2.6 frondas y una longitud de 1. cm a los 6 días. 2.- Las plántulas de 1. a 2.3 cm al transplante fueron las que acumularon una longitud de 3. a 3.3 cm a los 6 días en los tres tratamientos. 3.- El número de estomas en la región adaxial (envés) de las fronda fue semejante en todos los tratamientos. 4.- Las plántulas provenientes de in vitro, y en los tratamientos de los filtros de color no presentaron estomas en la región axial (haz); no así las plantas ex vitro, presentaron estomas altamente nítidos en las dos regiones (axial y adaxial). Se amplia información e imágenes en los escritos de la tesis sustentadas de licenciatura. Evaluación de calidad de plantas y flores de cempazúchil Exposición de semillas para inducir la germinación en diferentes calidades de luz. En laboratorio (lámparas) y bajo malla policromática (azul, roja, negra y gris) Evaluación del desarrollo de plantas, intensidad de floración y contenido de carotenoides. En las condiciones ensayadas de acuerdo a la prueba estadística no se detectó un efecto significativo de la iluminación sobre el poder germinativo de T. erecta ni sobre el crecimiento de las plántulas, con las lámparas de color, pues se observó que en los tratamientos con luz: roja, azul, amarilla y blanca, se obtuvo un porcentaje de germinación que fue homogéneo durante las primeras 48 h posteriormente, se observan ligeras variaciones en la velocidad de germinación. Se encontró el efecto positivo de la luz en la germinación de las semillas de T. erecta ya que los porcentajes de germinación e IVG de los tratamientos con luz, de todos los lotes, superaron a los tratamientos de oscuridad. Los dos tratamientos que generaron los porcentajes de germinación más altos fueron los que contaban con luz roja y azul, mientras que en oscuridad presentó el valor más bajo y fue diferente al resto de los tratamientos (Figura 9). Figura 9. Prueba de germinación en caja Petri con las semillas de T. erecta. 26

27 Efecto de la malla sombra de color sobre la fenología de Tagetes erecta I. Las plantas terminada (listas para la venta) fueron: Malla Roja = 77% Malla Gris = 19% Malla Azul = 13% Malla Negra = 21 % II. El porcentaje de flores abiertas contra cerradas (en botón) para esta fecha y desde un punto de vista como atractivo comercial: Malla Roja = 7% Malla Gris = 67% Malla Azul = 64% Malla Negra = 44% III. La carga total de flores (abiertas y cerradas) por planta fue: Malla Roja = 2 Malla Gris = 1 Malla Azul = 14 Malla Negra = 9 Bajo malla roja se consiguió el mejor porte de planta, mayor precocidad, mejor uniformidad en crecimiento y el más alto porcentaje coincidente para venta. Logró el mayor número de flores, notoriamente de mayor tamaño y el menor nivel de infestación de mosca blanca Para el analisis de carotenoides se definieron cuatro etapas de desarrollo de la flor (Figura 1) Figura 1. Establecimiento de las cuatro etapas de las inflorescencias de cempaxúchil I. Pedúnculo corto, II. Pedúnculo largo, III. 2 % de lígulas expuestas (flor semiabierta), IV. 1% de lígulas expuestas (flor abierta) para el análisis de la cuantificación de xantofilas totales. Extracción y cuantificación del contenido de xantofilas totales por espectrofotometría uv/vis Xantofilas Totales (g/kg) Intemperie Malla Roja Malla Azul Malla Gris Malla Negra Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Etapas de Desarrollo Figura 1. Contenido de xantofilas totales en las cuatro etapas de desarrollo. 27