TREONIN PROTEINASAS: EL PROTEASOMA

Transcripción

1 TREONIN PROTEINASAS: EL PROTEASOMA

2 Clan PB, Familia T1 El descubrimiento de un quinto tipo catalítico se produjo cuando se determinó la estructura cristalográfica del proteasoma eucariótico de S. cerevisiae, que mostró una treonina N-terminal en el sitio activo. El tipo catalítico del proteasoma había sido un misterio hasta entonces, por su resistencia a la inhibición por la mayoría de los inhibidores standard de peptidasas. CLAN PB Descripción: Thr, Ser or Cys como nucleófilo en el N-terminal de la enzima madura. El Clan PB contiene endopeptidasas y proteínas autoprocesantes. Las Familias se asignan al clan PB en base a plegamiento similar o a un nucleófilo N-terminal. El clan contiene cistein, serin y treonin peptidasas. El residuo N- terminal de la proteína madura es catalítico, siendo tanto el nucleófilo como la base general (el grupo amino). Por esta razón, las proteínas con este plegamiento se conocen como N-terminal nucleophile (Ntn) hydrolases.

3 - El proteasoma, inicialmente llamado proteasa multicatalítica por tener (los eucarióticos) tres actividades, denominadas trypsin-like, chymotrypsin-like y peptidylglutamyl peptide hydrolase (tambien llamada caspase-like ), en tanto que el de Thermoplasma acidophilum tiene sólo una, la chymotrypsin-like, fué descubierto por microscopía electrónica mucho antes de demostrarse su actividad proteolítica. - Visto de costado da una imagen rectangular, y de frente una imagen circular. Tiene la forma de un barrilito, que consta de cuatro anillos formados por siete subunidades cada uno, de MW entre 22 y 34 kda, los externos por las subunidades a y los internos por las subunidades b. Los sitios activos están en las subunidades b. El proteasoma de T. acidophilum tiene 7 subunidades b con sitio activo; el eucariotico tiene solo 3 subunidades b activas, cada una con una especificidad. El MW del proteasoma 20S es 700 kda; cuando se le agregan las tapas de 19S para formar el proteasoma 26S (eucariótico) el MW aumenta a alrededor de 2000 kda. Los proteasomas se localizan en el citoplasma (algunos asociados a la cara externa del retículo endoplásmico) y en el núcleo. - El mecanismo catalítico involucra a un residuo de Thr N-terminal, que en algunos casos puede ser reemplazado por Ser, conservando actividad, pero Thr se requiere para el procesamiento de la prosubunidad. El pro-dominio de las subunidades puede variar en longitud entre unos pocos residuos (8 en T. acidophilum) hasta mas de 60. En la síntesis, se ensamblan primero los anillos a y luego sobre ellos se agregan y procesan las subunidades b. - El proteasoma es inhibido por diversos inhibidores; algunos inhiben tambien otras proteinasas, como el Z-leucinyl-leucinyl-leucinal y el inhibidor I de calpaína, y otros son mas específicos, como la lactacistina. Funciones: degradación de proteínas mal plegadas, de proteínas de vida corta, de factores de transcripción y proteínas involucradas en el ciclo celular. El inmunoproteasoma participa en la presentación de peptidos antígenicos al MHC I.

4 Proteasoma 20 S de Thermoplasma acidophilum.

5 Subunidad b del proteasoma de Thermoplasma acidophilum.

6 Arqueas Eucariotes Bacterias

7 ESTRUCTURA DEL PROTEASOMA 26S El proteasoma 20 S es activado por particulas regulatorias o tapas, que se unen a sus extremos e inducen un cambio conformacional que abre el canal interno del proteasoma, de las cuales se conocen 4. La mejor estudiada es la particula 19S, que consiste de 19 subunidades que agregan un peso de unos 900 kda. El complejo de una o dos de estas tapas con el 20S se denomina proteasoma 26 S. Las subunidades de 19S reconocen a los sustratos, los despliegan y los translocan al interior de la particula 20S para su degradacion en peptidos cortos. La mayor parte de esta tapa consiste de 6 subunidades de ATPasa AAA, con un dominio ATPasa y un dominio OB, y de 7 subunidades de andamiaje, que van desde el extremo del proteasoma hasta el anillo de subunidades a. A estas subunidades se les agregan dos grandes subunidades que sirven de plataformas de interaccion, Rpn1 y Rpn2. Rpn1 liga Ubl-UBA proteinas, que son receptores adicionales de Ub, en tanto que Rpn2 organiza los dos receptores de Ub, Rpn10 y Rpn13, La tapa contiene tambien un par de subunidades de metalopeptidasa, Rpn11 (enzimaticamente activa) y Rpn8; la primera cliva las cadenas de poliubiquitina a medida que el sustrato va entrando al canal de 20S. Proteínas adaptadoras UbL-UBA: UbL (ubiquitin-like, como Rad23) se une al proteasoma, y UBA (ubiquitinassociated) a proteínas ubiquitinadas.

8 Schematic representation of the degradation cycle of the ubiquitin proteasome system. Proteins are targeted to the proteasome by a two-part degradation signal or degron. It consists of a disordered region within the substrate and a reversibly attached polyubiquitin tag (Ub n ). Polyubiquitin tag is attached by a E1 E2 E3 ubiquitination cascade and this process can be reversed by DUBs (top left). The proteasome recognizes its substrates at the ubiquitin tag through ubiquitin receptors (Rpn10 and Rpn13; green) (top) and initiates degradation at the unstructured region (right). Once the proteasome has engaged its substrate, it unravels the protein by translocating it into a central cavity in the core particle, where the protein is proteolysed (bottom). The polyubiquitin tag is cleaved off by the intrinsic DUB Rpn11 (skyblue) as unfolding and degradation begins

9 The proteasome recognizes substrates in three different modes; ubiquitin-dependent (left), adaptermediated (middle), and ubiquitin-independent (right) modes. In all three modes, an intrinsically disordered region in the substrate is recognized by the ATPase motor to allow the proteasome to initiate degradation. This aspect of proteasomal degradation resembles the targeting mechanisms predominant with the bacterial and archaeal analogs of the proteasome. Ubiquitin tags can be either recognized by the two intrinsic proteasome receptors Rpn10 and Rpn13 (left), or by non-stoichiometric proteasome subunits that serve as substrate adaptors such as UbL-UBA proteins (middle). The UbL- UBA proteins might bind substrates by themselves (second right) or together with the intrinsic substrate receptors (second from left) and facilitate degradation of by positioning the disordered region properly. Finally, some substrates may be recognized only by their initiation sites.

10 En presencia de citokinas inflamatorias como el IFNg o el TNFa, se sintetiza una variante del proteasoma, el inmunoproteasoma, que tiene reemplazadas 3 subunidades b, por subunidades b específicas, resultando en una actividad caspaselike muy disminuída y en una chymotrypsin-like aumentada. Además, el complejo 19S es reemplazado por el complejo 11S, el cual permite la apertura del canal del 20S sin necesidad de ubiquitinación de la proteína a degradar. Puede haber inmunoproteasomas híbridos, con ambas caps, 19S y 11S, una en cada extremo.

11 El inmunoproteasoma se ensambla de novo, y lleva a un incremento considerable de la formación de péptidos inmunogénicos, que serán presentados por el MHC clase I.

12 Chaperonas: HsP70, HsP90a, TriC. TAP1 y TAP2: Transportadores asociados con el procesamiento de antigenos. ERAP 1 y 2: aminopeptidasas del RE. b2m: b2 microglobulina. ERp57: oxidoreductasa del RE. TCR: receptor de la célula T.

13 ASPARTIL PROTEINASAS

14 Aspartil Peptidasas Las proteasas aspárticas son una familia de proteasas que usa dos residues de Asp altamente conservados en el sitio activo para catalizar el clivaje de sus sustratos. El mecanismo de acción generalmente aceptado es un mecanismo general ácido-base que involucra la coordinación de una molécula de agua entre los dos residuos de Asp altamente conservados. Un aspartato activa el agua quitándole un protón, permitiendo que el agua ataque el carbono del carbonilo de la unión a romper en el sustrato, generando un intermediario tetraédrico oxianion. El rearreglo de este intermediario lleva a la protonación de la amida a cortar.

15 PEPSINA (CLAN AA, FLIA A1) La pepsina es la principal proteasa ácida del estómago. Se la reconoce generalmente como la primera enzima descubierta (en el Siglo XVIII) y recibió su nombre de T. Schwann en La pepsina fué la segunda enzima cristalizada (Northrop,1930), después de la ureasa (Sumner, 1926). La secreción de la pepsina por la mucosa gástrica es estimulada por la gastrina. La pepsina es sintetizada en la mucosa gástrica y secretada a la luz del estómago como un zimógeno, el pepsinógeno, que contiene un propéptido extra de 44 residuos en el N-terminal. Al llegar al medio ácido del estómago, el pepsinógeno es convertido en pepsina por la remoción del propéptido. La pepsina es una endopeptidasa con especificidad amplia. El rango de ph para la hidrólisis de péptidos es desde menos de 1 hasta alrededor de 6, con un óptimo kcat / Km cerca de ph 3.5

16 PEPSINA Complejo con pepstatina

17 PEPSINOGENO

18 Quimosinas naturales (Clan AA, Flia A1) Aspartil proteasa. Producida por las células principales en el estómago de las vacas. Su rol en la digestión consiste en coagular la leche en el estómago, un proceso muy importante en animales jóvenes. Si la leche no se coagulara fluiría muy rápidamente a través del estómago y se perdería la oportunidad para la digestión inicial de sus proteínas. La quimosina cliva proteolíticamente e inactiva a la caseína kappa, convirtiéndola en para-kappa caseína y una proteína más pequeña llamada macropéptido. La para-kappa caseína no tiene la capacidad de estabilizar la estructura micelar y las caseínas insolubles por calcio precipitan.

19 Retropepsina del HIV (Clan AA, Flia A2) La proteasa del HIV (HIV-1 PR), se ha transformado en el sistema mas profundamente estudiado en la historia de las enzimas. Esto es notable, dado que el descubrimiento inicial de la enzima data del informe de la secuencia de nucleótidos del genoma viral en 1985 (Ratner et al., 1985). La Food and Drug Administration (FDA) de USA aprobó para el tratamiento antiviral en humanos seis compuestos (Junio de 2003). Debido a la rápida mutación de la proteína viral, han debido generarse muchos nuevos inhibidores, y obtener estructuras de la enzima en complejo con ellos. Al 30 de Mayo de 2016 había 306 estructuras, la mayoría en complejos con inhibidores, en PDB. Las proteasas virales tienen la función de cortar la poliproteína viral inicialmente formada por traducción del mrna viral, para dar las unidades constitutivas funcionales del virus. La proteasa del HIV necesita dimerizarse para formar una enzima funcional. En la familia de la pepsina (A1) un ácido aspártico es contribuido por el dominio N-terminal (residuo 32 en la pepsina) y otro por el dominio C-terminal (residuo 215 en la pepsina) para formar la maquinaria catalítica. En las retropepsinas, la proteasa viral contribuye uno de los Asps en la secuencia -Xaa-Xaa-Asp-Thr- Gly- (donde Xaa es un residuo hidrofóbico). Se requieren dos de estos monómeros unidos para formar la enzima funcional.

20 RETROPEPSINA (HIV)

21 Inhibidores de APs Casi todas las aspartil proteasas son inhibidas por la pepstatina, un hexa-péptido natural que contiene el aminoácido inusual estatina (Sta, ácido (3S,4S)-4- amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico).

22 METALOPEPTIDASAS

23 Metalopeptidasas: Mecanismo de reacción. Generally accepted catalytic mechanism of monometallic MPs. The catalytic solvent molecule is bound first to the catalytic metal ion (white sphere) and the general base/acid in the active site in the absence of a peptidic substrate (I) Once the substrate is accommodated in the cleft and the Michaelis complex is formed (II), the polarized solvent molecule attacks the scissile carbonyl group, which leads to the tetrahedral reaction intermediate (III). The latter resolves in scissile bond breakage and double proton transfer to the newly formed a-amino group to render a double-product complex (IV).

24 Matrilisina (Matriz metalopeptidasa-7) humana The catalytic zinc is shown as a light grey sphere. Structural calcium ions are shown as yellow spheres. The zinc ligands are shown in ball-and-stick representation: His214, His218 and His224 in purple. The catalytic Glu215 is shown in blue. Bound inhibitor is shown in grey in ball-andstick representation

25 LEISHMANOLISINA - Leishmania major

26 OTRAS CLASES CATALÍTICAS: GLUTAMIL PEPTIDASAS Y ASPARAGINIL PEPTIDASAS.

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28 Familia N8: Asparaginil peptidasas. Incluye a la proteína de cápside de tipo VPO autoclivable del poliovirus. En la figura, se muestra la proteína similar del rhinovirus 14. La Asn 68 es la catalítica. Hay 5 clanes de asparaginil peptidasas; la mostrada pertenece al Clan NA.

29 Familia N4: El dominio autoclivable asociado a Tsh de E. coli. Los autotransportadores son factores de virulencia secretados por bacterias patógenas. El propéptido C-terminal forma un poro en la membrana externa a través del cual la peptidasa (el dominio pasajero) puede pasar. El autoclivage en Asn 1100 libera la peptidasa.

30 PROBLEMAS QUE PRESENTAN LAS PROTEINASAS EN LA PURIFICACIÓN DE OTRAS PROTEÍNAS. APLICACIONES DE LAS PROTEINASAS EN BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA CELULAR Y BIOLOGÍA MOLECULAR.

31 LAS PROTEINASAS COMO UN PROBLEMA EN PURIFICACION DE PROTEÍNAS. SINTOMAS QUE SUGIEREN UN PROBLEMA PROTEOLITICO: 1) Ausencia de una proteína específica (por actividad o inmunorreactividad). 2) Bajos rendimientos en la purificación o pérdida de actividad, por ejemplo durante el almacenamiento de las muestras. 3) Cambios en la actividad de la proteína. P.ej.: especificidad, dependencia del ph, etc. Puede deberse a proteólisis limitada. P.ej.: la tirosina aminotransferasa (TAT) de hígado de mamífero cuya región N-terminal se conoció sólo al secuenciar el cdna, pues se proteoliza al romper los hepatocitos. 4) Discrepancias en las propiedades de la misma proteína purificada en distintos laboratorios o por métodos alternativos (patrón de isoformas, datos de secuencia N-terminal).

32 SINTOMAS EN SDS-PAGE QUE SUGIEREN UN PROBLEMA PROTEOLITICO. 1) Pobre resolución de bandas y alto background de tinción. 2) Pérdida de bandas de alto peso molecular y aumento del material de bajo peso molecular. 3) Discrepancias en el valor de peso molecular informado por diversos laboratorios, o de la misma proteína obtenida por métodos alternativos. 4) Disminución del peso molecular aparente durante el almacenamiento. 5) Aparición de dos bandas con peso molecular menor, con pérdida de una única banda con peso molecular igual a su suma. 6) Número variable de subunidades en preparaciones de proteínas multifuncionales.

33 PROBLEMAS PROTEOLITICOS QUE PUEDEN SUCEDER DURANTE LA SDS-PAGE. 1) Las condiciones desnaturalizantes empleadas en SDS-PAGE despliegan a las proteínas y las hacen mas vulnerables a la proteólisis. 2) Algunas proteinasas no se inactivan completamente en condiciones desnaturalizantes standard, sobre todo si no se hierve la muestra a sembrar. 3) Los complejos proteinasa-inhibidor se disocian. 4) Los agentes reductores, como el b-mercaptoetanol, activan a las cisteina proteinasas.

34 FORMAS DE EVITAR (O MINIMIZAR) LA PROTEOLISIS DURANTE LA PURIFICACION DE UNA PROTEINA. 1) ph y buffers: Buscar un buffer y un valor de ph que no sea el óptimo para las proteinasas conocidas en el material de partida. 2) Temperatura: Trabajar en frío y guardar las muestras congeladas (a - 70 o C de ser posible), salvo que la proteína no lo soporte. 3) Tiempo: Trabajar tan rápido como sea posible. Usar inhibidores de proteinasas durante las etapas que insumen mucho tiempo (p. ej.: una diálisis de toda la noche). 4) Agentes estabilizadores: P. ej.: glicerol, al %, o DMSO, al 10 % 5) Agregado de proteínas exógenas: P. ej.: 1-5 mg de seroalbúmina bovina por ml. 6) Agregado de efectores: Sustratos, análogos de sustratos, cofactores, efectores alostéricos, si el complejo de la proteína y el efector es mas estable que la proteína sola. 7) Uso de cócteles de inhibidores de proteinasas.

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36 USO DE PROTEINASAS EN SECUENCIACION DE PROTEINAS Para la digestión parcial de las proteínas previa a su secuenciación por Edman o MS, se utilizan distintas proteinasas con diferentes especificidades. Serin proteinasas: Tripsina - Quimotripsina - Subtilisina - Glu-C - Lys-C - Arg-C. Cistein proteinasas: Papaína. Metaloproteinasas: Termolisina. Aspartil proteinasas. Pepsina. Actualmente lo mas frecuente es efectuar la digestión en el fragmento de gel de proliacrilamida, y luego extraer los péptidos para efectuar RP- HPLC o MS.

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38 ALGUNAS PROTEINAS ESTUDIADAS POR PROTEOLISIS LIMITADA. ES ESENCIAL DETENER LA PROTEÓLISIS CON UN INHIBIDOR ADECUADO 1) MIOSINA. Clivaje con quimotripsina, detenido con PMSF. Produce las meromiosinas pesada y liviana. 2) COMPLEJO ASPARTOQUINASA-HOMOSERINA DEHIDROGENASA. Clivaje con quimotripsina, detenido con PMSF. Se aísla el fragmento C- terminal de 55 kda que contiene la actividad de homoserina dehidrogenasa. 3) DNA POLIMERASA I. Clivaje con subtilisina, en presencia de DNA. Detenido con PMSF. Separa el fragmento N-terminal de 35 kda del fragmento C-terminal de 68 kda. Este último es el fragmento Klenow, con actividad de polimerasa y 3-5 -exonucleasa.

39 USO DE PROTEINASAS PARA DETERMINAR LA TOPOLOGIA DE PROTEINAS DE MEMBRANA

40 USO DE PROTEINASAS PARA DETERMINAR LA TRANSLOCACIÓN DE PROTEINAS A ORGANELAS.

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43 USO DE PROTEINASAS PARA PROCESAR PROTEINAS EXPRESADAS COMO PROTEINAS DE FUSION.

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45 Urogastrona (human epidermic growth factor). La proteína intacta es rápidamente degradada por E. coli, pero se la estabiliza fusionando la proteína TrpE al N-terminal y se facilita su purificación fusionando poli-arg al C-terminal. Va a cuerpos de inclusión. Se solubiliza con urea y se purifica por intercambio iónico aprovechando la poli-arg. Se digiere con tripsina para eliminar las fusiones, pero debe controlarse muy bien la digestión.

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47 Purificación de aspartato aminotransferasa fusionada a 7 residuos de Arg en el C-terminal, que se eliminan usando la carboxipeptidasa B, específica para aminoácidos básicos en el C-terminal.