introducción Propiedades que las diferencian de otros tipos de reordenamientos en proteínas:

Transcripción

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3 introducción En 1990 se descubre la primera inteína Propiedades que las diferencian de otros tipos de reordenamientos en proteínas: Secuencia característica de la inteína. Reacción autocatalítica en ausencia de proteínas exógenas,, cofactores o fuentes de energía. Formación de un enlace peptídico entre las exteínas.

4 Estructura

5 Mecanismo estándar del splicing de proteínas

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11 Inteína libre + exteínas unidas por un enlace peptídico

12 Inteínas como enzimas. Aceleran reacciones: Alineamiento de grupos reactivos. Haciendo más nucleófilos los grupos atacantes, y más electrófílo el carbonilo del enlace escindible. Estabilizando los estados de transición tetraédrica. Protonación y desprotonación.

13 Secuencias de las exteínas cercanas a la inteína. Los precursores han evolucionado para maximizar la eficiencia del splicing. Las inteínas en diferentes lugares de inserción normalmente realizan el splicing unas 10 veces más lento y/o dan lugar a un precursor inactivo. Diferentes inteínas muestran variedad en el grado de especificidad por el sustrato. En general, el splicing mejora cuando la secuencia nativa de las exteínas flanquea a la inteína por uno o los dos lados.

14 Dos histidinas conservadas. Mutaciones y datos estructurales indican que la His en el bloque B ayuda a activar la unión en el splicing en el N-terminal. La His que ocupa el penúltimo residuo de la inteína activa el ayuste en C-terminal. Parece que esta His debe protonar el nitrógeno de la amida del enlace que se separa al ciclarse la Asn.

15 Dos histidinas conservadas.

16 Diferentes modos de ayuste. -Inteínas con Ala1. Estas han perdido la manera de realizar el ataque nucleófilo requerido en el extremo amino para poder formar el intermediario (Tio( Tio) ester lineal. La Cys +1 ataca directamente un enlace amida en el N terminal formándose el intermediario ramificado.

17 Inteínas con Ala1. El mecanismo de estas inteínas seguiría 3 pasos (se elimina el primer paso del proceso estándar). En las inteínas estándar si se muta para que el primer residuo sea una Ala, se detiene el splicing.

18 Inteínas con Ala1. El análisis de la inteína de KlbA de Methanococcus jannaschii mostró: 1. Ayuste eficiente en E.coli. 2. Aparecía el intermediario ramificado estándar. 3. Requeria Cys +1 en el ayuste, para formar el inermediario ramificado. 4. La Asn del C terminal es necesaria para escindir la exteína-c. 5. Thr e His activan el ayuste de la parte N terminal. 6. Se observa el intermediario tioester lineal estándar cuando se da la reversión de Ala1 a Cys1.

19 Inteínas que acaban en Gln o Asp. Experimentan los mismos reordenamientos que con la Asn dando también como resultado un enlace peptídico. Se ha visto también que la His (penúltimo residuo de la inteína) ) ayuda al ayuste en el extremo C.

20 Inteínas que acaban en Gln. Estudios en las inteínas RNR del virus Chilo iridescent y Pol III de Pyrococcus abyssi, mostraron diferentes resultados cuando se revertió la Gln por Asn: -En la inteína de RNR la tasa de ayuste se vio reducida 7 veces. -En la de Pol III aumentó 4 veces.

21 Inteínas que acaban en Asp. Es el caso de la inteína de RNR de Carboxydothemus hydrogenoformans. Se observa que el ayuste se sigue dando al cambiar este Asp por Asn, Gln y Glu formando un enlace peptídico al ciclarse.

22 Aplicaciones biotecnológicas de las inteínas.

23 Vectores de purificación de proteínas. Reacciones de escisión aisladas y controladas. Para controlar el corte del N-terminal, se limita la reacción al primer paso del ayuste. Normalmente mutando la Asn C-terminal y el aa +1. El enlace tioester resultante es generalmente estable hasta que se da un ataque nucleófilo. El enlace tioester del C-terminal ha sido utilizado para unir diferentes tipos de moléculas a proteínas diana.

24 Vectores de purificación de proteínas.

25 Estrategias para unir polipéptidos. Se han utilizado dos técnicas basadas en inteínas para unir polipéptidos: 1. Trans-splicing splicing. 2. Unión de la proteína expresada mediada por inteína.. (EPL o IPL). Ambos métodos producen una proteína formada a partir de dos o más fragmentos, permitiendo numerosos tipos de modificaciones de segmentos.

26 Trans-splicing splicing El trans-splicing splicing esta limitado por las preferencias por el sustrato que tenga la inteína. En el trans-splicing splicing,, fragmentos de precursores se reorganizan para formar una inteína funcional.

27 EPL. Técnica in vitro Mediante la inteína se forman polipéptidos con un α-tioester C-terminal que son unidos a polipéptidos que empiezan con una Cys. Forma un enlace peptídico. El α-tioester permite la unión de polipéptidos a numerosos tipos de moléculas. Sin embargo el enlace peptídico solo se forma si la molécula se une a una Cys con un grupo amino libre.

28 EPL.

29 Estrategias para unir polipéptidos. han sido utilizadas para: Aumentar el límite de tamaño en análisis NMR. Introducir modificaciones post-traduccionales traduccionales. Introducir aminoácidos no naturales. Introducir estados de transición análogos y biosensores. Limitar la transferencia de transgenes no deseados en plantas. Expresar proteínas citotóxicas.

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31 Unir proteínas a soportes sólidos o a transportadores. Las inteínas han sido utilizadas para sintetizar microarrays de proteínas uniendo las proteínas a un dominio de unión a superficies sólidas. Ej.: proteínas diana con α-tioester fueron inmovilizadas en una superficie de cristal al reaccionar con Cys unida al cristal mediante polietilen glicol. Ej.: se añadió biotina a las proteínas utilizando EPL y estas se unieron al soporte sólido con avidina.

32 Unir proteínas a soportes sólidos o a transportadores. Ensayos para conocer las uniones específicas a un péptido están a veces limitados por la incapacidad de los péptidos para unirse a soportes sólidos. Este obstáculo se supera utilizando EPL para unir a los péptidos a una proteína transportadora que tenga buenas características de unión y baja reactividad a anticuerpos.

33 Interruptores biomoleculares in vivo. Manipulando el ayuste en proteínas conseguimos que las inteínas actúen como interruptores moleculares. Mutantes sensibles a temperatura para el splicing insertados en Gal4 y Gal80 han sido utilizados para controlar espacial y temporalmente la expresión de genes en levaduras y Drosophila.

34 Interruptores biomoleculares in vivo.

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