LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN Y DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES CUARENTENARIAS DE PLANTAS CULTIVADAS EN MÉXICO

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3 LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN Y DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES CUARENTENARIAS DE PLANTAS CULTIVADAS EN MÉXICO Informe de Procesos OBJETIVOS Los objetivos primordiales del Laboratorio de Investigación y Diagnóstico de Enfermedades son: 1. Aplicar protocolos de diagnóstico molecular del Huanglongbing (HLB) en insectos y tejido vegetal, mismos que son aplicados por la red de laboratorios dentro del programa de vigilancia epidemiológica fitosanitaria. 2. Apoyar el diagnóstico de las enfermedades cuarentenarias de las plantas cultivadas en México, que se mantienen dentro del programa de vigilancia epidemiológica fitosanitaria. 3. Consolidar la red de laboratorios del sector oficial para fortalecer la estrategia nacional de detección y diagnóstico del huanglongbing en el país. Metas cumplidas. Las metas establecidas del laboratorio para 2011 fueron las de realizar diagnósticos mediante PCR de 400 muestras sospechosas de plantas infectadas o vectores portadores de Candidatus Liberibacter, agente causal del Huanglongbing. En el laboratorio se procesaron muestras colectadas y recibidas de los estados de Campeche, Colima, Michoacán, Nuevo León, Sinaloa, Veracruz y Yucatán. En total se analizaron 460 muestras, de las que 206 fueron especímenes del psílido asiático, Diaphorina citri, 7 de especímenes de chicharritas (provenientes de Michoacán) y 247 de plantas, principalmente de limón Mexicano y Persa (Tablas 1 y 2). Además, 20 muestras positivas para HLB provenientes de Tecomán, Colima, se utilizaron para aplicar tres protocolos de extracción de DNA, a las cuales se les realizó un segundo análisis mediante PCR (Tabla 3), para totalizar una ejecución de 580 procesos. En el laboratorio además se realizaron análisis de muestras locales de naranjo y mandarina para el diagnóstico de muerte por Phytophthora spp., ataque de Elsinoe fawcetti, Alternaria citri, fitoplasmas, quimeras de fruto y follaje, y daños por herbicidas. 3

4 RESULTADO TIPO MUESTRA ESTADO PCR PCR QT TOTAL OBSERVACIONES NEG POS Psílido, Diaphorina citri Veracruz (2010) Planta, limón Mexicano Colima (2010) Planta, limón Persa Veracruz (2010) Psílido, Diaphorina citri Veracruz (2011) Psílido, Diaphorina citri Colima (2011) Planta, limón Mexicano Colima (2011) Planta, limón Persa Veracruz (2011) También se realizó para fitoplasmas; los resultados fueron negativos. Planta, limón Persa Veracruz (2011) Planta, limón Persa Veracruz (2011) Análisis sugeridos por el Dr. Yong-Ping Duan (USDA- ARS, Florida) para plantas diagnosticadas por él en Ixtacuaco, Ver. Diciembre 1 de TOTAL DE MUESTRAS ANALIZADAS MEDIANTE PCR 156 Tabla 1. Diagnósticos realizados de muestras de cítricos con síntomas aparentes de HLB, mediante PCR y PCR QT. Laboratorio de Investigación y Diagnóstico de Enfermedades. Módulo 1, 2011.

5 TIPO DE MUESTRA ESTADO PCR PCR QT RESULTADO NEG POS TOTAL OBSERVACIONES Planta, limón Mexicano Nuevo León (2010) Se realizó análisis de fitoplasmas; una muestra positiva Psílido, Diaphorina citri Sinaloa (2010) Planta, limón Mexicano Sinaloa (2011) Psílido, Diaphorina citri Yucatán (2010) Psílido, Diaphorina citri Campeche (2011) Psílido, Diaphorina citri Colima (2010) Planta, limón Mexicano Colima (2010) Psílido, Diaphorina citri Sinaloa (2010) Psílido, Diaphorina citri Michoacán (2010) Planta, limón Mexicano Colima (2010) Psílido, Diaphorina citri Colima (2010) Psílido, Diaphorina citri Yucatán (2010) Planta, limón Mexicano CEGET, Nuevo León (2011) Psílido, Diaphorina citri Michoacán (2011) Planta, limón Mexicano Colima (2011) Psílido, Diaphorina citri Veracruz (2011) Se utilizó la inmunocaptura Chicharritas Michoacán (2011) Planta, limón Mexicano Nuevo León (2011) También se realizó para fitoplasmas con resultados negativos También se realizó para fitoplasmas con resultados negativos TOTAL DE MUESTRAS ANALIZADAS MEDIANTE PCR 284 Tabla 1. Diagnósticos realizados de muestras de cítricos con síntomas aparentes de HLB, mediante PCR y PCR QT. Laboratorio de Investigación y Diagnóstico de Enfermedades. Módulo 2, 2011.

6 TIPO DE MUESTRA ESTADO PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL MUESTRAS ANALIZADAS Planta, limón Mexicano Colima (2011) Murray y Thompson, Planta, limón Mexicano Colima (2011) Almeyda et al Planta, limón Mexicano Colima (2011) Rodríguez et al min de incubación 20 Planta, limón Mexicano Colima (2011) Rodríguez et al min de incubación 20 Planta, limón Mexicano Colima (2011) Rodríguez et al min de incubación 20 Planta, limón Mexicano Colima (2011) Rodríguez et al min de incubación 20 Planta, limón Mexicano Colima (2011) Rodríguez et al min de incubación 20 TOTAL 140 Tabla 1. Diagnósticos realizados de muestras de cítricos con síntomas aparentes de HLB, mediante PCR convencional con la utilización de tres protocolos de extracción de ADN. Laboratorio de Investigación y Diagnóstico de Enfermedades, 2011.

7 Figura. Gel de resultados de muestras de psílidos provenientes de colectas en huertos de c tricos de N.L., efectuadas por personal del ComitŽ Estatal de Sanidad Vegetal de Nuevo Le n. Carril 2 : Testigo Positivo CLas. Carriles 19-27: Resultados negativos de las muestras procesadas. LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN Y DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES CUARENTENARIAS DE PLANTAS CULTIVADAS EN MÉXICO. Personal Responsable Y De Operación Figura 1. Dr. Raúl Rodríguez Guerra El laboratorio es operado bajo la dirección de los Drs. Raúl Rodríguez Guerra (Fig. 1.) e Isidro H. Almeyda León (Fig. 2); ambos investigadores de tiempo completo del INIFAP y con Doctorados en Biología Molecular por el CINVESTAV-Unidad Irapuato y la Universidad Autónoma de Nuevo León, respectivamente. Los responsables del laboratorio son auxiliados por los Q.B.P. Raúl A. Rodríguez Villareal y Verónica Cervantes Espinosa, ambos egresados de la Universidad Autónoma de Nuevo León (Fig. 3.). El Dr. Almeyda y la Q.B.P. Cervantes Espinosa recibieron capacitación por parte del SENASICA-ENECUSAV en el diagnóstico de HLB. 7

8 Figura 2. Dr. Isidro H. Almeyda León Laboratorio de Investigación Y Diagnóstico de Enfermedades Cuarentenarias de Plantas Cultivadas en México. Equipo, mobiliario y reactivos. Figura 3. Q.B.P. Raúl A. Rodríguez Villareal y Verónica Cervantes Espinosa 8

9 Laboratorio de Investigación y Diagnóstico de Enfermedades Cuarentenarias de Plantas Cultivadas en México. Equipo y personal auxiliar. 9

10 Laboratorio de Investigación y Diagnóstico de Enfermedades Cuarentenarias de Plantas Cultivadas en México. Equipo de PCR en tiempo real (PCR QT). Comprobante de capacitación de Verónica Cervantes Espinosa en el ENECUSAV. El Dr. I.H. Almeyda ha recibido diversos entrenamientos relacionados con Huanglongbing en el ENECUSAV. 10

11 Perspectivas en la contribución del laboratorio en el manejo del HLB. El laboratorio no persigue fines de lucro, su creación es motivada por el ánimo de contribuir a resolver la problemática de la enfermedad huanglongbing que afecta la citricultura nacional. Por las características de la Institución sede, el laboratorio posee y en el se estimula la libertad de innovar para mejorar o disponer de nuevos procesos que auxilien en el diagnóstico de enfermedades de las plantas cultivadas del país. La cooperación con SENASICA-DGSV es clave para su mantenimiento e impulso en la región, donde debido a la cercanía con fuentes de inoculo del HLB, podría tomar una posición estratégica para la campaña nacional en el diagnóstico de la enfermedad en el norte del país, particularmente en el noreste de México; sin embargo, su misión es atender las solicitudes de diagnóstico de cualquier área geográfica. AGRADECIMIENTOS. Se agradece el apoyo financiero otorgado por parte de la Dirección General de Sanidad Vegetal, Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, sin el cual al laboratorio no le hubiese sido posible iniciar operaciones. Se hace un reconocimiento especial al Dr. Javier Trujillo Arriaga, M.C. José Abel López Buenfil e Ing. Rigoberto González por la orientación y ayuda diversa para elaborar la propuesta y conseguir el financiamiento. 11