Introduction to Mycorrhizas in the Tropics with Emphasis on the Montane Forest in Southern Ecuador

Transcripción

1 Introduction to Mycorrhizas in the Tropics with Emphasis on the Montane Forest in Southern Ecuador Introducción a las Micorrizas en los Trópicos con Énfasis en el Bosque Montano en el Sur del Ecuador Narcisa Urgiles Ingeborg Haug Sabrina Setaro Nikolay Aguirre

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4 Introduction to Mycorrhizas in the Tropics with emphasis on the Montane Forest in Southern Ecuador Introducción a las Micorrizas en los Trópicos con Énfasis en el Bosque Montano en el Sur del Ecuador Narcisa Urgiles Ingeborg Haug Sabrina Setaro Nikolay Aguirre

5 Universidad Nacional de Loja Dirección de Investigación Programa Biodiversidad y Servicios Ecosistémicos Citation: Urgiles N., Haug I., Setaro S., y Aguirre N Introduction to Mycorrhizas in the Tropics with emphasis on the Montane Forest in Southern Ecuador. Universidad Nacional de Loja. Ecuador Urgiles N., Haug I., Setaro S., y Aguirre N Introducción a las Micorrizas en los Trópicos con Énfasis en el Bosque Montano en el Sur del Ecuador. Universidad Nacional de Loja. Ecuador ISBN: Peer Reviewer: Dra. Angelika Honold Institute of Evolution and Ecology University of Tübingen Germany Dra. Ingrid Kottke Institute of Evolution and Ecology University of Tübingen Germany Traducción inglés al español: Jaime Santin Diseño e impresión: EDILOJA Cía. Ltda. Telefax: San Cayetano Alto s/n edilojainfo@ediloja.com.ec Loja-Ecuador Julio, 2016

6 Contents FOREWORD Introduction Mycorrhizal symbiosis Arbuscular Mycorrhiza (AM) Ectomycorrhiza Arbutoid mycorrhiza Ericoid mycorrhiza Cavendishioid mycorrhiza Orchid mycorrhiza Symbiotic N 2 -fixing microorganisms: Actinorhiza Mycorrhizal fungi on montane forest in Southern Ecuador Development and application of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) inoculum Development of indiginous AMF inoculum Application of indigenous AMF inoculum Nursery experiments with native tropical seedlings and AMF inoculum in Loja (UNL), Ecuador Inoculation experiment Nº1 (Urgiles et al. 2009) Inoculation experiment Nº2 (Urgiles et al. 2014) Inoculation experiment Nº3 (Schüßler et al. 2015) AMF inoculum for reforestation and restoration in tropical areas Implications for smart forest management

7 9. Glossary References

8 Contenido PREFACIO Introducción Simbiosis micorrízica Micorriza Arbuscular (MA) Ectomicorriza Arbutoide micorriza Ericoide micorriza Cavendishioide micorriza Orquídeo micorriza Microrganismos simbióticos fijadores de N 2 : Actinorhiza Los hongos micorrízicos del bosque montano en el Sur de Ecuador Desarrollo y aplicación de inóculo nativo de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) Desarrollo del inóculo nativo de HMA Aplicación de inóculo nativo de HMA Experimentos de vivero con plántulas nativas del tropico e inóculo de HMA en Loja (UNL), Ecuador Experimento de inoculación Nº1 (Urgiles et al. 2009) Experimento de Inoculación Nº2 (Urgiles et al 2014) Experimento de inoculación 3 (Schüßler et al 2015) Inóculo de HMA para la reforestación y restauración en zonas tropicales

9 8. Implicaciones para un manejo forestal inteligente Glosario

10 Smart forest management can only work if it uses resources in a way so that future generations benefit at least as much from the forest than the current generation. G.L. Hartig, 1791 El inteligente manejo forestal solamente puede funcionar cuando los recursos se utilizan de tal manera que las futuras generaciones se beneficien tanto del bosque como las generaciones actuales. G.L. Hartig

11 Montane forest at Podocarpus National Park in Southern Ecuador. Photo by Haug I. Bosque Montano del Parque Nacional Podocarpus en el Sur de Ecuador. Foto Haug I.

12 FOREWORD This publication presents an introduction to mycorrhizal symbioses with special emphasis on mycorrhizal types formed in the tropics and its use in agriculture, horticulture, forestry, and the ecological restoration projects. It contains information on how to identify different types of mycorrhiza, explains the relationship between mycorrhizal fungi and their host plants and deals with characteristics of mycorrhizal fungi belonging to the phyla of Glomeromycota, Ascomycota and Basidiomycota. Another part of this document focuses on the description of nitrifying bacteria associated with mycorrhizal fungi. There is a tripartite symbiosis 1 involving arbuscular mycorrhiza (AM), ectomycorrhiza, ectomycorrhiza (EC) and N 2 -fixing actinobacteria that have been found in two native tree species Alnus acuminata (Andean alder, Betulaceae) and Morella pubescens (synonym Myrica pubescens, wax laurel, Myricaceae). Moreover, these two species are candidates for soil quality improvement and afforestation of degraded areas. They may also serve as nursery trees for later interplanting of native crop trees in the Andes region of Ecuador, which play an important ecological and economic role for indigenous or native people. 1. Palabras subrayadas están en el glosario PREFACIO Esta publicación presenta una introducción a la simbiosis de micorrizas con especial énfasis en los tipos de micorrizas formadas en los trópicos y su uso en proyectos de agricultura, horticultura, silvicultura y a la restauración ecólogica. Contiene información sobre cómo identificar los diferentes tipos de micorrizas, explica la relación entre los hongos micorrízicos y sus plantas hospederas y se ocupa de las características de los hongos micorrízicos que pertenecen a los filos de Glomeromycota, Ascomycota y Basidiomycota. Otra parte de este documento se centra en la descripción de las bacterias nitrificantes asociadas con hongos micorrízicos. Existe una simbiosis tripartita 1 que implica micorrizas arbusculares (MA), ectomicorrizas (EM) y actinobacterias fijadoras de N 2 que han sido encontrado en dos especies de árboles nativos - Alnus acuminata (aliso, Betulaceae) y Morella pubescens (sinónimo Myrica pubescens, laurel de cera, Myricaceae). Además, estas dos especies son candidatos para mejorar la calidad del suelo y forestación de áreas degradadas. También pueden servir como árboles de vivero para ser plantados más tarde en asociación con cultivos nativos en la región de los Andes de Ecuador, ya que desempeñan un papel ecológico y económico importante para los pueblos indígenas o nativos. 11

13 En el bosque tropical de montaña del sur de Ecuador, todas las especies de árboles nativos estan asociados con micorrizas, la mayor parte están formando micorrizas arbusculares, pero muy pocos son ectomicorrizas. Se han encontrado varios otros tipos de micorrizas en Orchidaceae y Ericaceae, y en hepáticas. Además de la información introductoria sobre micorrizas, proponemos un protocolo para el uso de micorrizas para mejorar los esfuerzos de reforestación en Ecuador, basado en los datos que obtuvimos de los estudios que se aplicó inóculo de hongos micorrízicos de árboles nativos cultivados en el vivero forestal. En resumen, esta publicación contiene información valiosa y directivas prácticas basadas en estudios científicos, muchos de los cuales han sido llevados a cabo en la Reserva Biológica San Francisco (RBSF), a sólo una hora de distancia de la ciudad de Loja, Ecuador. Esperamos que esta obra sea de utilidad para todos los que quieran aprender más acerca de los hongos micorrízicos del Ecuador, este interés surgió de la necesidad de producir inóculo de Hongos Micorrízicos Arbusculares (HMA) para increnentar la producción y disminuir la mortalidad de plantas a travéz del uso de micorrizas en la agricultura, la horticultura o la silvicultura que puede ser usado en planes de reforestación. In the tropical mountain forest of South Ecuador, all studied native tree species are associated with mycorrhiza - for the most part are forming arbuscular mycorrhizal but very few are ectomycorrhizal. Several other mycorrhizal types have been found in Orchidaceae and Ericaceae, and in liverworts. In addition to introductory information about mycorrhizas, we propose a protocol for using mycorrhizal fungi to enhance reforestation efforts in Ecuador, based on data we obtained from studies applying mycorrhizal fungi as inoculum of native crop trees in the nursery. Summarizing, this publication contains valuable information and practical directives based on scientific studies, many of which have been conducted at the Reserva Biologica San Francisco (RBSF), just one hour away from Loja city, Ecuador. We hope this book will be of use to everybody who wants to learn more about mycorrhizal fungi of Ecuador, this interest emerged out of the necessity of producing Arbuscular Mycorrhizal fungi (AMF) to increase the to use mycorrhizas in agriculture, horticulture or forestry that can be used in reforestation approaches. 12

14 Natural flora (native species) and fauna (microorganisms) of Cajanuma forest in the Podocarpus National Park. Photo by Haug I. Flora natural (especies nativas) y fauna (microorganismos) del bosque de Cajanuma en el Parque Nacional Podocarpus. Foto Haug I.

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16 1. Introduction The deforestation rate in Ecuador is one of the highest in South America (Mosandl et al. 2008). The annual rate of deforestation between 2005 and 2010 was 1.9 % (FAO 2010). Smallholders using a slash andburn method of agriculture that is converting forest into grassland, cause the deforestation (Knoke et. al. 2009). The high deforestation rate in Ecuador and increasing abandoned agricultural areas call for landscape regeneration, ecological restoration, afforestation and reforestation. Even though, Ecuador is recognized to have more than 2,700 native tree species in the tropical forests (Jørgensen and León-Yánez 1999), most of the tree plantations in Ecuador consists of monocultures of Pinus sp., and Eucalyptus sp., this is caused by the lack of management strategies for seed collection, seedling production, and planting prerequisites like shade requirement, soil conditions and topography. Seedlings of native tree species for afforestation approaches are needed because of two main reasons. First, because they are better suited for local conditions due to adaptations to the environmental characteristics (Stimm et al. 2008; Günter et al. 2009; Aguirre et al. 2011). Second, the high deforestation rate makes it necessary 1. Introducción La tasa de deforestación en el Ecuador es uno de los más altos en América del Sur (Mosandl et al. 2008). La tasa anual de deforestación entre 2005 y 2010 fue de 1,9 % (FAO 2010). Los pequeños productores utilizan un método de tala y quema en la agricultura, que sirve para la conversión de bosques en pastizales, causando la deforestación (Knoke et. al., 2009). La tasa alta de deforestación en el Ecuador y el aumento de las áreas agrícolas abandonadas exigen la regeneración del paisaje, la restauración ecológica, forestación y reforestación. Aunque, Ecuador es reconocido por tener más de 2,700 especies nativas de árboles en los bosques tropicales (Jørgensen y León-Yánez 1999), la mayoría de las plantaciones de árboles en Ecuador consiste en monocultivos de Pinus sp., y Eucalyptus sp., esto es causado por la falta de estrategias de gestión para la recolección de semillas, producción de plántulas, y requisitos previos de plantación como requisito sombra, las condiciones del suelo y la topograf ía. Las plántulas de especies nativas forestales para enfoques de forestación son necesarios debido a dos razones principales. En primer lugar, debido a que son más 15

17 adecuados para las condiciones locales por las adaptaciones a las características ambientales (Stimm et al 2008; Günter et al 2009; Aguirre et al 2011). En segundo lugar, la alta tasa de deforestación obliga a reforestar los sitios abandonados con especies locales con el fin de restablecer la diversidad tropical. Un factor esencial para la supervivencia y el crecimiento de los árboles tropicales son los hongos micorrízicos (Kottke et al. 2008). Por lo tanto, trabajamos en la producción de inóculos de micorrizas arbusculares para mejorar el crecimiento vegetal de árboles tropicales (Urgiles et al. 2009; Urgiles et al. 2014; Schüßler et al. 2015). Los hongos micorrízicos presentan un papel ecológico y económico importante en los ecosistemas tropicales, pero no son muy conocidos en las regiones tropicales, aunque la investigación de micorrizas se remonta al año 1885 cuando Albert Bernhard Frank, un investigador alemán, publicó un artículo titulado Über die Wurzelsymbiose auf beruhende Ernährung gewisser Bäume durch Unterirdische Pilze (Acerca de la nutrición de ciertos árboles, dependiendo de la simbiosis raíz con hongos bajo la tierra). Frank descubrió micorrizas mientras trabajaba en el cultivo de la trufa to reforest abandoned sites with local species in order to re-establish tropical diversity. An essential factor for survival and growth of tropical trees are mycorrhizal fungi (Kottke et al. 2008). Therefore, we are working on the production of arbuscular mycorrhizal inoculants to enhance plant growth promotion of tropical trees (Urgiles et al. 2009; Urgiles et al. 2014; Schüßler et al. 2015). Mycorrhizal fungi have an important ecological and economic role in tropical ecosystems but are not well known in tropical regions, although research of mycorrhiza goes back to the year 1885 when Albert Bernhard Frank, a German researcher, published a paper called Über die auf Wurzelsymbiose beruhende Ernährung gewisser Bäume durch unterirdische Pilze (About the nutrition of certain trees depending on root symbiosis with belowground fungi). Frank discovered mycorrhizas while working on the cultivation of Périgord truffles in Prussia, he observed that fruiting bodies of truffles were only found near living individuals of Quercus sp. (oaks), Fagus sylvatica (beeches), Carpinus betulus (hornbeams) or Corylus avellana (hazel nut trees). Thus, he suggested that there must be some connection 16

18 between truffels and these trees, and studied the roots in more detail. He found fungal hyphae connecting the truffle s fruiting bodies with fine roots of trees. Frank documented these structures in great detail and named them mycorrhiza a combined structure of root and fungus. These early drawings already showed in the pictures the occurrence of a hyphal sheath, which are growing in between cortical cells; a mycorrhiza type later named ectomycorrhiza. Because of the ubiquity of mycorrhizas formed at the last order of fine roots and the healthy appearance of their host trees, Frank concluded that this association cannot be of parasitic nature, but has to be a mutualistic symbiosis. Without conducting any physiological experiments, he correctly concluded that the fungus delivers all nutrients from the soil to the plant and gets assimilated sugars from the plant in return. His assumptions are meanwhile fully supported by physiological and molecular investigations (Smith and Read 2008). Frank studied also fine roots of herbaceous plants in beech and oak forests and found that herbaceous roots appeared to be completely free of fungi but had root hairs instead. What he did miss, though, was that mycorrhizal fungi of herbaceous plants are hidden inside of root cells. del Périgord en Prusia, él observó que los cuerpos fructíferos de trufas solamente fueron encontrados cerca de los individuos de Quercus sp. (Robles), Fagus sylvatica (hayas), Carpinus betulus (carpes) o Corylus avellana (árboles de nueces avellana). Por lo tanto, sugirió que debe haber alguna conexión entre trufas y estos árboles, y estudió las raíces con más detalle. Encontró hifas fúngicas conectando cuerpos fructíferos de la trufa con finas raíces de los árboles. Frank documentó estas estructuras en gran detalle y los nombró micorrizas, una estructura combinada de raíz y el hongo. Estos primeros gráficos ya mostraron en las fotograf ías la aparición de una envoltura de las hifas, las cuales crecen entre las células corticales; un tipo de micorrizas más tarde nombrado ectomicorriza. Debido a la ubicuidad de las micorrizas formadas en el último orden de las raíces finas y la apariencia saludable de sus árboles hospederos, Frank llegó a la conclusión de que esta asociación no puede ser de naturaleza parasitaria, pero tiene que haber una simbiosis mutualista. Sin llevar a cabo ningún tipo de experimentos fisiológicos, él concluyó correctamente que los hongos proporcionan todos los nutrientes del suelo a la planta y la planta asimila azúcares a cambio. Sus supuestos son plenamente apoyados 17

19 por investigaciones fisiológicas y moleculares (Smith y Lee 2008). Frank también estudió las raíces finas de las plantas herbáceas en los bosques de hayas, Quercus sp (robles) y encontró que las raíces herbáceas parecían estar completamente libres de hongos, pero tuvieron pelos radicales en su lugar. Lo que hizo falta, sin embargo, era que los hongos micorrízicos de plantas herbáceas están ocultos en el interior de las células corticales de la raíz. Este tipo de micorrizas fue descrita por primera vez por Janse (1897) para los trópicos y fue más ampliamente estudiado por Gallaud (1905) en las regiones templadas. Esta asociación es llamada ahora micorrizas arbusculares, según las hifas intracelulares ramificadas en forma de árbol. El estudio de las micorrizas arbusculares es en muchos aspectos más desafiante que el estudio de ectomicorrizas y esto es especialmente cierto para la identificación de los hongos micorrízicos arbusculares. Peyronel (1923) fue el primero en demostrar que las hifas de micorrizas arbusculares estaban conectadas a pequeños esporocarpos (cuerpo fructífero), que consideraba como Endogonaceae porque el micelio es sin paredes cuadradas (septa, tabique, pared). Los hongos se colocan This type of mycorrhiza was first described by Janse (1897) for the tropics and more extensively studied by Gallaud (1905) in temperate regions. This association is now called arbuscular mycorrhiza according to the intracellular tree-like branched hyphae. The study of arbuscular mycorrhiza is in many ways more challenging than the study of ectomycorrhiza and this is especially true for identification of arbuscular mycorrhizal fungi. Peyronel (1923) was the first to prove that hyphae of arbuscular mycorrhizas were connected to small sporocarps (fruiting body), which he considered as Endogonaceae because the mycelium is without square walls (septae). The fungi are now placed in a separate fungal phylum called Glomeromycota (Schüßler et al. 2001). Most of the research mentioned above has been conducted in temperate zones and only little had been known about mycorrhizas in tropical forests until the beginning of the 21st century. The first study about mycorrhizal fungi of Ecuador appeared 1989 (Bermudes & Benzing 1989) and was about orchid and arbuscular mycorrhizas of epiphytes. 18

20 Recently, comprehensive studies have been conducted on mycorrhizal fungi of the tropical montane forest in South Ecuador, mainly at the Reserva Biológica San Francisco (Loja- Zamora Chinchipe). We now know that the tropical mountain rain forests harbors a broad array of mycorrhizal associations and that mycorrhizal fungi are an integral part of these ecosystems. Even new mycorrhizal types and fungi were described from this area. There are still many unanswered questions about mycorrhizas of the Ecuadorian forests and it requires curious and engaged researchers, such as Albert Bernhard Frank once was, to find out more about them. We hope that this information about mycorrhizas in the tropics helps interested readers to gain access to the world of mycorrhizas, especially to mycorrhizal associations of tropical forests of Ecuador. We especially hope that this new knowledge will be applied in projects of afforestation, reforestation and ecological restoration approaches. ahora en un filo de hongos separado llamado Glomeromycota (Schüßler et al. 2001). La mayor parte de la investigación mencionada anteriormente se ha llevado a cabo en las zonas templadas y muy poco se ha sabido de micorrizas en los bosques tropicales hasta principios del siglo XXI. El primer estudio sobre los hongos micorrízicos de Ecuador apareció 1989 (Bermudes y Benzing 1989) y fue sobre orquideomicorrizas y micorrizas arbusculares de epífitas. Recientemente, los estudios integrales se han realizado sobre los hongos micorrízicos del bosque montano tropical en el Sur de Ecuador, principalmente en la Reserva Biológica San Francisco (Loja- Zamora Chinchipe). Ahora sabemos que los bosques húmedos tropicales de montaña alberga una amplia gama de asociaciones de micorrizas y que los hongos micorrízicos que son una parte integral de estos ecosistemas, incluso nuevos tipos de micorrizas y hongos fueron descritos en esta zona. Todavía hay muchas preguntas sin respuesta acerca de micorrizas de los bosques Ecuatorianos y requiere investigadores curiosos y comprometidos, como Albert Bernhard Frank que una vez fue, para averiguar más acerca de ellos. 19

21 20 Esperamos que esta información sobre micorrizas en los trópicos ayuda a los lectores interesados a acceder al mundo de micorrizas, especialmente a las asociaciones de micorrizas de los bosques tropicales del Ecuador. En especial, esperamos que este nuevo conocimiento será aplicado en los proyectos enfocados a la forestación, reforestación y restauración ecológica.

22 Natural flora (native species) and fauna (microorganisms) forest RBSF in the Podocarpus National Park. Photo by Haug I. Flora natural (especies nativas) y fauna (microorganismos) del bosque de la RBSF en el Parque Nacional Podocarpus. Foto Haug I.

23 Natural flora (native species) and fauna (microorganisms) forest RBSF in the Podocarpus National Park. Photo by Haug I. Flora natural (especies nativas) y fauna (microorganismos) del bosque de la RBSF en el Parque Nacional Podocarpus. Foto Haug I.

24 2. Simbiosis micorrízica Micorrizas del griego:. Μυκός = Mykos, hongo, y ρίζα, riza = raíz (pl micorrizas o micorrizas) es una asociación simbiótica compuesta por un hongo y las raíces de una planta vascular. Las plantas asociadas abarcan un amplio espectro que va desde los musgos, a helechos, gimnospermas hasta angiospermas; los hongos implicados pertenecen al phylum Ascomycota, Basidiomycota y Glomeromycota. Alrededor del 80 al 90 % de las especies de plantas forman micorrizas, es decir, sus raíces finas están conectadas a los hongos en la rizosfera. La planta suministra carbón fotosintéticamente fijado por el hongo mientras que el socio de hongo mejora la absorción de fósforo, nitrógeno, agua y otros micronutrientes del suelo para la planta huésped (Fig. 1). Los hongos micorrízicos son de particular interés debido a sus efectos positivos sobre el crecimiento de las plantas, la sanidad vegetal y la protección contra el estrés biótico y abiótico. 2. Mycorrhizal symbiosis A mycorrhiza from Greek: μυκός = mykós = fungus, and ρίζα, riza = root (pl. mycorrhizae or mycorrhizas) is a symbiotic association composed of a fungus and roots of a vascular plant. The associated plants span a broad spectrum ranging from mosses over ferns, and gymnosperms to angiosperms; the involved fungi belong to the phyla Ascomycota, Basidiomycota and Glomeromycota. About 80 to 90 % of plant species form mycorrhizas, meaning their fine roots are connected to fungi in the rhizosphere. The plant supplies photo-synthetically fixed carbon to the fungus while the fungal partner improves uptake of phosphorus, nitrogen, water and other micronutrients from the soil for the host plant (Fig. 1). Mycorrhizal fungi are of particular interest due to their positive effects on plant growth, plant health and protection against biotic and abiotic stresses. 23

25 Sugar Mycorrhizal Fungi P, N, H 2 O,... Figure 1. Mycorrhiza Fungi and plants benefit from each other: The plant gets nutrients, in exchange for sugar. Graphic byhaug I. Figura 1. Micorrizas - Hongos y plantas se benefician unos a otros: La planta recibe nutrientes, a cambio de azúcar. Gráfico by Haug I. 24

26 In this section, we will present how to sample and prepare the important categories of vascular plant mycorrhizas and show structural characteristics of the different types identified by light and transmission electron microscopy. These categories are: 2.1. Arbuscular Mycorrhiza (AM) 2.2. Ectomycorrhiza (EM) 2.3. Arbutoid mycorrhiza 2.4. Ericoid mycorrhiza 2.5. Cavendishioid mycorrhiza 2.6. Orchid mycorrhiza En esta sección, presentaremos como probar y preparar las categorías importantes de micorrizas de las plantas vasculares y mostrar las características estructurales de los diferentes tipos identificados por microscopía óptica y de transmisión electrónica. Estas categorías son: 2.1. Micorriza Arbuscular (MA) 2.2. Ectomicorriza (EM) 2.3. Arbutoide micorriza 2.4. Ericoide micorriza 2.5. Cavendishioide micorriza 2.6. Orquideo micorriza 25

27 Arbuscular Mycorrhiza (AM) is associated with the most of terrestrial plants in the Montane Forest. Photo by Haug I. La Micorrizas Arbuscular (MA) se asocia con la mayoría de plantas terrestres en el Bosque Montano. Foto Haug I.

28 2.1. Arbuscular Mycorrhiza (AM) Arbuscular mycorrhizas cannot be seen without a microscope, because hyphae, spores and vesicles are too tiny for the naked eye. In addition, arbuscular mycorrhizal fungi need to be stained so that the structures can be distinguished from root material Staining of arbuscular mycorrhiza (AM) colonized roots A protocol on how to do this follows below (after Grace & Stribley 1991). Firstly, it is important to get roots that are actually mycorrhizal. These are only the fine roots of the last order! The best method to obtain these roots is to trace a single, large root from the stem down until reaching the fine roots. The whole root cluster is collected, in the laboratory, the last-order fine roots are cut into 1.5- to 2.5-cm pieces and cleared in 10 % KOH at 65 C in a water bath. The incubation time depends on the clearing success and can range from 2 hours up to 3 days. If the roots are still dark after this procedure, they have to be incubated with 15 % H 2 O 2 for up to 15 min at room temperature. After the clearing step, the roots need to be thoroughly rinsed in tap water 2.1. Micorriza Arbuscular (MA) Las micorrizas arbusculares no se pueden ver sin un microscopio, porque las hifas, esporas y vesículas son demasiado pequeñas y no visibles a simple vista, también los hongos micorrízicos arbusculares necesitan ser teñidos para que las estructuras se puedan distinguir de la raíz Tinción de micorriza arbuscular (MA) de raíces colonizadas A continuación se detalla un protocolo sobre como hacer la tinción (después de Grace & Stribley 1991). En primer lugar, es importante obtener las raíces que son colonizadas por micorrizas. Estas son sólo las raíces finas del último orden!. El mejor método es obtener una sola raíz larga desde el tronco/tallo hacia abajo hasta llegar a las raíces finas. Se colecta todo el grupo de raíces, en el laboratorio las raíces finas del último orden se cortan en piezas de 1.5 a 2.5 cm y son aclaradas en KOH al 10 % a 65 C en baño maría. El tiempo de incubación depende del éxito de la aclaración (eliminación de taninos) y puede variar desde 2 horas hasta 3 días. Si las raíces son aún muy oscuras después de este procedimiento, tienen que ser 27

29 incubados con 15 % de H 2 O 2 durante un máximo de 15 min., a temperatura ambiente. Después de la etapa de aclaración de las raíces, éstas deben ser enjuagadas en agua del grifo (3 veces) antes de ser acidificada con HCl al 10 % durante 2 min. hasta que las raíces deben mostrarse de color blanco Luego podrán ser transferidas a la solución de tinción, que contiene 0,05 % de azul de metilo o azul de anilina en ácido láctico al 90 %. Las raíces son tiñidas durante 2 a 4 horas a 65 C en baño maría. Finalmente, las raíces teñidas son colocadas en un portaobjetos de microscopio en algunas gotas de ácido láctico y están listas para la observación bajo microscopía óptica (Figs. 3, 4, 5). Los hongos micorrizícos arbusculares son caracterizados por varias distintas estructuras de hongos: micelio extraradical, apresorios, hifas inter e intracelulares, rollos de hifas, vesículas y arbúsculos (Figs. 2, 3, 4, 5). El micelio extraradical se forma afuera de las raíces, que colonizan el suelo (Fig. 3a, b). Si estas hifas se ponen en contacto con la raíz fina de un huésped (planta) apropiado, los apresorios son formados en la superficie de la raíz (Figs. 2, 3d-f ), apresorio, hifa crecen en la raíz (Fig. 2). A menudo, grandes rollos de hifas (3 times) before being acidified with 10 % HCl for 2 min. the roots should now appear white. Only then can they be transferred into the staining solution, which contains 0.0 5% methyl blue or aniline blue in 90 % lactic acid. The roots are stained for 2 to 4 h at 65 C in a water bath. Finally, the staining roots are mounted on a microscope slide in some droplets of lactic acid and are ready to be checked for light microscopy (Figs. 3, 4, 5). The arbuscular mycorrhiza fungi are charcterized by several distinct fungal structures: extraradical mycelium, appressoria, intercellular and intracellular hyphae, hyphal coils, vesicles and arbuscules (Figs. 2, 3, 4, 5). The extraradical mycelium is made out of hyphae, which colonize the soil (Figs. 3a, b). If these hyphae get in touch with a fine root of an appropriate host (plant), appressoria are formed on the surface of the root (Figs. 2, 3d-f ), out of the appressorium, hyphae grow into the root (Fig. 2). Often, large hyphal coils are formed within cells of the outermost layer of the root cortex (Figs. 2, 4a). These hyphae spread by growing between cortical cells (intercellular hyphae, Figs. 2, 4b) or growing through cortical cells (intracellular hyphae, Figs. 2, 5a-c). When these 28

30 hyphae reach the inner cortical layer, they often form highly branched, tree-like structures, which are called arbuscules (Figs. 5d-f ). Arbuscules are important structures, because they facilitate the exchange of nutrients. Their branched nature greatly increases the contact surface area between fungal hyphae and cell cytoplasm, consequently enabling transfer of nutrients from plant to fungus and vice versa. Mycorrhizal hyphae are surrounded by a plant-derived membrane, which carries specific transporter systems for the exchange of nutrients. Vesicles are balloon-like, fungal cells and are the storage organs of AM fungi. Vesicles are formed in and between cortical cells and often contain large oil droplets (Figs. 2, 4cf ). son formadas dentro de las células de la capa más externa de las células corticales de la raíz (Figs. 2, 4a). Estas hifas proliferan por el crecimiento entre las células corticales (hifas intercelulares, Figs. 2, 4b) o el crecimiento a través de células corticales (hifas intracelulares, Figs. 2, 5a-c). Cuando estas hifas llegan a la capa cortical interna, a menudo forman altas ramificaciones, estructuras en forma de árbol, por ello se llaman arbúsculos (Fig. 5d-f ). Los arbúsculos son estructuras importantes, ya que facilitan el intercambio de nutrientes. Su naturaleza ramificada aumenta en gran medida el área de superficie de contacto entre las hifas de hongos y el citoplasma de la célula, por consiguiente permite la transferencia de nutrientes desde la planta al hongo, y viceversa. Las hifas de las micorrizas están rodeadas por una membrana de origen vegetal, que lleva a los sistemas de transportadores específicos para el intercambio de nutrientes. Las vesículas son en forma de balón, las células fúngicas son los órganos de almacenamiento de los hongos micorrízicos. Las vesículas son formadas en y entre las células corticales y a menudo contienen grandes gotas de aceite (Figs. 2, 4c-f ). 29

31 Appressoium at entry point Intracellular hyphae Epidermis Hypodermis Cortex Intercellular hypha in air channel Arbuscles Vesicle Figure 2. Diagram of arbuscular mycorrhiza longitudinal section (Mark Brundrett 2008, mycorrhizas.info/). Published with permission of the author. Figura 2. Diagrama de micorrizas arbusculares - sección longitudinal (Mark Brundrett 2008, Publicado con el permiso del autor. 30

32 a b c d e f Figure 3. Light microscope micrographs of extraradical mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi. a, b., Surrounding the mycorrhizas of Handroanthus chrysanthus (guayacan tree), c. Growing on the surface of mycorrhizas of Polylepis reticulata, and d.- f., On mycorrhizas of Clusia sp. Photo by Haug I. Figura 3. Micrograf ías de microscopía óptica de micelio extraradical de micorrizas arbusculares. a, b., los hongos micorrízicos rodean a Handroanthus chrysanthus (guayacán), c. micorrizas crecen en la superficie de de Polylepis reticulata, y d.-f., micorrizas en Clusia sp. Foto Haug I. 31

33 a C b c d V V V e f V O O V O Figure 4. Light microscope micrographs of arbuscular mycorrhizas: a. hyphal coils in outer cortical cells; b. intercellular hyphae; c., d. overview of mycorrhiza with hyphae and vesicles; e., f. hyphae and vesicles in inner cortical cells with a lot of oil droplets. C = coils, V = vesicle, O = oil droplet. Photos by Haug I. Figura 4. Micrograf ías de microscopía óptica de micorrizas arbusculares: a. rollos de hifas en las células corticales exteriores; b. hifas intercelulares; c., d. panorama general de las micorrizas con hifas y vesículas; e., f. hifas y vesículas en las células corticales interiores con una gran cantidad de gotitas de aceite. C = coils, V = vesícula, O = gotitas de aceite. Fotos by Haug I. 32

34 a b c d e f A A A Figure 5. Light microscope micrographs of arbuscular mycorrhiza: a c. Different hyphal structures in cortical cells; d f. arbuscules in cortical cells. A = Arbuscules. Photos by Haug I. Figura 5. Micrograf ías de microscopía óptica de micorrizas arbusculares: a - c. Diferentes estructuras de hifas en las células corticales; d - f. arbúsculos en las células corticales. A = Arbúsculos. Fotos Haug I. 33

35 Todos los hongos micorrízicos arbusculares pertenecen al phylum Glomeromycota. Los Glomeromycota son biotrofos obligados ya que no pueden tomar azúcares externos ni degradar materiales orgánicos complejos para adquirir carbón y obtener energía. Los Glomeromycota se reproducen asexualmente por la formación de esporas grandes y multinucleadas. La morfología de las esporas y la formación en combinación con ciertas otras características morfológicas se han utilizado taxonómicamente para delimitar e identificar las especies. Sin embargo, esto requiere cultivos de esporas individuales, lo que restringe el actual concepto de especie de aquellos hongos que se han encontrado para formar cultivo de esporas. Actualmente, hay cerca de 300 morfoespecies. La investigación molecular indica, a pesar de que el número real de especies es por lo menos diez veces, significa que muchas especies aún no se han descubierto y descrito. El phylum Glomeromycota consiste en cuatro órdenes: Glomerales, Diversisporales, Paraglomerales y Archaeosporales. Juntos forman unos 25 géneros. Varios miles de secuencias se han depositado en el NCBI, el Centro Nacional de Información All arbuscular mycorrhizal fungi belong to the phylum Glomeromycota. Glomeromycota are obligate biotrophs as they cannot take up external sugars nor degrade complex organic materials to acquire carbon for energy. Glomeromycota reproduce asexually by the formation of large, multinucleate spores. Spore morphology and formation in combination with certain other morphological features have been used taxonomically to delimit and identify species. However, this requires single spore cultures, restricting the current species concept to only those fungi that have been found to form spores in culture. Currently, there are about 300 morphospecies. Molecular research indicates, although, that the actual number of species is at least the tenfold, meaning that many species are yet to be discovered and described. The phylum Glomeromycota consists of four orders: Glomerales, Diversisporales, Paraglomerales and Archaeosporales. Together they form about 25 genera. Several thousand sequences have been deposited at NCBI, the National Center for Biotechnology Information ( 34

36 nih.gov), mainly from environmental studies. The soaring number of sequences are due to high throughput sequencing technologies. Phylogenetic analyses place these sequences into different families and genera, but the lack of morphological data prohibits a formal taxonomic description for these sequences. Until the taxonomic society changes the rules, or morphological features for these fungi are found, they are informally named sequence types, phylotypes, virtual taxa, Operational Taxonomic Units (OTUs) or Molecular Operational Taxonomic units (MOTUs). The number of these informal groups by far exceeds the number of described species. Plants forming arbuscular mycorrhizas are distributed throughout the entire plant kingdom from liverworts, lycopods, ferns, to most families of angiosperms, except conifers (Pinaceae). Ericaceae, Orchidaceae, Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae, Salicaceae, and a few other Myrtaceae, Nyctaginaceae, Dipterocarpaceae and a few Polygonaceae are associated with mycorrhizal fungi belonging to Basidiomycota and Ascomycota. Several members of Brassicaceae; e.g. Caryophyllaceae, Chenopodiaceae Biotecnológica ( nlm.nih.gov), principalmente de estudios ambientales. El número creciente de secuencias se deben a las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Análisis filogenéticos colocan estas secuencias en diferentes familias y géneros, pero la falta de datos morfológicos prohíbe una descripción taxonómica formal para estas secuencias. Hasta que la sociedad taxonómica cambie las reglas o características morfológicas de estos hongos se encuentren, están informalmente nombrados tipos de secuencias, filotipos, taxones virtuales, Unidades Operativas Taxonómicas (OTUs) o Unidades Taxonómicas Operacionales Moleculares (MOTUs). El número de estos grupos informales, es muy superior al número de especies descritas. Las plantas que forman micorrizas arbusculares están distribuidas a través de todo el reino vegetal desde las hepáticas, licopodios, helechos, a la mayoría de las familias de angiospermas, excepto coníferas (Pinaceae). Ericaceae, Orquideaceae, Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae, Salicaceae, y unos pocos otros Myrtaceae, Nyctaginaceae, Dipterocarpaceae y unas pocas Polygonaceae están 35

37 asociadas con hongos micorrízicos pertenecientes a Basidiomycota y Ascomycota. Varios miembros de Brassicaceae; por ejemplo: Caryophyllaceae, Chenopodiaceae y todos los musgos (pero no hepáticas) no son micorrizados. Un panorama actual de las plantas y su colonización de micorrizas es dada por Wang y Qiu (2006). En contraste con la ectomicorriza dominada en bosques boreales en el hemisferio norte, las micorrizas arbusculares son especialmente frecuentes y generalizadas en los trópicos. Con excepción de tres especies (Nyctaginaceae), todas las especies de árboles investigadas en los bosques de las montañas tropicales en la Reserva Biológica San Francisco fueron micorrizas arbusculares. Las micorriza arbuscular es el tipo más antiguo de micorrizas. Las primeras esporas fósiles de HMA son del Ordovícico, que se encuentra en la roca dolomita de Wisconsin, y más de 460 millones de años atras (Fig. 6). El primer fósil de la simbiosis de los hongos micorrízicos fue encontrado en Aglaophyton major en el Devónico Rhynie silex hace 400 millones de años atrás. Aglaophyton major fue supuestamente una de las primeras plantas terrenales vasculares y su simbiosis está documentada por la and all mosses (but not liverworts) are non-mycorrhizal. A current overview of plant, it s known mycorrhizal status given by Wang and Qiu (2006). In contrast to the ectomycorrhizal dominated boreal forests in the northern hemisphere, arbuscular mycorrhiza is especially frequent and widespread in the tropics. With exception of three species (Nyctaginaceae), all investigated tree species from the tropical mountain forests in the Reserva Biológica San Francisco were arbuscular mycorrhizal. Arbuscular mycorrhiza is the oldest type of mycorrhiza. The earliest fossil spores of AMF are from the Ordovician, found in dolomite rock of Wisconsin, and are more than 460 Million years ago (Fig. 6). The first fossilized of mycorrhizal fungi - symbiosis was found in Aglaophyton major in the 400 Million year old Devonian Rhynie chert. Aglaophyton major was supposably the earliest vascular land plant and its symbiosis is documented by the occurrence of well-defined arbuscules and spores. Divergence time estimation of fungal phylogenies also indicates that these fungi occurred when land plant life most likely existed only on 36

38 the bryophyte level.this supports a mycotrophic origin of land plants. ocurrencia de arbúsculos y esporas bien definidos. La estimación del tiempo de divergencia de filogenias de los hongos también indican que estos hongos se produjeron cuando la vida vegetal de la tierra más probablemente sólo existía en el nivel de briófitos. Esto confirma un origen micotrófico de las plantas terrestres. Figure 6. Fossilized fungal hyphae and spores from the Ordovician of Wisconsin are about 460 million years old (from Redecker et al. 2000). Figura 6. Hongos fosilizados de hifas y esporas de el Ordovician de Wisconsin están sobre los 460 millones de años de edad (de Redecker et al. 2000). 37

39 a b Hyphal mantle Extraradical hyphae c Ectomycorrhizas The observation of ectomycorrhizas; a., roots colonized by ectomycorrhizal evaluated through the stereoscope; b., Hyphal mantle, and c., Extra radical hyphae. Photo Urgiles N. Ectomicorrizas Observación de ectomicorrizas; a., raíces colonizadas por ectomicorrizas evaluadas a través del estereoscopio; b., Manto de hifas, and c., hifas extra radicales. Foto Urgiles N. 38

40 2.2. Ectomicorriza La mayoría de ectomicorrizas se encuentran en la capa orgánica. Se formaron solamente en las dos últimos órdenes de la raíz. Ectomicorrizas tienen un aspecto robusto y también se llaman raíces cortas. El patrón de ramificación de estas raíces cortas puede ser muy diferente y se ha utilizado para distinguir dos diferentes tipos. Ectomicorrizas se pueden observar en el campo, pero es mucho más fácil usar un estéreo microscópico. Las secciones transversales de ectomicorrizas revelan todas las estructuras bajo un microscopio óptico sin necesidad de tinción. Ectomicorrizas se caracterizan por un manto de hifas (o funda) que encierra las raicillas, e hifas intercelulares que penetran hacia el interior entre las células de la raíz para formar un sistema intercelular complejo llamado red de Hartig (Figs. 7, 8, 13). Las hifas o rizomorfos (= hifas agrupadas) irradian desde el manto de hifas y crecen en el suelo. Dentro de la raíz, las hifas forman una red de Hartig alrededor de las células corticales (Figs. 8c-f ). En las gimnospermas, la red de Hartig rodea a las células de la planta dentro de la corteza de la raíz hasta las hifas alcanzan la endodermis (Figs. 8a, b), 2.2. Ectomycorrhiza Most ectomycorrhizas are found in the organic layer. They are only formed at the last two orders of the root. Ectomycorrhizas have a stout appearance and are also called short roots.the branching pattern of these short roots can be quite different and has been used two distinguish different types. Ectomycorrhizas can be observed in the field, but it is much easier to use a stereomicroscopecross sections of ectomycorrhizas reveal all structures under a light microscope without the need of staining. Ectomycorrhizas are characterized by a hyphal mantle (or sheath) which encloses the rootlet, and intercellular hyphae that penetrate inwards between the cells of the root to form a complex intercellular system called the Hartig net (Figs. 7, 8, 13). Hyphae or rhizomorphs (= clustered hyphae) radiate from the hyphal mantle and grow into the soil. Inside the root, hyphae form a Hartig net around cortical cells (Figs. 8c-f ). In gymnosperms, the Hartig net surrounds the plant cells within the root cortex until hyphae reach the endodermis (Figs. 8a, b), whereas in angiosperms the Hartig net is restricted to the outermost cortical layer. 39

41 Ectomycorrhizal fungi never penetrate cortical cells. The exchange of nutrients occurs at the Hartig net between root cells and hyphal cells. mientras que en las angiospermas la red de Hartig se limita a la capa cortical externa. Los hongos ectomicorrízicos no penetran las células corticales. El intercambio de nutrientes se produce en la red de Hartig entre células de la raíz y células de las hifas. a b c d Figure 7. Ectomycorrhizas of Neea sp. (Nyctaginaceae) with different fungal partners: a. Ascomycete forming a black hyphal mantle (arrow)., b., c., d. members of Thelephoraceae with orange to whitish hyphal mantles (arrow). Photos by Haug I. Figura 7. Ectomicorrizas de Neea sp. (Nyctaginaceae) con diferentes hongos socios: a. Ascomicete formando un manto de hifas negro (flecha),. b., c., d. miembros de Thelephoraceae con hifas naranja a mantos de hifas blanquesinas (flecha). Fotos Haug I. 40

42 a b VT CC+HN HM CC+HN VT HM c d HM HM HN* HN* e N N f HN* HM HM Figure 8. Cross- and longitudinal sections of ectomycorrhizas Light microscope micrographs: a. cross section; b. longitudinal section; c.-f. details of cross sections with Hartig net, which appears depending of the focus and section plane - as finger-like structures on the surface of the cortical cells (*) and partly as net-like structures (arrows). HM = hyphal mantle, HN = Hartig net, N = nucleus, CC+HN = cortical cells and Hartig net in between, VT = vascular tissue. Photos by Haug I. Figura 8. Sección transversal y longitudinal de ectomicorrhizas Micrograf ías de microscopio óptico: a. sección transversal; b. sección longitudinal; c.-f. detalles de sección transversal con la red de Hartig, que aparece dependiendo del enfoque y la sección plana como dedo-como estructura de la superficie de las células corticales (*) y en parte como estructuras reticulares (flechas). HM = manto de hifas, HN = red de Hartig, N = núcleo, CC+HN = células corticales y red de Harting y la red de Hartig entre ellos, VT = tejido vascular. Fotos by Haug I. 41

43 Ectomycorrhizal fungi belong to the phyla Basidiomycota and Ascomycota and it is estimated that there are more than 20,000 species. A lot of ectomycorrhizal fungi develop conspicious mushrooms above- or belowground. For a long time, only fungi forming fruiting bodies close to trees and shrubs were considered to be ectomycorrhizal. Molecular investigations showed that some ectomycorrhizal fungi form fruiting bodies on dead wood away from the plant. There are even ectomycorrhizal fungi with no known fruitbodies at all Cenococcum geophilum; members of Sebacinaceae and Thelephoraceae. Basidiomycota with many ectomycorrhizal members are Sebacinales, Cantharellales, Thelephorales, Russulales, Boletales, Atheliales and Agaricales. In Ascomycota, the orders Pezizales (genus Tuber) and Eurotiales have high numbers of ectomycorrhizal species. Most ectomycorrhizal fungi are generalists and associate with many different tree species, but several Boletales and Amanitales are restricted to genera and even species. Ectomycorrhizas are predominantly found in woody plants. All members Los hongos ectomicorrizicos pertenecen al phylum Basidiomycota y Ascomycota y se estima que hay más de especies. Una gran cantidad de hongos ectomicorrízicos desarrollan una forma masiva de setas encima o bajo el suelo. Durante mucho tiempo, sólo los hongos que forman cuerpos fructíferos cerca de los árboles y arbustos se consideraron ectomicorrízicos. Investigaciones moleculares mostraron que algunos hongos ectomicorrízicos forman cuerpos fructíferos en la madera muerta a distancia de la planta. Hay incluso hongos ectomicorrízicos sin cuerpos fructíferos conocidos en absoluto Cenococcum geophilum; miembros de Sebacinaceae y Thelephoraceae. Basidiomycota con muchos miembros ectomicorrízicos son Sebacinales, Cantharellales, Thelephorales, Russulales, Boletales, Atheliales and Agaricales. En Ascomycota, los Pezizales órdenes (género Tuber) y Eurotiales tienen un alto número de especies ectomicorrízicos. La mayoría de los hongos ectomicorrízicos son generalistas y asociados con muchas especies diferentes de árboles, pero varios 42

44 Boletales y Amanitales están restringidos a los géneros e incluso especies. Ectomicorrizas se encuentran predominantemente en plantas leñosas. Todos los miembros de las familias de plantas Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae y Salicaceae son ectomicorrízicos y así los árboles ectomicorrízicos dominan los bosques del hemisferio norte. En los trópicos, hay algunas familias de plantas que tienen muchos miembros ectomicorrízicos como, Dipterocarpaceae, Fabaceae y Nyctaginaceae. Otras familias (Euphorbiaceae, Juglandaceae, Myricaceae, Myrtaceae) tienen sólo unas pocas especies ectomicorrízicas pero son principalmente micorrizas arbusculares. Hasta el momento, tres especies ectomicorrízicas se han encontrado en los bosques de la Reserva Biológica San Francisco, Pisonia sp. y dos especies de Neea, ambos géneros perteneciente a la familia Nyctaginaceae (Haug et al. 2005, 2014). of the plant families Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae and Salicaceae are ectomycorrhizal and thus ectomycorrhizal trees dominate the forests of the northern hemisphere. In the tropics, there are some plant families that have many ectomycorrhizal members, such as Dipterocarpaceae, Fabaceae and Nyctaginaceae. Other families (Euphorbiaceae, Juglandaceae, Myricaceae, Myrtaceae) have only a few ectomycorrhizal species but are mainly arbuscular mycorrhizal. So far, three ectomycorrhizal species have been found in the forests of Reserva Biológica San Francisco, Pisonia sp. and two species of Neea, both genera belonging to the family Nyctaginaceae (Haug et al. 2005, 2014). Alnus acuminata (see Chapter 3) is also ectomycorrhizal as well as the cultivated species of Eucalyptus and Pinus (Fig. 9). Alnus acuminata (ver Capítulo 3) es también ectomicorrízica también como especies cultivadas de Eucalyptus y Pinus (Fig. 9). 43

45 a b DB DB c d DB DB Figure 9. Pine mycorrhizas with dichotomous branching (DB). Photos by Haug I. Figura 9. Micorrizas de pino con ramificaciones de dicotómicas (DB). Fotos by Haug I. 44

46 En las regiones templadas, una planta ectomicorrízica puede asociarse con muchos hongos, hasta 50 socios de hongos diferentes se han encontrado en una sola plantación y varios cientos de hongos diferentes han sido encontrados asociados en una sola especie de árbol. Las tres especies Nyctaginaceae de la Reserva Biológica San Francisco estuvieron asociados con sólo seis diferentes hongos ectomicorrízicos, que pertenecen a tres linajes: Tomentella-Thelephora, Russula- Lactarius and Clavulina (Haug et al. 2014). Las especies de ectomicorrizas de nyctaginaceae Neea aff. floribunda y Pisonia sp. tienen una morfología particular: no hay raíces cortas y sólo partes de las raíces largas muestran estructuras ectomicorrízicas formadas por un único socio de hongos (Haug et al., 2005). Tedersoo et al. (2010) investigó tres géneros de plantas ectomicorrízicas en el Parque Nacional Yasuní (North East Ecuador): Coccoloba, Guapira y Neea. Este estudio reveló 25 especies de hongos para Coccoloba, 9 de Guapira y 11 para Neea. La mayoría de los hongos ectomicorrízicos pertenecen a los linajes de Tomentella-Thelephora, Russula-Lactariu and Clavulina, que también se encontraron en el Sur de Ecuador. En comparación In temperate regions, an ectomycorrhizal plant can associate with many fungal partners, up to 50 different fungal partners have been found in a single stand and several hundred different fungi have been found associated with only one tree species. The three Nyctaginaceae species from Reserva Biológica San Francisco were associated with only six different ectomycorrhizal fungi, which belong to three lineages: Tomentella-Thelephora, Russula- Lactarius and Clavulina (Haug et al. 2014). Ectomycorrhizas of the nyctaginaceae species Neea aff. floribunda and Pisonia sp. have a particular morphology: there are no short roots and only parts of the long roots show ectomycorrhizal structures formed by a single fungal partner (Haug et al. 2005). Tedersoo et al. (2010) investigated three ectomycorrhizal plant genera in Yasuni National Park (North East Ecuador): Coccoloba, Guapira and Neea. This study revealed 25 fungal species for Coccoloba, 9 for Guapira and 11 for Neea. Most of the ectomycorrhizal fungi belong to the lineages Tomentella- Thelephora, Russula-Lactariu and Clavulina, which were also found in South Ecuador in comparison 45

47 to temperate regions, richness of ectomycorrhizal fungi is relatively low Also, two-thirds of these ectomycorrhizal fungi preferred a particular host genus (plant), a feature uncommon in boreal forests Arbutoid mycorrhiza Arbutoid mycorrhiza is mainly found in Ericaceae that belong to the subfamily Arbutoideae, but occurs also in the genera Pyrola and Orthilia (Monotropoideae, Ericaceae). Arbutoid mycorrhiza resembles ectomycorrhiza, both morphologically and in terms of fungal affiliation. Just like ectomycorrhiza, arbutoid mycorrhizas possess a hyphal sheath (Figs. 10a,b) and a Hartig net restricted to the outermost layer of cortical cells (Figs. 10c, d). Arbutoid mycorrhizas, however, are further characterized by extensive intracellular colonization (Figs. 10c, d). con las regiones templadas, riqueza de hongos ectomicorrízicos es relativamente baja. Además, dos tercios de estos hongos ectomicorrízicos prefieren un género determinado de huésped (planta), una característica poco común en los bosques boreales Arbutoide micorriza La micorriza arbutoide se encuentra principalmente en Ericaceae que pertenecen a la sub familia Arbutoideae, pero se produce también en los géneros Pyrola y Orthilia (Monotropoideae, Ericaceae). Las micorrizas arbutoide se asemeja a la ectomicorriza, tanto morfológicamente como en términos de afiliación de hongos. Al igual que las ectomicorrizas, la emicorrizas arbutoid poseen una vaina de las hifas. (Figs 10a, b) y una red de Hartig restringido a la capa más externa de las células corticales. ( Figs 10c, d). Las micorrizas arbutoide, sin embargo, se caracterizan además por una extensa colonización intracelular (Figs. 10c, d). 46

48 a b M c C d C C HM HM C Figure 10. Arbutoid mycorrhiza: a., b. Fine root systems and arbutoid mycorrhizas of Arctostaphylos uva-ursi; c., d. cross sections of arbutoid mycorrhizas with hyphal mantle, Hartig net (arrows) and intracellular hyphae in the outer cortical cells. HM = hyphal mantle, M = mycorrhiza, C = cortical cell with intracellular hyphae. Photos by Haug I. Figura 10. Arbutoide micorriza: a., b. Sistema de raíces finas y micorrizas arbutoid de Arctostaphylos uva-ursi; c., d. sección transversal de arbutoide micorriza con manto de hifas, red de Hartig (flechas) e hifas intracelulares en las células corticales externas. HM = manto de hifas, M = micorriza, C = células corticales con hifas intracelulares. Fotos by Haug I. 47

49 Fungal species that form arbutoid mycorrhiza also form ectomycorrhiza with trees and belong to the same orders of Basidiomycota and Ascomycota (see above). However, not all ectomycorrhizal fungi do also form arbutoid mycorrhiza. Most arbutoid mycorrhizal plants occur in the understory of ectomycorrhizal dominated forests in the temperate zone. The only arbutoid mycorrhizal plant known from the tropics is Comarastaphylos arbutoides growing in Central America together with its fungal partners Leccinum monticola, Sebacina sp. and Leotia cf. lubrica (Kühdorf et al. 2015) Ericoid mycorrhiza This type of mycorrhiza is mainly found in the family of Ericaceae by species that form very fine roots, socalled hair roots. Some ferns form ericoid mycorrhiza, too. In order to see ericoid mycorrhizas, roots need to be sampled and stained in the same way as arbuscular mycorrhizas (for details see ). In the ericoid mycorrhizas, only the last order of rootles are mycorrhizal and these are normally very delicate and clear. Therefore, clearing with KOH is sufficient and further treatment with H 2 O 2 is not necessary. Especies de hongos que forman micorrizas arbutoide también forman ectomicorrizas con árboles y pertenecen a los mismos órdenes de Basidiomycota y Ascomycota (ver arriba). Sin embargo, no todos los hongos ectomicorrízicos también forman micorrizas arbutoide. La mayoría de las plantas de micorriza arbutoides ocurren en el sotobosque de bosques dominados ectomicorrízicos en la zona templada. La única planta de micorrizas arbutoide conocido desde los trópicos Comarastaphylos arbutoides que crece en América Central junto con sus socios de hongos de Leccinum monticola, Sebacina sp. y Leotia cf. lubrica (Kühdorf et al. 2015) Ericoide micorriza Este tipo de micorriza se encuentra principalmente en la familia de Ericaceae por especies que forman raíces muy finas, denominados pelos absorbentes. Algunos helechos también forman micorrizas ericoides. Para ver micorrizas ericoides, las raíces deben ser colectadas y teñidas de la misma manera como micorrizas arbusculares (para más detalles véase ). En las ericoides micorrizas, sólo las ultimas raicillas son micorrizadas y estas son normalmente muy delicadas y claras. Por lo tanto, la limpieza con 48

50 KOH es un tratamiento suficiente y además el tratamiento con H 2 O 2 no es necesario Las micorrizas ericoides forman rollos de hifas en la parte más externa de los pelos absorbentes de la raíz. (Fig. 11). A veces las hifas crecen en la superficie de la raíz pero no forman un manto de hifas (Fig. 11). El cambio de nutrientes ocure dentro de las células de las raíces donde los rollos intracelulares se forman (Fig. 11). Los hongos formadores de micorrizas ericoides son Ascomycota e.g. Rhizoscyphus ericae complejo, Meliniomyces, (Oidiodendron) y Basidiomycota (Sebacinaceae). Rhizoscyphus ericae demostró tener considerables capacidades saprotrophic, que permiten a las plantas recibir nutrientes de materiales orgánicos podridos, materiales orgánicos recalcitrantes a través de sus socios los hongos, los cuales no serían capaces de llegar por su cuenta. Ericoid mycorrhizal fungi form coils in the outermost layer of hair roots (Fig. 11). Sometimes, hyphae grow on the surface of the root but do not form a dense hyphal mantle (Fig. 11). Nutrient exchange occurs inside the root cells where intracellular coils are formed (Fig. 11). Fungi forming ericoid mycorrhiza are Ascomycota e.g. Rhizoscyphus ericae complex, Meliniomyces, (Oidiodendron) and Basidiomycota (Sebacinaceae). Rhizoscyphus ericae was shown to have considerable saprotrophic capabilities, which enable plants to receive nutrients from rotten, recalcitrant organic materials via their fungal partners, which they would not be able to reach on their own. 49

51 In the tropical mountain rain forest of Reserva Biológica San Francisco the following genera of Ericaceae show ericoid mycorrhizas: Vaccinium, Bejaria and Gaultheria (including Pernettya). En el bosque tropical de montaña de la Reserva Biológica San Francisco los siguientes géneros de Ericaceae muestran micorrizas ericoide: Vaccinium, Bejaria y Gaultheria (incluyendo Pernettya). a b H H Figure 11. Ericoid mycorrhiza. a. Longitudinal section of an ericoid mycorrhiza of Vaccinium with hyphal coils (H), b. illustration of an ericoid mycorrhiza. Hyphae grow on surface of the root and enter the outermost layer of the root (in blue). No Hartig net or coils is formed. Photo by I. Haug, illustration by Setaro S. Figura 11. Micorriza ericoide. a. sección longitudinal de una micorriza ericoide de Vaccinium con rollos de hifas (H), b. ilustración de una ericoide micorriza. Crecimiento de las hifas en la superficie de la raíz. Hifas crecen en la superficie de la raíz y entra la capa exterior de la raíz (H - en azul). Ni la red de Hartig cubierto de pelotones hifas. Foto por I. Haug, ilustración por Setaro S. 50

52 2.5. Cavendishioide micorriza Este tipo ha sido propuesto desde unos pocos años atrás (Setaro et al. 2006), pero este no se ha establecido e investigado a fondo como los otros tipos de micorrizas. La micorriza cavendishioide es similar a la micorriza arbutoide y esta tiene una vaina de hifas, una red de Hartig y rollos intracelulares de hifas (Fig. 12). Sin embargo, estas son más similares a la micorriza ericoide en términos de hongos y afiliación a plantas. Para observar las micorrizas cavendishioide, las raíces necesitan ser muestreadas y teñidas de la misma manera como las micorrizas ericoides (ver para detalles.). La cavendishioide micorriza esta principalmente formada por hemiepífitas de las Ericaceae perteneciendo al tan llamado Clade Andino de la subfamilia Vaccinoideae. Estas plantas ocurren solamente en los Neotrópicos y son frecuentes en la Reserva Biológica San Francisco. Los géneros con micorrizas cavendishioide encontrados en la Reserva Biológica San Francisco son: Cavendishia, Ceratostema, Diogenesia, Macleania, Orthaea, Psammisia, Sphyrospermum, Thibaudia. Los hongos que forman cavendishioide micorrizas son las mismas especies que forman las ericoide micorrizas Cavendishioid mycorrhiza This type has been proposed a few years ago (Setaro et al. 2006), but it is not as established and thoroughly investigated as the other mycorrhizal types. Cavendishioid mycorrhiza is similar to arbutoid mycorrhiza in that it has a hyphal sheath, Hartig net and intracellular hyphal coils (Fig. 12). However, it is more similar to ericoid mycorrhiza in terms of fungal and plant affiliation. To observe cavendishioid mycorrhizas, roots need to be sampled and stained the same way as ericoid mycorrhizas (see for details.) Cavendishioid mycorrhiza is mainly formed by hemiepiphytic Ericaceae belonging to the so-called Andean Clade of the subfamiliy Vaccinoideae. These plants occur only in the Neotropics and are frequent at the Reserva Biológica San Francisco. Genera with cavendishioid mycorrhiza found at Reserva Biológica San Francisco are: Cavendishia, Ceratostema, Diogenesia, Macleania, Orthaea, Psammisia, Sphyrospermum, Thibaudia. Fungi forming cavendishioid mycorrhizas are the same species that also form ericoid mycorrhiza. 51

53 a b H H H H Figure 12. a. Longitudinal section of a cavendishioid mycorrhiza from Disterigma empetrifolium. b. Illustration of a cavendishioid mycorrhizas. Hyphae (H) form a sheath around the rootlet, but also grow in between cells and within cells. Hyphae in between these cells form a Hartig net. Photo by Haug I., illustration by Setaro S. Figura 12. a. Sección longitudinal de una cavendishioide micorriza Disterigma empetrifolium. b. Ilustración de una micorriza cavendishioid. Hifas (H) forma una vaina alrededor de las raicillas, pero también crece entre las células y dentro de las células. Hifas entre esas células forman una red de Hartig. Foto por Haug I., ilustración por Setaro S. 52

54 2.6. Orquídeo micorriza Las orquídeas poseen relativamente raíces gruesas, porque ellas poseen un adicional tejido de raíz llamado velamen. El velamen no contiene hongos micorrízicos, pero ayuda a la planta a tomar nutrientes del aire. Especialmente, las orquídeas epífitas que tienen muchas raíces aéreas, por ello, es importante no tomar estas raíces en el estudio de las orquídeo micorrizas. Solamente las raíces en el sustrato o en el caso de las orquídeas epífitas con contacto directo al substrato son raíces micorrizadas. Debido a que las raíces de las orquídeas son tan gruesas, las estructuras micorrízicas no pueden ser observadas directamente. Las secciones transversales son necesarias y pueden facilmente hacerse a mano con una navaja de afeitar. Las secciones se montan en azul de metilo al 0,05 % (en 90 % en ácido láctico) en un portaobjeto y cubreobjeto y están listos para ser observados a través de microscopía. Las micorrizas en orquídeas son interacciones mutualistas entre orquídeas y un grupo restringido de Basidiomycota (Tulasnellaceae y Ceratobasidiaceae de Cantharellales, 2.6. Orchid mycorrhiza Orchids possess relatively thick roots, because they have an additional root tissue called the velamen radicum. The velamen does not contain mycorrhizal fungi, but helps the plant to take up nutrients from the air. Especially epiphytic orchids have many air roots and it is important to not sample these when studying orchid mycorrhizas. Only the roots in the substrate or in case of epiphytic orchids with direct contact to the substrate are mycorrhizal. Due to orchid roots are so thick, the mycorrhizal structures cannot be observed directly. Cross sections are needed and can be done easily by hand with a razor blade. The sections are then mounted in methylblue 0.05 % (in 90 % lactic acid) on a microscope slides and are ready for light microscopy. Orchid mycorrhizas are mutualistic interactions between orchids and a resticted group of Basidiomycota (Tulasnellaceae and Ceratobasidiaceae from Cantharellales, some Sebacinaceae from Sebacinales, and Atractiellomycetes in Pucciniomycota as newly described from Ecuador (Kottke et al. 2010). 53

55 Orchid seeds are tiny and contain nearly no food reserves for germination. This means that orchids are dependent on mycorrhizal fungi to feed them during this early stage with carbohydrates and minerals. The mycorrhizal fungi that support juvenile development of green orchids (all orchids in Ecuador), mainly Tulasnellaceae and Sebacinaceae (Basidiomycota), have saprophytic capabilities and can aquire carbohydrates from rotten plant cell walls (Kohler et al. 2015). Once the orchid embryo gets colonised by a mycorrhizal fungus it develops into a so-called protocorm. The basal regions of the protocorm are extensively colonised with fungal hyphae, growing intracellularly around the hypertrophied nucleus forming coils, which are called pelotons of hyphae (Fig. 13d). Intracellular hyphae have a limited life span and collapsed hyphae can therefore always be found next to active pelotons (Fig. 13b). When pelotons collapse, they appear as dark nuggets inside of cells and can thereby be distinguished from active pelotons which staining blue after acidic methylblue treatment. Shortly after mycorrhizal colonization, the protocorm turns green and the first leaves and roots algunos Sebacinaceae de Sebacinales, y Atractiellomycetes en Pucciniomycota estan entre los recientemente descritos en Ecuador (Kottke et al. 2010). Las semillas de orquídeas son diminutas y casí que no continenen reservas de alimentos para la germinación. Esto significa que las orquídeas son dependientes de los hongos micorrizícos para alimentarse con carbohidratos y minerales durante la edad temprana. Los hongos micorrízicos ayudan al desarrollo temprano de las orquídeas verdes (todas las orquídeas en el Ecuador), principalmente Tulasnellaceae and Sebacinaceae (Basidiomycota), tienen habilidades saprof íticas y pueden adquirir carbohidratos provenientes de las paredes celulares de las plantas en estado de pudrición. (Kohler et al. 2015). Una vez que el embrión orquídea es colonizado por un hongo micorrízico se desarrolla el tan llamado protocomo. La regiones basales de el protocormo son extensivamente colonizados con hifas fungales, creciendo intercelularmente al rededor del núcleo hipertrofiado formando coils, que son los llamados pelotones de hifas (Fig. 13d). La hifas intracelulares tienen una esperanza de vida limitada y las 54

56 hifas colapsadas pueden ser siempre encontradas junto a pelotones de hifas activas (Fig. 13b). appear. The roots become colonized by mycorrhizal fungi, forming the typical orchid mycorrhiza (Fig. 13). Cuando los pelotones colapsan, ellos aparecen como pepitas oscuras al interior de las células y de ese modo se pueden distinguir de los pelotones activos que se manchan de azul después del tratamiento de teñido con azul de metilo. Poco después de la colonización micorrízica, el protocormo se vuelve verde y aparecen la primeras hojas y raíces. Las raíces son colonizadas por micorrizas, formando la típica orquídeo micorriza. (Fig. 13). 55

57 a b C Hy Ve c d P P N Figure 13. Orchid mycorrhiza a. cross section of orchid mycorrhiza, b. sector of a.: small velamen, hypodermis and cortical cells with pelotons of hyphae, c.,d. pelotons of hyphae in cortical cells. C = cortical cell, Hy = hypodermis, Ve = velamen, P = pelotons of hyphae, N = nucleus. Photos by Haug I. Figura 13. Orquídeo micorrizas a. sección transversal de micorrizas de orquídeas, b. sector de un velamen pequeño, hipodermis y células corticales con pelotones de hifas, c.,d. pelotones de hifas en células corticales. C = célula cortical, Hy = hipodermis, Ve = velamen, P = pelotones de hifas, N = núcleo. Fotos Haug I. 56

58 Todavía no está claro cuanto las orquídeas adultas or las orquídeas verdes dependen de las orquídeo micorrizas, pero en el intercambio de azúcares para el fosfato ha sido demostrado. (Cameron et al. 2006, 2007, 2008). Estudios de orquídeas terrestres y epífitas en la selva tropical de montaña en la Reserva Biológica San Francisco revelaron que las comunidades de hongos con miembros de Tulasnella, Sebacina y el descubrimiento de un nuevo grupo de micobiontes en orquídeas, los Atractiellomycetes (Kottke et al. 2010). Esto fue un descubrimiento interesante porque Atractiellomycetes pertenece a los hongos de la roya, que son plantas con hongos patogénos. Además, se aislaron e identificaron mediante herramientas moleculares los hongos que crecen en el gran velamen de orquídeas epífitas. (Herrera et al. 2010). Todos los hongos cultivables pertenecen a Ascomycota, ninguno de ellos pertenecían a los de Glomeromycota. It is still unclear inasmuch adult orchid or green orchids depend on their orchid mycorrhiza, but exchange of sugars for phosphate has been shown (Cameron et al. 2006, 2007, 2008). Studies of trerrestrial and epiphytic orchids in the tropical mountain rain forest of Reserva Biológica San Francisco revealed fungal communities with members of Tulasnella, Sebacina and even the discovery of a new group of mycobionts in orchids - the Atractiellomycetes (Kottke et al. 2010). This was an interesting found because Atractiellomycetes belong to rust fungi, which are plant pathogenic fungi. Furthermore, fungi growing in the large velamen of epiphytic orchids were isolated and identified by molecular tools (Herrera et al. 2010). The cultivable fungi all belonged to Ascomycota, none of them belonged to Glomeromycota. 57

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60 Microrganismos simbióticos fijadores de N 2 : Actinorhiza La simbiosis tripartita de especies forestales actinorizicas (Alnus acuminata, Morella pubescens), actinobacterias (Frankia alni, Frankia sp.) y hongos nativos micorrízicos (Acaulospora sp. nov., Glomus sp) en los Trópicos. Foto Urgiles N. Symbiotic N 2 -fixing microorganisms: Actinorhizas The tripartite symbiosis of actinorhizal tree species (Alnus acuminata, Morella pubescens), actinobacteria (Frankia alni, Frankia sp) and native arbscular mycorrhiza (Acaulospora sp. nov., Glomus sp) in the Tropics. Photo Urgiles N.

61 Alnus acuminata and Morella pubescens, especies forestales usadas para cercos naturales. Alnus acuminata and Morella pubescens forest species used for natural fences.

62 3. Symbiotic N 2 -fixing microorganisms: Actinorhiza Actinorhiza is a symbiosis with Frankia, a filamentous actinobacterium (Gram-positive), which forms root nodules called actinorhiza. This association is formed by more than 140 plant species belonging to nine families of angiosperms. Many actinorhizal plants are pioneers growing on disturbed sites and have an important ecological impact on late successions. Frankia has the capability to fix nitrogen this means Frankia converts atmospheric nitrogen to ammonia by means of the enzyme nitrogenase. This N 2 fixation accounts for kg N 2 per hectar and year for Alnus species. The actinorhiza formation of Alnus starts with the infection of a root hair. At the basis of a root hair, bacterial hypha grow through the cell wall into a cortical cell and spread to the cortical tissue resulting in a local swelling of the root. After that, the formation of lateral roots is induced and the typical nodules are formed (Figs. 14b, c). Each root tip shows a characteristic zoning: a small uninfected region behind the meristematic tissue, 3. Microrganismos simbióticos fijadores de N 2 : Actinorhiza Actinorhizas son simbiosis con Frankia, un actinobacterium filamentoso (Gram-positivo), que forma nódulos en las raíces llamados actinorhiza. Esta asociación esta formada por más de 140 especies de plantas que pertenecen a nueve familias de angiospermas. Muchas plantas actinorrícicas son pioneras que crecen en sitios perturbados y tienen un impacto ecológico importante sobre sucesiones finales. Frankia tiene la capacidad de fijar nitrógeno esto significa que Frankia convierte el nitrógeno atmosférico en amonio por medio de la enzima nitrogenosa. Esta fijación de nitrógeno responde a kg N 2 por hectárea al año por especie de Alnus. La formación actinorhiza de Alnus comienza con la infección de los pelos absorbende de la raíz. En la base de los pelos absorbentes de la raíz, la hifa bacteriana crece a través de las paredes celulares entre las células corticales y se extiende hacia el tejido cortical que resulta de una protuberancia local de la raíz. Después, la formación de raíces lateral es inducido y son formados los típicos nódulos (Figs. 14b, c). 61

63 Cada raíz terminal muestra una característica zonificada: una pequeña región no infectada detrás del tejido meristemático, seguida de una zona de las células corticales llenas de hifas bacterianas y continua por una zona expandidad de células corticales con vesículas de Frankia donde se produce la actividad de la nitrogenasa. Los árboles de Alnus son de gran importancia en el sector forestal para Europa y América del Norte, porque producen una alta cantidad de madera dura. Alnus glutinosa plantado en cultivos mixtos con árboles de álamo Populus sp., aumentan el crecimiento de Populus en más del 200 % en tres años. En lo que concierne a nuestro conocimiento, no existen investigaciones sobre la mejora del crecimiento de los árboles vecinos y arbustos para Alnus acuminata y Morella pubescens. Sin embargo, debido a sus bacterias simbióticas, A. acuminata y M. pubescens añaden nitrógeno a los sitios perturbados. Alnus acuminata no solo se asocia con Frankia sino también con hongos micorrízicos, es decir, con micorrizas arbusculares y ectomicorriza, por lo tanto, es un socio simbiótico múltiple. Hay pocas investigaciones sobre las relaciones duales micorrízicas en Ecuador. followed by a zone of cortical cells filled with bacterial hyphae and continued by an expanded zone of cortical cells with Frankia vesicles where nitrogenase activity occurs. Alnus trees are of great importance to European and North American forestry, because they produce a high amount of hardwood. Alnus glutinosa planted in mixed cultures with poplar trees Populus sp., increase growth of Populus by more than 200 % in three years. To the best of our knowledge, there are no investigations about growth enhancement of neighboring trees and shrubs for Alnus acuminata and Morella pubescens. However, because of their symbiotic bacteria, A. acuminata and M. pubescens add nitrogen to disturbed sites. Alnus acuminata is not only associated with Frankia but also with mycorrhizal fungi, namely with arbuscular mycorrhiza and ectomycorrhiza fungi and thus is a multipartite symbiotic partner. There are only few investigations about the dual mycorrhizal relationships in Ecuador. It is not clear whether arbuscular mycorrhiza and ectomycorrhizal fungi are successional in Alnus or whether they cohabit in adult individuals. 62

64 No esta claro si las micorrizas arbuscular y ectomicorrizas son sucesionales en Alnus o que cohabitan en individuos adultos A partir de varios estudios de especies de Alnus en América del Norte, Europa y América del Sur, se sabe que simbiontes ectomicorrízicos son los socios de micorrizas dominantes de Alnus. Para Alnus acuminata en Argentina, la colonización ectomicorrízica resultó ser ~70-95 % y solo entre 1 a 8 % la colonización de arbuscular micorrizas (Becera et al. 2005). En el Sur de Ecuador, existen dos especies: Alnus acuminata (Fagales, Betulaceae, Fig. 14a) and Morella pubescens (Myricales, Myricaceae), que son micorrízicos y al mismo tiempo actinorrícicas (bacterias). From several studies of Alnus species in North America, Europe and South America, it is known that ectomycorrhizal symbionts are the dominant mycorrhizal partners of Alnus. For Alnus acuminata in Argentina, ectomycorrhizal colonization was found to be ~70-95 % and arbuscular mycorrhizal colonization only between 1 and 8 % (Becera et al. 2005). In the South of Ecuador, there are two plant species: Alnus acuminata (Fagales, Betulaceae, Fig. 14a) and Morella pubescens (Myricales, Myricaceae), that are mycorrhizal and at the same time actinorhizal (bacteria). a b c Figure 14. a. Seedling of Alnus acuminata (Andean alder) at a natural site in Loja, Ecuador. b., c. Roots and actinorhizal nodules of Alnus acuminata. Photos by Urgiles N. Figura 14. a. Plántula de Alnus acuminata (aliso andino) en un sitio natural en Loja, Ecuador. b., c. Raíces y nódulos de Frankia alni en Alnus acuminata. Fotos Urgiles N. 63

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66 Pristine forest of Reserva Biológica San Francisco (RBSF) at Podocarpus National Park. Montane Forest in Southern Ecuador. Photo by Haug I. Bosque virgen de la Reserva Biológica San Francisco (RBSF) en el Parque Nacional Podocarpus. Bosque Montano en el Sur de Ecuador. Foto Haug I. 65

67 Pristine forest of Reserva Biológica San Francisco (RBSF) at Podocarpus National Park. Montane Forest in Southern Ecuador. Photo by Haug I. Bosque virgen de la Reserva Biológica San Francisco (RBSF) en el Parque Nacional Podocarpus. Bosque Montano en el Sur de Ecuador. Foto Haug I.

68 4. Mycorrhizal fungi on montane forest in Southern Ecuador The mountain forest of the Reserva Biológica San Francisco in South Ecuador is exceptionally rich in indigenous tree species, orchids, ericads (ericaceae), and liverworts. Light microscopical studies revealed that all species are well colonized by structurally diverse arbuscular mycorrhizal fungi. Results from molecular analyses showed that the mycorrhizal fungal community of tropical forests in South Ecuador is highly diverse and includes Glomeromycota, Ascomycota and Basidiomycota (Kottke et al. 2008). Nearly all tree species form arbuscular mycorrhizas with Glomeromycota, epiphytic and terrestric orchids form orchid mycorrhizas with members of Basidiomycota (Tulasnellales, Sebacinales, Atractiellales). Sebacinales also occurred in mycorrhizas of hemiepiphytic ericads (cavendishioid mycorrhiza), and Tulasnellales were found in thallose liverworts belonging to Aneuraceae. Up to now there are shared members of Sebacinales within but not among orchids and ericads and also no shared members of Tulasnellales between orchids and liverworts. But there are a lot of shared Glomeromycota 4. Los hongos micorrízicos del bosque montano en el Sur de Ecuador El bosque de montaña de la Reserva Biológica San Francisco en el Sur de Ecuador es excepcionalmente abundante en especies nativas de árboles, orquídeas, ericas (familia ericaceae) y hepáticas. Los estudios en el microscopio óptico revelaron que la mayor parte de las especies forestales son bien colonizadas por hongos micorrízicos arbusculares con estructuras diversas. Los resultados de análisis moleculares de las comunidades de hongos micorrízicos de un bosque tropical en el Sur del Ecuador es altamente diverso e incluye Glomeromycota, Ascomycota y Basidiomycota (Kottke et al. 2008). Casi todas las especies de árboles forman micorrizas arbusculares Glomeromycota, epífitas y orquídeas terrestres forman orquideo micorrizas con miembros de Basidiomycota (Tulasnellales, Sebacinales, Atractiellales). Sebacinales también ocurren en micorrizas de hemiepífitas ericales (cavendishioide micorriza), y Tulasnellales fueron encontradas en hepáticas talosas pertenecientes a Aneuraceae. Hasta ahora se han compartido miembros de Sebacinales pero no 67

69 entre orquídeas y ericales y tampoco no se han compartido con miembros de Tulasnellales entre orquídeas y hepáticas. Pero hay un gran grupo de Glomeromycota compartida entre árboles de diferentes familias de plantas. Las estructuras de los hongos micorrízicos arbusculares observados en los árboles andinos fueron sorprendentemente diversos, pero los datos obtenidos son todavía insuficientes para determinar las especies (Beck et al. 2007). La única manera de aprender sobre la diversidad de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) es extraer y secuenciar ADN fúngico directamente de micorrizas. Sin embargo, este método proporciona solamente secuencias y por lo tanto, el concepto de especies morfológicas o biológicas no puede ser aplicado. En lugar de las especies, estas secuencias fúngicas son asignados a unidades taxonómicas operacionales (un sustituto para las especies). Si las secuencias se asignan a la misma Unidad Taxonómica Operacional (OTU), esto significa que la parte de su ADN secuenciado fue idéntico o muy similar. Los resultados de análisis de estos OTUs mostraron que la comunidad HMA de los bosques tropicales en el sur de Ecuador es muy diversa (Haug between tree species of different plant families. The fungal structures observed in arbuscular mycorrhizas of Andean trees were surprisingly diverse, but the gathered data are still insufficient to determine species (Beck et al. 2007). The only way to learn about AMF diversity is to extract and sequence fungal DNA directly from mycorrhizas. However, this method provides only sequences and therefore the morphological or biological species concept cannot be applied. Instead of species, these fungal sequences are assigned to Operational Taxonomic Units (a surrogate for species). If sequences are assigned to the same Operational Taxonomic Unit (OTU), it means that the sequenced part of their DNA was identical or highly similar. Results from these OTUs analyses showed that the AMF community of tropical forests in South Ecuador is highly diverse (Haug et al. 2010; 2013). There are only few frequent OTUs, but a lot of rare ones. Arbuscular mycorrhizal mycobionts of Ecuadorian forests belong to Glomerales, Diversisporales, Archaeosporales and Paraglomerales. 68

70 The Glomeraceae are the most species-rich family followed by Acaulosporaceae and Archaeosporaceae. Each tree individual harbors several OTUs as mycobionts and different individuals from the same plant species show a variety of fungal communities. All tree individuals are usually associated with one to three frequent and several rare OTUs. Frequent arbuscular mycorrhizal fungi are shared among different tree species of different families. Methods for plantations of native tree species are not yet established in Ecuador. However, tropical trees depend on AMF, so it is important to know which AMF are necessary for a successful establishment of nursery plants and for successive transfer to the forest. More investigations about AMF inoculum for afforestation and reforestation of native tree species in Ecuador are therefore needed. et al. 2010; 2013). Sólo hay pocas OTUs frecuentes, pero muchos de los raros. Micobiontes en micorrizas arbusculares de los bosques ecuatorianos pertenecen a Glomerales, Diversisporales, Archaeosporales y Paraglomerales. La familia Glomeraceaes son las más ricas en especies, seguido de Acaulosporaceae y Archaeosporaceae. Cada individuo de árbol alberga varias OTUs como micobiontes y diferentes individuos de la misma especie vegetal muestran una variedad de comunidades fúngicas. Todos los individuos de árboles se asocian generalmente con frecuencia entre uno a tres y algunos raros OTUs. Los hongos micorrízicos arbusculares frecuentes son compartidos entre las diferentes especies de árboles de las diferentes familias. Métodos para plantaciones de especies nativas de árboles aún no están establecidas en el Ecuador. Sin embargo, los árboles tropicales dependen de los HMA, por lo que es importante saber qué los HMA son necesarios para un establecimiento exitoso de plantas de vivero y para la transferencia sucesiva al bosque. Por lo tanto, se necesitan más investigaciones sobre los inóculos de HMA para la forestación y reforestación de especies nativas forestales en Ecuador. 69

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72 Development and application of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) inoculum Bioassay using native tree species and indigenous arbuscular mycorrhizae (+AMF) shows the increased of growth and development of forest seedlings in the greenhouse. Photo by Urgiles N. Desarrollo y aplicación de inóculo nativo de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) Bioensayo utilizando especies nativas forestales e inocula nativo de micorrizas arbusculares (+AMF) indican el incremento del crecimiento y desarrollo de las plántulas forestales en el invernadero. Foto Urgiles N. 71

73 Propagación de especies nativas forestales en invernadero. Loja, Ecuador. Propagation of native tree species in the greenhouse. Loja, Ecuador.

74 5. Development and application of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) inoculum. The application of AMF inocula for the production of tropical trees in the nursery is recommended because it increases plant growth and health. It also reduces the cost of chemical fertilizer for native tree species propagation Development of indiginous AMF inoculum The following strategies are used to produce AMF inoculum for native tree species: - Natural soil and/or mycorrhizal roots Indigenous AMF inoculum either comes from natural soils or mycorrhizal roots of tree species. This kind of AMF inoculum has to be used as soon as possible in order to obtain living mycorrhizal fungi propagules such as spores and mycelium for tree seedling promotion. The amount that can be used for this natural soil could be between 5 to 10 % the total volume substrote of the pot, and it is advisable to locate the AMF inoculum near the roots of the seedling. 5. Desarrollo y aplicación de inóculo nativo de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) Se recomienda la aplicación de inóculos de HMA para la producción de especies forestales del trópico en el vivero, ya que aumenta el crecimiento y sanidad vegetal. También reduce el costo de los fertilizantes químicos para la propagación de especies nativas forestales Desarrollo del inóculo nativo de HMA Las siguientes estrategias son utilizadas para producir inóculo de HMA para las especies nativas forestales: - Suelo natural y/o raíces micorrizadas El inóculo nativo de HMA puede provenir de suelos naturales o raíces micorrizadas de especies forestales. Este tipo de inóculo que incluye HMA tiene que ser usado tan pronto como sea posible a fin de obtener propágulos vivientes de los hongos micorrízicos tales como esporas y micelio para el desarrollo de plántulas forestales. La cantidad que se puede usar de tierra natural podría ser entre el 5 a 10 % del total del volumen del sustrato de la maceta, y es recomendable localizar 73

75 el inóculo (HMA) cerca de las raíces de la plántula. Este es un método más fácil y barato pero corre el riesgo de introducir suelo y raíces con patógenos hacia las plantas propagadas en el vivero. - Inóculo de HMA desde el cultivo de plantas trampa Otro método de obtención de inóculo nativo son provenientes de cultivos trampa. El inóculo de HMA a partir de cultivos trampa son favorables cuando las plántulas se producen a gran escala ya que este método no requiere grandes cantidades de suelo del bosque. Para producir cultivos trampa, se requiere pequeñas cantidades de suelo natural, fragmentos de raíz y esporas desde el sitio deseado se mezclan con un sustrato de cultivo y se rellenan en macetas. Los sustratos preferidos son sustratos con base de arena, sustratos sustitutos como turba o sustratos inertes tales como perlas de vidrio, vermiculita y perlita. El tamaño de partícula del sustrato es importante para el drenaje adecuado, la humedad y la aireación ya que se ha demostrado que influyen en la esporulación de los HMA. Plantas trampa, son plantas con ciclos de vida cortos, fáciles de cultivar y muestran alto nivel de colonización de HMA, las plántulas son plantadas This is a rather easy and inexpensive method but it bares the risk of introducing soil or root-born pathogens to the plant propagation into the nursery. - AMF inoculum from cultivation of trap plants Another method of obtaining native inoculum are trap cultures. AMF inoculum from trap cultures are favorable when seedlings are produced on a large scale because this method does not require vast amounts of forest soil. To produce trap cultures, small amounts of natural soil, root fragments and spores from the desired site are mixed with a cultivation substrate and filled in pots. Preferred substrates are sand-based substrates, substitute substrates such as peat or inert substrates such as glass beads, vermiculite and perlite. The particle size of the substrate is important for adequate drainage, humidity and aeration as it has been shown to influence sporulation of AMF. Trap plants, which are plants with short life cycles that are easy to culture and show high colonization level of AMF, are planted into the substrate in order to stimulate AMF growth. The following plants have been shown to be good trap plants: 74

76 Plantago lanceolata (lamb s tongue), Tagetes sp., (French Marigold), Allium sp., (onion, garlic), Lactuca sativa (lettuce) and Zea mays (maize). It may be helpful to put the pot cultures in sunbags (Fig. 15), which are translucent plastic bags, in order to avoid contamination with pathogenic microorganisms (Fig. 15). These trap plants can be either harvested completely and roots with substrate used as AMF inoculum, or just a few roots with substrate can be taken as AMF inoculum leaving the rest of the trap plant intact to obtaim more AMF inoculum to supply the native inoculum of HMA for a whole period. en el sustrato con el fin de estimular el crecimiento de los HMA. Las siguientes especies de plantas han mostrado ser buenas plantas trampa: Plantago lanceolata (lengua de cordero), Tagetes sp., (Caléndula francesa), Allium sp., (cebolla, ajo), Lactuca sativa (lechuga) y Zea mays (maíz). Puede ser útil poner las plantas trampa cultivadas en bolsas térmicas (Fig. 15), que son bolsas de plástico translúcidas, con el fin de evitar la contaminación con microorganismos patógenos (Fig. 15). Estas plantas trampa pueden ser cosechadas las raíces con el sustrato por completo y utilizados como inóculo de HMA, o sólo se pueden tomar unas pocas raíces con sustrato y utilizarlo como inóculo de los HMA dejando el resto de la planta trampa intacta para seguir obteniendo más inóculo para el abastecimiento de inóculo nativo de HMA durante todo un periodo de tiempo. 75

77 Figure 15. Cultivation of the trap plants Plantago lanceolata at UNL, Loja, Ecuador. Photos by Urgiles N. Figura 15. El cultivo de plantas trampa de Plantago lanceolata en la UNL, Loja, Ecuador. Fotos de Urgiles N. 76

78 Both of these inoculum production methods result in inocula with a mixture of different AMF species. This is because AMF fungi always grow in a community together with other AMF; they even share a single mycorrhizal root. Probably not all AMF species will survive the transplantation into pots, but studies showed that several AMF are be found in pot cultures. A mixture of AMF is preferable because greater diversity of AMF improves the plant s productivity due to show a functional complementarity. This means that several AMF species provide a greater benefit for the plant than any single AMF alone, because different AMF have slightly different capabilities and adaptations. For scientific experiments, though, inocula of single AMF (monoculture) are often preferred, because they allow to study the characteristics of a particular fungus and its effect on their host plants. Production of single species inocula is not easy, though, spores of the same species have to be selected individually and grown with trap plants in a sterile substrate. Then, cultures have to be placed in sunbags to prevent cross-contamination. After isolating the spores of AMF from trap plants, identification of spores has to be done by an expert in order to make sure the fungus of Los dos métodos de producción de inóculo resulta un inóculo con una mezcla de diferentes especies de HMA. Esto se debe a que los HMA siempre crecen en una comunidad junto con otros HMA; incluso comparten una sola raíz micorrízica. Probablemente no todas las especies de HMA sobrevivan al trasplante en macetas, pero los estudios demostraron que varios HMA se pueden conocer en cultivos de maceta. Es preferible una mezcla de HMA porque hay una mayor diversidad de HMA que mejora la productividad de la planta debido a que presenta una complementariedad funcional. Esto significa que varias especies de HMA proporcionan un mayor beneficio para la planta que cualquier HMA solo, porque diferentes HMA tienen ligeramente diferentes capacidades y adaptaciones. Para los experimentos científicos, aunque, a menudo se prefiere inóculos de una sola especie de HMA (monocultivo), ya que permiten estudiar las características de un hongo en particular y su efecto en sus plantas hospederas. Aunque la producción de inóculos en una sola especie no es fácil, sin embargo, las esporas de la misma especie tienen que ser seleccionadas individualmente y crecidas con plantas trampa en un sustrato estéril. 77

79 Luego, los cultivos tienen que ser colocados en bolsas térmicas para prevenir la contaminación. Después de aislar las esporas de HMA de las plantas trampa, la identificación de esporas tiene que ser realizada por un experto con el fin de asegurarse de que el hongo de interés se propagó en realidad y no un contaminante para utilizarlo en la propagación de plantas como inóculo de HMA Aplicación de inóculo nativo de HMA EL inóculo nativo de HMA producido en el vivero o en el laboratorio puede añadirse a las semillas o plántulas de las siguientes maneras: - Método de inoculación de plántulas Las plántulas se cultivan primero en bandejas de vivero sin inóculo y luego se transplantan a macetas o bolsas de polietileno. El inóculo de micorrizas es bien mezclado con sustrato o independientemente colocado cerca de las raíces de la plántula, después las semillas germinan y sus raíces penetran la lámina del inóculo en un tiempo establecido. Las plántulas micorrizadas pueden ser transplantadas en el campo, en el caso de las especies forestales enfocados interest was actually propagated and not just a contaminant for applying in plant propagation as inoculum of HMA Application of indigenous AMF inoculum The AMF inoculum produced in the nursery or laboratory can be added to seeds or seedlings in the following ways: - Seedling inoculation method Seedlings are first grown in nursery trays without inoculum and then are transplanted into pots or polyethylene bags. The mycorrhizal inoculum is either mixed with substrate or independently placed close to the seedling s roots, after a time of establishment. The mycorrhizal seedlings can be transplanted into the field, in the case of forest species focused on reforestation approaches or ecological restoration. - In-furrow application method of AMF inoculum Seeds and native inoculum of AMF are spread over the soil surface infurrow or inoculum and seeds can be 78

80 placed in-furrows at a certain distance and covered with soil. Then, the seeds germinate and their roots penetrate the inoculum layer. The AMF inoculum has to be placed in growing area of a plant or in immediate distance to germinating seeds, ensuring fungal colonization of AMF the seedlings roots. a la reforestación o restauración ecológica. - Método de aplicación en surco del inóculo de HMA Las semillas y el inóculo nativo de HMA se extienden sobre la superficie del suelo en el surco o inóculo y las semillas se puede esparcir en surcos a una cierta distancia y se cubre con tierra. Después, las semillas germinan y sus raíces penetran la capa de inóculo. El inóculo de HMA tiene que ser colocado en el área del crecimiento de una planta o a una distancia inmediata a la germinación de las semillas, lo que garantiza la colonización de los HMA en las raíces de las plántulas. 79

81 80

82 Bioassay at greenhouse using native tropical tree seedlings and Ecuadorian indigenous AMF inoculum. Forestry School at National University of Loja. Photo by Urgiles N. Bioensayo en invernadero utilizando plántulas nativas forestales del trópico e inóculo nativo ecuatoriano de HMA. Carrera de Ingeniería Forestal de la Universidad Nacional de Loja. Foto Urgiles N 81

83 a) Plántulas de Handroanthus crhysanthus (sinónimo Tabebuia chrysantha, guayacan), y b) Cedrela montana (cedro). a) Seedlings of Handroanthus crhysanthus (synonym Tabebuia chrysantha, guayacan tree), and b) Cedrela montana (cedar tree).

84 6. Experimentos de vivero con plántulas nativas del tropico e inóculo de HMA en Loja (UNL), Ecuador Hemos llevado a cabo varios experimentos de vivero con el objetivo de aplicar el inóculo nativo de HMA como biofertilizante para la propagación de especies nativas forestales. Para probar si los inóculos de HMA aumentararon el rendimiento de las plántulas en los experimentos en vivero forestal, hemos trabajado con Alnus acuminata (aliso andino), Morella pubenscens (sinónimo Myrica pubescens, laurel de cera), Juglans neotropica (nogal, nogal ecuatoriana, nogal Andino), Inga acreana (conocida comúnmente como pacae o guaba), Cedrela montana (cedro, cedro andino, cedro colorado), Heliocarpus americanus (llamado balsa, majaguillo o majagua), y Handroanthus chrysanthus (sinónimo Tabebuia chrysantha, y comúnmente conocida como guayacán). La evaluación de los inóculos de los HMA nativos se hace a través de la medición de los siguientes parámetros: tasa de micorrización (%), altura de las plántulas (cm), diámetro del cuello de la raíz (cm), número de hojas, biomasa aérea y radicular (g) después de seis meses de la inoculación. Los resultados de los experimentos son presentados en breve en los siguientes párrafos. 6. Nursery experiments with native tropical seedlings and AMF inoculum in Loja (UNL), Ecuador We conducted several nursery experiments with the aim to apply indigenous AMF inoculum as biofertilizer for the propagation of native tree species. To test if the inocula of AMF increase seedling performance in the tree nursery experiments, we worked with Alnus acuminata (Andean alder), Morella pubenscens (synonym Myrica pubescens, laurel wax), Juglans neotropica (nogal tree, Ecuadorian walnut, Andean walnut), Inga acreana (commonly known as pacay or ice-cream bean), Cedrela montana (cedar tree, Andean cedar, red cedar), Heliocarpus americanus (named balso, majaguillo or majagua), and Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha, and commonly known as guayacan). The evaluation of indigenous AMF inocula was done through measuring the following parameters: mycorrhization rate (%), height of seedlings (cm), root collar diameter (cm), number of leaves, above ground- and underground biomass (g) about six months after inoculation. The results of experiments are shortly presented in the following paragraphs. 83

85 6.1. Experimento de inoculación Nº1 (Urgiles et al. 2009) Cedrela montana y Heliocarpus americanus Investigamos el estudio de factibilidad de la utilización de raíces micorrizadas de plántulas de Inga acreana, Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha), Cedrela montana and Heliocarpus americanus. Primeramente, cada una de estas especies forestales fueron inoculadas con hongos micorrízicos provenientes de humus del bosque. Seguidamente C. montana and H. americanus fueron inoculados con raicillas micorrizadas de hongos micorrízicos arbusculares nativos. La inoculación se hizo con una mezcla de raíces micorrizadas de las cuatro especies forestales o sólo con raíces micorrizadas de las mismas especies forestal. La medición del diámetro de la raíz, altura de la planta y la producción de biomasa fueron comparados en los resultados. Todas las plantas fueron altamente colonizadas con hongos micorrízicos arbusculares como se muestra por los rollos de hifas intracelulares, hifas intercelulares, vesículas frecuentes, las esporas y arbúsculos (Fig. 16). El uso de micorrizas obtenidas a partir de plántulas de C. montana o de inóculo 6.1. Inoculation experiment Nº1 (Urgiles et al. 2009) Cedrela montana and Heliocarpus americanus We investigated the feasibility study of using mycorrhizal roots from seedlings of Inga acreana, Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha), Cedrela montana and Heliocarpus americanus. Firstly, each of these tree species was inoculated with mycorrhizal fungi from forest humus; second, C. montana and H. americanus was inoculated with mycorrhizal roots of native arbuscular mycorrhizal fungi. Inoculation occurred with either a mixture of mycorrhizal roots from all four species or only with mycorrhizal roots from the same tree species. Measuring the root collar, plant height, and biomass production compared the results. All plants were highly colonized with arbuscular mycorrhizal fungi as shown by intracellular hyphal coils, intercellular hyphae, frequent vesicles, spores and arbuscules (Fig. 16). The use of mycorrhizas obtained from Cedrela seedlings or from mixed inoculum did not result in different root collar diameter or plant height in C. montana. However, biomass 84

86 production was higher in seedlings with mixed inoculum. Inoculation with mycorrhizas from H. americanus significantly improved root collar diameter, plant height and biomass of H. americanus when compared to the non-inoculated, non-fertilized plants. Inoculation with mixed mycorrhizas from all four of tree species was even more effective for root collar diameter and biomass production. Larger plant height and higher biomass was obtained by the application of 0.25 g Osmocote to inoculated seedlings of H. americanus. For C. montana, fertilization resulted only in improved plant height. Moderate fertilization did not suppress mycorrhization. The inoculation technique applied here allowed for collection ofnative fungi that may be well adapted to local nursery conditions. The survey of mycorrhizal structures revealed a multitude of AMF. The results also show that a mixture of roots from different forest tree species is more effective than only from roots of the mother tree. A moderate fertilization supported the growth enhancements of AMF inoculation. mixto no resultó diferente para el diámetro del cuello de raíz o altura de la planta en C. montana. Sin embargo, la producción de biomasa fue mayor en las plantas de semillero con inóculo mixto. La inoculación con micorrizas de H. americanus mejoró significativamente el diámetro del cuello de la raíz, altura de la planta y la biomasa de H. americanus en comparación con las plantas no inoculadas y no fertilizadas. La inoculación con micorrizas mixtos de las cuatro especies de árboles que fue más eficaz para el cuello de la raíz diámetro y la producción de biomasa. La mayor altura de la planta y la más alta biomasa se obtuvo mediante la aplicación de 0,25 g Osmocote a las plántulas inoculadas de H. americanus. Para C. montana, la fertilización dió como resultado en el incremento de altura de la planta. Fertilización moderada no suprimió la micorrización. La técnica de inoculación aplicado aquí permitido para la recolección de hongos nativos que pueden estar bien adaptados a las condiciones de viveros locales. El estudio de las estructuras de micorrizas reveló una multitud de HMA. Los resultados también muestran que una mezcla de raíces de diferentes especies de árboles forestales es más eficaz que las de raíces del árbol madre. Una fertilización moderada apoyó a mejorar el crecimiento e inoculación de HMA. 85

87 a b c d e f Figure 16. Structures of AMF observed by light microscopy in cortical cells of inoculated Cedrela montana seedlings (6 months) in the nursery of UNL: a., b. Appressorium and hyphae, c., d. vesicles and hyphae, e. hyphal coils in cortical cells, and f. arbuscules. Photos by Urgiles N. Figura 16. Estructuras de HMA observadas por microscopía óptica en las células corticales de plántulas inoculadas de Cedrela montana (6 meses) en el vivero de la UNL:. a, b. Apresorio e hifas, c., d. vesículas e hifas, e. rollos de hifas en las células corticales, y f. arbúsculos. Fotos by Urgiles N. 86

88 6.2. Experimento de Inoculación Nº2 (Urgiles et al 2014) Alnus y Morella inoculados con tierra natural y una mezcla producida de inóculo en el laboratorio de HMA Las especies de Alnus acuminata y Morella pubescens, las dos especies nativas de América del Sur son candidatas para mejoramiento del suelo y forestación de áreas degradadas. Se evaluó el potencial de la inoculación con micorrizas para la obtención de plántulas de árboles robustos para A. acuminata and M. pubescens. Por primera vez, un laboratorio Ecuatoriano produjo la mezcla del inóculo de HMA que fue puesto a prueba y se comparó con inóculo de suelo nativo de las dos especies forestales que contenían los HMA y los hongos ectomicorrízicos. El inóculo de HMA producido en el laboratorio consistíó en especies aisladas de HMA creciendo en semilleros de vivero, que han sido provenientes de suelo de bosque o de esporas de la rizosfera de plántulas de Cedrela en parcelas de reforestación. (Tabla.1). Las plántulas de ambas especies de árboles reaccionaron positivamente a ambos tipos de inóculos y mostraron 6.2. Inoculation experiment Nº2 (Urgiles et al. 2014) Alnus and Morella with natural soil and a laboratory-produced mixed AMF inoculum The species Alnus acuminata and Morella pubescens, both native to South America, are candidates for soil quality improvement and afforestation of degraded areas. We evaluated the potential of inoculation with mycorrhizal fungi for obtaining robust tree seedlings for A. acuminata and M. pubescens. For the first time, a laboratory-produced mixed Ecuadorian AMF inoculum was tested in comparison to native soil inoculum from stands of both tree species containing AMF and ectomycorrhizal fungi. The laboratory-produced AMF inoculum consisted of AMF species isolated from nursery grown seedlings, which had been inoculated with forest soil or from spores of the rhizosphere of Cedrela seedlings grown on reforestation plots (Tab.1). Seedlings of both tree species reacted positively to both types of inocula and showed an increase in height, root collar diameter and above- and belowground biomass production, but mycorrhizal root colonization was rather low in M. pubescens. After 6 months, biomass was significantly 87

89 higher for all mycorrhizal treatments when compared to control treatments, whereas aboveground biomass was approximately doubled for most treatments. Overall, application of native soil inoculum improved plant growth to a larger extent than the laboratory inoculum. The native soil inoculum contained sufficient AMF propagules but potentially also other soil microorganisms that synergistically enhanced plant growth performance Inoculation experiment Nº3 (Schüßler et al. 2015) Handroanthus, Cedrela and Heliocarpus with defined AMF AMF from single-species inoculum (Table 1) were tested for seedlings of Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha), Cedrela montana and Heliocarpus americanus. A mixture of these species was used in experiment 2. The isolated AMF species belonged to seven different families of Glomeromycota, thus a great phylogenetic spectrum was tested. Some of the AMF isolates showed tree-specific colonization levels, indicating preferences for AMF isolates to certain host plants. However, the three plant species responded very similarly in growth un incremento en la altura, diámetro del cuello de la raíz y la producción de biomasa por encima y por debajo del suelo, pero la colonización de la raíz de micorrizas fue bastante baja en M. pubescens. Después de 6 meses, la biomasa fue significativamente mayor para todos los tratamientos de micorrizas en comparación con los tratamientos de control, mientras que la biomasa aérea fue aproximadamente el doble para la mayoría de los tratamientos. En general, la aplicación de inóculo de suelo nativo mejoró el crecimiento de las plantas en un grado mayor que el inóculo de laboratorio. El inóculo de suelo nativo contenía propágulos de HMA suficientes pero potencialmente también otros microorganismos del suelo que sinérgicamente mejoraron el rendimiento del crecimiento de las plantas Experimento de inoculación 3 (Schüßler et al 2015) Handroanthus, Cedrela y Heliocarpus con HMA definido El inóculo de HMA de una sola especie (Tabla 1) fueron probadas en plantas de semillero de Handroanthus chrysanthus (sinónimo Tabebuia chrysantha), Cedrela montana y Heliocarpus americanus. Una mezcla de estas especies se utilizó en el 88

90 experimento 2. Las especies aisladas de HMA pertenecían a siete familias diferentes de Glomeromycota, por tanto, un gran abanico filogenético fue probado. Algunos de los HMA aislados mostraron niveles de colonización específica de árboles, lo que indica las preferencias de HMA aislados a ciertas plantas huéspedes. Sin embargo, las tres especies de plantas respondieron de manera muy similar en el crecimiento al diverso grupo filogenético de HMA. Acaulospora sp. (Figs. 17, 18) y Dentiscutata savannicola causó un ligero aumento en el crecimiento de las plantas en comparación con los otros hongos micorrízicos en C. montana (Fig. 18) y plántulas de H. americanus, pero las diferencias no fueron significativas. No hubo una mejor respuesta para D. savannicola en H. chrysanthus (Fig. 17), sino una producción de biomasa ligeramente mayor para Archaeospora sp. La combinación del inoculante de HMA con una baja dosis de fertilizante de liberación lenta mejoró el potencial de los cultivos de árboles del trópico, siendo los más fuertes. Los hongos MA probados son candidatos prometedores para un mejor manejo en la producción de plántulas de especies forestales tropicales, pero el esfuerzo por mantener y producir especies de HMA individuales es muy alta. to the phylogenetically very diverse AM fungi. Acaulospora sp. (Figs. 17, 18) and Dentiscutata savannicola caused a slight increase in plant growth in comparison to the other mycorrhizal fungi in C. montana (Fig. 18) and H. americanus seedlings, but the differences were not significant. There was no enhanced response to D. savannicola in H. chrysanthus seedlings (Fig. 17), but a slightly higher biomass production for Archaeospora sp. The combination of AMF inoculation with a low dosage of slow release fertilizer improved potential tropical crop trees performance the strongest. The AM fungi tested are promising candidates for an improved management of tropical tree seedling production but the effort to maintain and produce individual AMF species is very high. 89

91 Table 1. Ecuadorian AMF inoculum (spores/isolates)applied to native tree seedlings Cuadro 1. Inóculo ecuatoriano de HMA (esporas/aislamientos) aplicado a plántulas nativas de especies forestales. Family / Familia Diversisporaceae Claroideoglomeraceae Ambisporaceae Acaulosporaceae Glomeraceae Archaeosporaceae Gigasporaceae Isolate / Aislado Diversispora sp. Claroideoglomus sp. Ambispora sp. Acaulospora sp. Rhizophagus sp. Archaeospora sp. Dentiscutata savannicola 90

92 a b c d Figure 17. Differences among treatments on seedlings of Handroanthus chrysanthus (6 months) inoculated with AMF inocula at a nursery experiment at UNL, Loja, Ecuador. a., b., d. shows replicates 1, 2 and 3 of different treatments with Acaulospora sp., nov., (Att ) inoculum, and c. five plants per treatment. Reading from right to left, the five treatments are: CTRL (control), +AMF/LF (living AMF and low fertilization 0,25g/plant), FF (full fertilization), -AMF/FF (inactivated AMF and full fertilization 0.75g/plant), and +AMF (living AMF). Photos by Urgiles N. Figura 17. Las diferencias entre tratamientos en plántulas de Handroanthus chrysanthus (6 meses) inoculados con hongos mcorrízicos arbusculares en el experimento de vivero de la UNL, Loja, Ecuador. a., b., d. muestra repeticiones 1, 2 y 3 diferentes tratamientos con inóculo de HMA de Acaulospora sp., nov., (Att ) y c. cinco plantas por tratamiento. La lectura de derecha a izquierda, los cinco tratamientos son: CTRL (control), +AMF/LF (AMF activos y baja fertilización de 0,25g/planta), FF (ful fertilización), - AMF/FF (AMF inactivado y ful fertilización 0.75 g/planta) y +AMF (AMF activos). Fotos Urgiles N. 91

93 Figure 18. Differences among treatments of Cedrela montana seedlings (6 months) inoculated with Acaulospora sp., at the tree nursery of UNL, Loja, Ecuador. Reading from left to right, the five treatments are: CTRL (control), +AMF/LF (living AMF and low fertilization 0,25g/plant), FF (full fertilization), -AMF/FF (inactivated AMF and full fertilization 0.75g/plant), and +AMF (living AMF). Photo by Urgiles N. Figura 18. Las diferencias entre los tratamientos de plántulas de Cedrela montana (6 meses) inoculados con Acaulospora sp., En el vivero de la UNL, Loja, Ecuador. La lectura de izquierda a derecha, los cinco tratamientos son: CTRL (control), + AMF/LF (AMF vivientes y baja fertilización 0,25g/planta), FF (fertilización completa), -AMF/FF (AMF inactivado y fertilización completa 0.75 g/planta) y +AMF (AMF vivientes). Foto Urgiles N. 92

94 Los experimentos de inoculación realizados mostraron que la inoculación con cualquiera de los hongos de AM mejoraron significativamente el crecimiento de las plántulas. Todos los inóculos contaron con hongos nativos de AM. Entre los distintos inóculos no hubo diferencias importantes. En resumen, las mezclas de especies de HMA mostraron ventajas. Debido a que no hubieron más efectos beneficiosos importantes de los hongos específicos identificados, no es obligatorio trabajar con intensidad en el cultivo de cepas fúngicas aisladas. Una mezcla de HMA del suelo de los bosques naturales con plantas trampa es una buena alternativa. Este método de inoculación también puede ser fácilmente adaptado a la producción a gran escala de plantas micorrizadas en viveros. Sin embargo, el crecimiento y la proliferación de HMA en macetas deben ser supervisados con el fin de conocer cuando es necesario recopilar nuevo inóculo del bosque. Se sabe que la colonización de micorrizas y la eficacia está disminuyendo con el aumento de los niveles de nutrientes en el suelo. Por lo tanto, la inoculación y fertilización parecen ser contradictorias. Sin embargo, varios experimentos con hongos que contienen inoculantes micorrízicos ectomicorrízicos y arbusculares mostraron que The conducted inoculation experiments showed that inoculation with any of the tested AM fungi improved seedling growth significantly. All inocula consisted of indigenous AM fungi. Among the various inocula there were no major differences. In summary, mixed AMF species showed advantages. Because there were no stronger beneficial effects of specific identified fungi, it is not mandatory to work with the labor-intensive cultivation of isolated fungal strains. A mix of AMF from natural forest soil with trap plants is a good alternative. This inoculation method can also easily be adapted to large-scale production of mycorrhizal seedlings in nursery beds. However, growth and proliferation of AMF in pots need to be monitored in order to now when it becomes necessary to collect new inoculum from the forest. It is known that mycorrhizal colonization and effectiveness is declining with increasing nutrient levels in the soil. Thus, inoculation and fertilization seem to be contradictory. However, several experiments with ecto- and arbuscular mycorrhizal fungi containing inoculants showed that moderate fertilizer applications did not negatively affect colonization rates and improved the establishment of the seedlings overall. We, therefore, recommend the application of 93

95 inoculum and low amounts of fertilizer for the production of tree seedlings in nurseries. las aplicaciones de fertilizantes en cantidades moderados no afectaron negativamente las tasas de colonización y mejoraron el establecimiento de las plántulas en general, por lo tanto, recomendamos la aplicación de inóculo y bajas cantidades de fertilizantes para la producción de plántulas de árboles en viveros. 94

96 Native trees from tropical areas; Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha, guayacan), inoculated with AMF inocula for reforestation and restoration approaches in Southern Ecuador. Photos by Haug I. Especies nativas forestales de zonas tropicales; Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha, guayacan), inoculados con inóculos de HMA enfocados a la reforestación y restauración en el Sur de Ecuador. Fotos por Haug I. 95

97 Native trees from tropical areas; Cedrela montana (cedro) inoculated with AMF inocula for reforestation and restoration approaches in Southern Ecuador. Photos by Haug I. Especies nativas forestales de zonas tropicales; Cedrela montana (cedro) inoculados con inóculos de HMA enfocados a la reforestación y restauración en el Sur de Ecuador. Fotos por Haug I.

98 7. Inóculo de HMA para la reforestación y restauración en zonas tropicales Allen et al. (2003) probaron el uso de inóculo de sucesión temprana y tardío para seis especies forestales para reforestación restauración en México. Los resultados sugieren que en los bosques de temprana sucesión debe utilizarse el inóculo de HMA para aumentar el crecimiento de plántulas forestales. Huante et al. (2012) hizo una prueba experimental de reforestación para probar el efecto de dos fuentes diferentes de inóculos de HMA local desde dos sitios contrastantes: bosque maduro y pastos. El tratamiento de la HMA y el tratamiento de no micorrizas (control) se pusieron a prueba durante seis especies leñosas (de lento, intermedio y de rápido crecimiento). Especies difieren en su capacidad para beneficiarse de los HMA. Las especies de crecimiento lento mostraron la capacidad de respuesta mayor en altura de la planta y la producción de hojas, mientras que las especies de crecimiento rápido no fueron influenciados por la inoculación HMA. Sin embargo, los inóculos de HMA aumentaron la producción de hojas de todas las especies de plantas, independientemente de las características funcionales de las especies, lo que sugiere un mejor aprovechamiento del espacio sobre el 7. AMF inoculum for reforestation and restoration in tropical areas Several experimental setups of reforestation and restoration using AMF inoculation have been carried out in the tropics. Allen et al. (2003) tested the use of early- and latesuccessional inoculum for six earlyand late-successional tree species in Mexico. The results suggested that early-seral AMF inoculum should be used for seedlings, even for lateseral tree species. Huante et al. (2012) made an experimental reforestation trial to test the effect of two different sources of local AMF inocula from two contrasting sites: mature forest and pasture. The AMF treatment and the non-mycorrhizal treatment (control) were tested for six woody species (slow-, intermediate- and fast-growth). Species differed in their ability to benefit from AMF. The slowgrowing species showed the largest responsiveness in plant height and leaf production, while the fast growing species were not influenced by AMF inoculation. However, inocula of AMF increased leaf production of all plant species regardless the functional characteristics of species, suggesting a better exploitation of aboveground space and generating a light limited environment under the canopy, which contributed to pasture suppression. 97

99 Allen et al. (2003) tested the use of early- and late-successional inoculum for six early-and late-successional tree species in Mexico. The results suggest that early-successional forest the inoculum of AMF should be used for increasing the growth of tree seedlings. Nowadays, many tropical forests are converted into areas for agriculture and for raising livestock (FAO, 2010) on an alarming rate and these areas are often abandoned shortly after, because of unsustainable use. Several studies show a changed and reduced community composition of AMF on abandoned and disturbed sites. At our study sites in the Reserva Biológica San Francisco area, the arbuscular mycorrhizal communities of pristine forest and reforestation plots (on abandoned pastures, bracken fern zones, shrub vegetation and a gap of a pine reforestation) share many features: similar richness and diversity, similar number of Operational Taxonomic Units per plant individual and high similarity of Operational Taxonomic Unit composition. This suggests that in our study area the new flora kept the arbuscular mycorrhizal fungi of the forest for the most part and maintained it for over 36 years of anthropogenic use and several fire events. Size of disturbed sites might play a critical role for maintainance of suelo y la generación de un entorno limitado de luz bajo del dosel, lo que contribuyó a la supresión de los pastos. Allen et al. (2003) probaron el uso de inóculo temprano y tardío de sucesión para seis especies tempranas y tardías de sucesión de árboles en México. Los resultados sugieren que el bosque temprano de sucesión el inóculo de HMA se debe utilizar para aumentar el crecimiento de plántulas de árboles. Hoy en día, muchos bosques tropicales se convierten en zonas para la agricultura y para la crianza de ganado (FAO, 2010), en una taza alarmante y estas áreas son abandonadas, debido al uso insostenible. Varios estudios muestran un cambio y reducción en la composición de las comunidades de HMA en los sitios abandonados y perturbados. En nuestros sitios de estudio en el área de Reserva Biológica San Francisco, las comunidades de micorrizas arbusculares en bosques vírgenes y parcelas de reforestación (en pastizales abandonados, zonas de helechos, vegetación arbustiva y una brecha de reforestación de pinos) comparten muchas características: riqueza y diversidad similar, número similar de Unidades Taxonómicas Operacionales por individuo de planta y de alta similitud de composición de Unidades Taxonómicas Operacionales. Esto sugiere que en nuestra área de estudio 98

100 la nueva flora mantuvo los hongos micorrízicos arbusculares del bosque en su mayor parte y los mantuvo por más de 36 años de uso antropogénico y varios incendios. El tamaño de sitios perturbados podría desempeñar un papel fundamental para el mantenimiento de las comunidades de HMA. Los sitios perturbados en nuestro estudio fueron interceptados por barrancos con vegetación forestal más o menos natural. Por lo tanto, la entrada del inóculo de HMA de los bosques adyacentes a los sitios perturbados es otra explicación de como existe la alta diversidad y composición similar de HMA podría mantenerse. La alta tasa de deforestación en el Ecuador y el aumento de las áreas agrícolas abandonadas llaman para la regeneración del paisaje, restauración, forestación y reforestación. Para restaurar la integridad de nuestros ecosistemas forestales, es absolutamente esencial que empecemos la reforestación y restauración de áreas perturbadas con especies de árboles pioneros. El ensayo de reforestación de Aguirre (2007), realizado en el marco de DFG-RU816 Biodiversidad y Manejo Sustentable de la Megadiversidad de los Ecosistemas de de Montaña del Sur del Ecuador y en colaboración con el grupo de investigación forestal de la TUM de Munich Weber/Stimm/ AMF communities. Disturbed sites in our study were intercepted by ravines with more or less natural forest vegetation. Therefore, input of AMF inoculum from the adjacent forests to the disturbed sites is another plausible explanation on how high diversity and similar composition of AMF could be maintained. The high deforestation rate in Ecuador and increasing abandoned agricultural areas call for landscape regeneration, restoration, afforestation and reforestation. To restore the integrity of our forest ecosystems, it is absolutely essential that we start reforestation and restoration of disturbed areas with pioneer tree species. The reforestation trial of Aguirre (2007), done in the framework of DFG- RU816 Biodiversity and Sustainable Management of a Megadiverse Mountain Ecosystem in South Ecuador and in collaboration with the forestry research group of TUM, Munich Weber/Stimm/Günter/ Mosandl (RU402, Project C3), showed that different challenges have to be resolved first in order to succeed with reforestation. In this reforestation setup native trees seedlings of H. chrysanthus (synonym T. chrysantha), C. montana and H. americanus, and the foreign tree species as Eucalyptus 99

101 globulus, Pinus radiata and Pinus patula were used. Reforestation attempts on the pastures suffered from high mortality rates, especially for some of the native tree species (Aguirre, 2007; Palomeque, 2012). More promising results gave another reforestation experiment planting native species into natural clearings and into the understory of Pinus patula plantations (Aguirre et al. 2006). After 12 months, the native seedlings of Cedrela montana, Heliocarpus americanus, Tabebuia chrysantha, Piptocoma discolor, Alnus acuminata, Cupania sp., Myrica pubescens and Isertia laevis showed survival rates of over 90 %. Only Cinchona officinalis seedlings had a lower survival rate of 60 %. Reasons for better survival on these sites are likely the existing canopy that protects the seedling against wind, irradiation and drought stress. In addition, a high diversity of arbuscular mycorrhizal fungi is found on these sites and can facilitate robust levels of mycorrhization (unpublished data, I. Haug). Our data indicate that the use of specific mycorrhizal fungi inoculum in the nursery is also a good option to overcome reforestation problems in the Andes of Ecuador. Krüger (2013) evaluated the survival rates of nurseryinoculated, out-planted seedlings and found a significantly reduced mortality rate for H. chrysanthus Günter/Mosandl (RU402, Proyecto C3), mostró que los diferentes desaf íos tienen que ser resueltos primero para poder tener exito con la reforestación. En este trabajo de reforestación, se utilizaron plántulas de árboles nativos de H. chrysanthus (sinónimo T. chrysantha) C. montana y H. americanus, y las especies de árboles exóticos como Eucalyptus globulus, Pinus radiata y Pinus patula. Intentos de reforestación en pastos sufrieron altas tasas de mortalidad, especialmente para algunas de las especies de árboles nativos (Aguirre, 2007; Palomeque, 2012). Resultados más prometedores dieron en otro experimento de reforestación plantando especies nativas en los claros naturales y en el sotobosque de plantaciones de Pinus patula (Aguirre et al. 2006). Después de 12 meses, las plántulas nativas de Cedrela montana, Heliocarpus americanus, Handroanthus chrysanthus, Piptocoma discolor, Alnus acuminata, Cupania sp., Morrella pubescens e Isertia laevis mostraron tasas de supervivencia de más del 90 %. Sólo las plántulas de Cinchona officinalis tuvieron una tasa de supervivencia más baja del 60 %. Razones para una mejor supervivencia en estos sitios son probablemente el dosel existente que protege a la plántula contra el viento, la irradiación y la sequía. Además, una gran diversidad de hongos micorrízicos arbusculares 100

102 se encuentra en estos sitios y puede facilitar niveles robustos de micorrización (datos no publicados, I. Haug). Nuestros datos indican que el uso de inóculo específico de hongos micorrízicos en el vivero es también una buena opción para superar los problemas de reforestación en los Andes de Ecuador. Krüger (2013) evaluó las tasas de supervivencia de inóculos en vivero, plántulas sembradas en el campo se encontró una tasa de mortalidad significativamente reducida por H. chrysanthus (sinonimo T. chrysantha) en las parcelas de reforestación. Estos resultados señalan la importancia fundamental de la asociación de micorrizas en los enfoques de reforestación en la mejora de la revegetación de tierras perturbadas o pastos abandonados en los Andes y otras regiones. (synonym T. chrysantha) on the reforestation plots. These results point out the fundamental importance of the mycorrhizal association in reforestation approaches in improving re-vegetation of disturbed lands or abandoned pastures in the Andean and other regions. Based on the results outlined above, we worked with inoculation of early-successional species Heliocarpus americanus, Alnus acuminata, and Morella pubescens, and with mid-successional species Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha) and Cedrela montana. These tree species are promising candidates for large-scale reforestation of Andes forests. Basándose en los resultados descritos anteriormente, nosotros trabajamos con la inoculación de especies de sucesión temprana Heliocarpus americanus, Alnus acuminata, Morella pubescens, y con especies de sucesión mediana de Handroanthus chrysanthus (sinónimo Tabebuia chrysantha) y Cedrela montana. Estas especies de árboles son candidatos prometedores para la reforestación a gran escala de los bosques de los Andes. 101

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104 Implications for smart forest management are considered native trees for its ecological and economic value. Handroanthus chrysanthus (synonym Tabebuia chrysantha, guayacan tree) Photo by Haug I Implicaciones para el manejo forestal inteligente se consideran las especies nativas forestales por su valor ecológico y económico. Handroanthus chrysanthus (sinónimo Tabebuia chrysantha, guayacan) Foto Haug I.

105 a) Semilla de Handroanthus crhysanthus (sinónimo Tabebuia chrysantha, guayacan), y b) plántula de H. crhysanthus creciendo en el semillero. a) A seed of Handroanthus crhysanthus (synonym Tabebuia chrysantha, guayacan tree), and b) seedling of H. crhysanthus growing in the seedbed.

106 8. Implications for smart forest management... we know that mycorrhizal fungal communities in undisturbed tropical forest can be complex and species rich, we do not understand how important that complexity is to forest diversity, productivity and resilience. This is a remark from Ian Alexander and Marc-André Selosse who wrote an article in New Phytologist in 2009 about the workshop called Mycorrhizas in Tropical Forests held in Loja, Ecuador in October Since then, six years passed and research has broadened our understanding of mycorrhizal fungi in the tropics, but still many questions remain and more knowledge needs to be revealed. The complexity of this species-rich system encompassing tropical plants and mycorrhizal fungi with all its interactions and networks is a challenging task. New methods, such as high throughput sequencing, will help to get a better understanding of this complex system in the near future. However, we are far away from knowing the functionality and effectiveness of each species, especially for fungi that associate with trees that have hundreds of mycorrhizal species. Thus, basic research has to continue in natural forests. In parallel, there should be concerted efforts to reforest abandoned sites with native 8. Implicaciones para un manejo forestal inteligente... Sabemos que las comunidades de hongos micorrízicos en el bosque tropical inalterado pueden ser complejos y ricos en especies, no entendemos lo importante que es esa complejidad es la diversidad forestal, la productividad y la capacidad de recuperación. Este es un comentario de Ian Alexander and Marc-André Selosse quién escribió un artículo en New Phytologist en 2009 sobre el taller llamado Micorrizas en Bosques Tropicales realizado en Loja, Ecuador en octubre de Desde entonces, seis años pasaron y la investigación de los hongos micorrízicos en los trópicos se ha ampliado para nuestra comprensión, pero todavía quedan muchas preguntas y mucho conocimiento que tiene que ser revelado. La complejidad de este sistema rico en especies que abarca plantas tropicales y hongos micorrízicos con todas sus interacciones y redes es una tarea dif ícil. Nuevos métodos, como la secuenciación de alto rendimiento, ayudarán a tener una mejor comprensión de este complejo sistema en un futuro cercano. Sin embargo, estamos lejos de conocer la funcionalidad y efectividad de cada especie, especialmente para los hongos que se asocian con árboles que tienen cientos de especies de micorrizas. 105

107 Por lo tanto, la investigación básica tiene que continuar en los bosques naturales. Paralelamente, debe haber esfuerzos concertados para reforestar los sitios abandonados con especies nativas de árboles con el fin de preservar y restaurar el ecosistema del bosque tropical. Los estudios que presentamos aquí muestran que la inoculación con HMA en el vivero y el uso de árboles que dan sombra podría ser Pinus, Eucalyptus, Alnus son prometedores especies para aumentar la supervivencia de las plántulas sembradas en plantaciones establecidas. Los resultados anteriores indican que los ecosistemas naturales son reservorios de especies nativas de hongos micorrízicos y que estos pueden ser utilizados para generar inóculos nativos de hongos micorrízicos arbusculares a través de los cultivos trampa. Otros experimentos con especies de árboles tropicales nativos e inóculos de micorrizas nativas necesitan de ser realizados y que se apliquen con el fin de mejorar la regeneración del paisaje, la forestación, la reforestación y enfoques de restauración ecológica. tree species in order to preserve and restore the tropical forest ecosystem. The studies we presented here show that inoculation with AMF in the nursery and the use of shelter trees which might be Pinus, Eucalyptus, Alnus - are promising tools to increase the survival of planted seedlings in established plantations. Previous results indicated that natural ecosystems are reservoirs of indigenous species of mycorrhizal fungi and that these can be used to generate native arbuscular mycorrhizal fungi inoculum via trap cultures. Further experiments with native tropical tree species and indigenous mycorrhizal inocula need to be conducted and applied in order to improve landscape regeneration, afforestation, reforestation and ecological restoration approaches. We are hopeful that these collective efforts in combination with cessation or interrupt of massive deforestation will allow that tropical forests can still be enjoyed by our children, grandchildren and many more generations to come. Tenemos la esperanza de que estos esfuerzos colectivos en combinación con un cese o pare a la deforestación masiva permitirán que los bosques tropicales aún puedan ser disfrutados por nuestros hijos, nietos y muchas generaciones más por venir. 106

108 Refuge at Reserva Biológica San Francisco in the Podocarpus National Park. Photo by Haug I. Refugio en la Reserva Biológica San Francisco en el Parque Nacional Podocarpus. Foto Haug I.

109 Map of Podocarpus National Park located in Loja and Zamora Chinchipe provinces in the southeast of Ecuador. Made by Maita J. Mapa del Parque Nacional Podocarpus ubicado en las provincias de Loja y Zamora Chinchipe en el sureste de Ecuador. Elaborado por Maita J.