INMUNOLOGIA GENERAL E INMUNOQUIMICA. Trabajo Práctico Nº2: Inmunodifusión

Transcripción

1 INMUNOLOGIA GENERAL E INMUNOQUIMICA Trabajo Práctico Nº2: Inmunodifusión Eva Acosta Rodriguez eacosta@mail.fcq.unc.edu.ar Objetivo general: - Adquirir herramientas para evaluar, identificar y cuantificar Ags o Acs mediante técnicas de inmunoprecipitación Objetivos específicos: - Determinar cuantitativamente la IgG purificada en el TP Nº 1 mediante IDRS (Mancini) - Determinar mediante electroinmunodifusión la posible presencia de proteínas séricas contaminantes en la IgG purificada

2 Interacciones Ag-Ac Interacción bimolecular reversible Determinante antigénico (epitope) Puente H Enlace iónico I. hidrofóbicas I. van der Waals Dominio variable del Ac interacciones débiles interacción Ag-Ag fuerte requiere gran número de estas interacciones alta complementariedad ESPECIFICIDAD

3 Gran especifidad de la interacción Ag-Ac Desarrollo de ensayos inmunológicos para detectar o cuantificar Ags o Acs UTILIDADES DE LOS INMUNOENSAYOS Diagnóstico de enfermedades Monitoreo de la respuesta inmune humoral Identificación de moléculas biológicas o de interés médico

4 Tipos de interacciones Ag-Ac Primaria: - primera etapa - unión directa del Ac al Ag - no visualizable, sin fenómenos asociados - relativamente independiente de Tº y fuerza iónica ENZIMOINMUNOENSAYO INMUNOFLUORESCENCIA RADIOINMUNOANALISIS

5 Secundaria: - segunda etapa: agregación de los complejos formados en la interacción 1ria - fenómenos visibles a simple vista: precipitación o aglutinación - dependientes de Tº, ph, fuerza iónica, etc AGLUTINACION INMUNODIFUSION ELECTROINMUNODIFUSION

6 Terciaria: - solo en interacciones in vivo - efectos biológicos colaterales a la interacción (necrosis en la reacción de Arthus, efectos vasógenos y de miocontracción en anafilaxia)

7 Reacciones de inmunoprecipitación Interacción entre un Ac y un Ag soluble en solución acuosa Formación de complejos multimoleculares Desarrollo de precipitados visibles Factores físicoquímicos Características inmunoreactantes Proporción relativa de Ag y Ac

8 Factores físico-químicos temperatura fuerza iónica ph viscosidad afectan la difusión de los inmunoreactantes Difusión: movimiento de una sustancia disuelta desde el lugar de mayor concentración al de menor concentración tendiente a igualar las concentraciones en el seno del líquido Ley de Fick (difusión libre unidimensional en medio fluido) dq dt = D.A. dc dx D = cte. Tº V Q: cantidad de sustancia que difunde t: tiempo D: coeficiente de difusión A: área de difusión C: concentración inicial x: distancia recorrida Tº: temperatura V: volumen de la sustancia que difunde

9 Características de los inmunoreactantes Ac bivalente no fragmentos F(ab) complejos grandes insolubles complejos pequeños solubles Ag bivalente (al menos dos copias del mismo epitope) distintos epitopes (reaccionan con distintos Acs del As) complejos grandes insolubles complejos pequeños solubles

10 Proporción relativa de Ag y Ac La composición del enrejado (y su solubilidad) varían de acuerdo a la concentración relativa de los inmunoreactantes sin precipitado precipitado ppdo máximo precipitado sin precipitado

11 Composición de los complejos Sobrenadante exceso Ac exceso Ag Zona de exceso de Ac Zona de equivalencia Zona de exceso de Ag Precipitado Prozona Ag agregado

12 Métodos de inmunodifusión Sirven para determinar la concentración de Ags o Acs (cuantitativos), o para comparar Ags y evaluar su pureza (cualitativos) Utilizan medios gelificados (agar o gelatina) para evitar disturbios ocasionados por las corrientes en el fluido Tamaño de poros que permiten la libre difusión de inmunoreactantes Ausencia de reacción física ó química entre los inmunoreactantes y el gel Ley de Fick El tamaño de los poros debe retener los inmunocomplejos facilitando la precipitación Agar %

13 Principales sistemas de inmunodifusión Difusión Simple Difusión Doble Una dimensión Ag Ac Ag Ac Gel neutro Dos dimensiones (radial) Ac Ag Ag Ac Gel neutro

14 Inmunodifusión radial simple (IDRS, o técnica de Mancini) técnica de ID bidimensional simple: difunde sólo uno de los inmunoreactantes (Ag) mientras que el otro (Ac) está disuelto en el gel a concentración constante. Ac Ag Ac Ag Ac Ag precipitado Exceso Ac Exceso Ag Zona de equivalencia (anillo de precipitación)

15 técnica cuantitativa: el diámetro del anillo de precipitación es proporcional a la concentración inicial del Ag Ac Ag Ac Ag Ag Ac Diámetro del anillo Ac Ag Ecuación derivada de La Ley de Fick D = k[ Ag ] + 2 Do 2 [ ] Ag = D 2 Do k 2 D: diámetro del anillo Do: diámetro del orificio k: constante

16 PROCEDIMIENTO: 1. Preparar agar impregnado con Ac 2. Agregar estándares y muestras 200 mg/ml 800 mg/ml Muestra A 400 mg/ml 1600 mg/ml Muestra B 3. Colocar en cámara húmeda y permitir la difusión 4. Visualizar los anillos de precipitación. Medir diámetro 5. Realizar curva de trabajo con el diámetro de los estándares. Calcular concentración muestras problemas D 2 Do Muestra B Muestra A x x k D = k[ Ag ] + 2 Do 2 [Ag]

17 CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES los estándares y las muestras problemas se deben procesar simultáneamente en la misma placa de agar para igualar las condiciones de reacción (temperatura, fuerza iónica). la pendiente de la curva de trabajo (k) concentración del Ac en el agar depende de la más económico Ac diluido diámetros más grande mayor pendiente = sensibilidad bordes más difusos = mayor error Ac concentrado bordes nítidos = menor error menor pendiente = sensibilidad

18 Aplicación en Práctico Determinación cuantitativa de la IgG humana purificada en el TP 1 PROCEDIMIENTO

19 Inmunodifusión radial doble (IDRD, o técnica de Ouchterlony) técnica de ID bidimensional doble: ambos inmunoreactantes (Ag y Ac) difunden radialmente uno hacia el otro. Cuando se forma alcanza la zona de equivalencia se observa una banda de precipitación. Ag Ac Zona de exceso de Ag Zona de exceso de Ac Zona de equivalencia

20 La distancia a la que una sustancia difunde está : en relación DIRECTA con su CONCENTRACION. Ag Ac Ag Ac [ ] de equivalencia Exceso de Ac en relación INVERSA a su PM. Ag Ac Ag Ac PM Ag = PM Ac PM Ac

21 técnica cualitativa: permite analizar sistemas de Ag-Ac sin poder determinar la concentración de los inmunoreactantes Usos principales: verificar la pureza de una muestra (Ag o Ac) detectar Ags o Acs en una muestra CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES se debe cumplir la LEY DE FICK se forman tantas bandas de precipitación como sistemas Ag-Ac tengamos en la muestra los Ag o Ac no atraviesan la banda en la que ellos mismos precipitan los Ag o Ac pueden atravesar una banda en la que ellos no precipitan

22 PATRONES DE PRECIPITACION POR IDRD Sistemas con tres reservorios pueden generar bandas de precipitación que han recibido nombres específicos. IDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son iguales, por lo lo tanto se funden en una banda de precipitación. Y

23 NO IDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son distintos, cada uno origina bandas de precipitación independientes que se cruzan. YY

24 IDENTIDAD PARCIAL: los dos sistemas antigénicos comparten algún componente (banda que se funde), pero no son iguales (espolón o prolongación). YY

25 Inmunoelectroforesis (IEF) técnica semicuantitativa que combina dos metodologías: 1 ) separación de proteínas por electroforesis 2 ) inmunodifusión radial doble

26 Paso 1: Electroforesis Las proteínas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son sometidas a un campo eléctrico se separan en un gel de agar de acuerdo a su carga eléctrica. - + Consideraciones: Fenómeno de ELECTROENDÓSMOSIS: las proteínas poco cargadas son desplazadas en sentido contrario a su migración electroforética real.

27 Paso 2: Inmunodifusión Las proteínas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son sometidas a un campo eléctrico se separan en un gel de agar de acuerdo a su carga eléctrica. Antisuero - + Aplicaciones En laboratorios clínicos se utiliza para detectar presencia o ausencia de proteínas séricas, en el diagnóstico de Gammapatías. Investigar e identificar los componentes de una muestra antigénica.

28 Anti IgG Anti proteínas séricas totales Anti IgM Anti proteínas séricas totales Anti IgA Anti proteínas séricas totales