SÍNTESIS QUÍMICA, AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL ADN (II)

Transcripción

1 SÍNTESIS QUÍMICA, AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL ADN (II) M A R T Í N E S P A R I Z - E S P A R I I B R - C O N I C E T. G O V. A R B I O T E C N O L O G Í A D E L O S A L I M E N T O S

2 DNA SEQUENCING AT 40: PAST, PRESENT AND FUTURE Nature volume 550, pages (19 October 2017)

3 DNA SEQUENCING AT 40: PAST, PRESENT AND FUTURE Nature volume 550, pages (19 October 2017)

4 DNA SEQUENCING AT 40: PAST, PRESENT AND FUTURE Nature volume 550, pages (19 October 2017) Nat Protoc Feb;12(2):

5 (A)Un didesoxinucleótido. Los carbonos 2 'y 3' del resto de azúcar carecen de grupos hidroxilo. (B) Un desoxirribonucleótido. Molecular biotechnology : principles and applications of recombinant DNA / Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, and Cheryl L. Patten. 4th ed. Capítulo 4 (p98-143)

6 Bloqueo de la síntesis de ADN. El crecimiento de la cadena se detiene mediante la incorporación de un didesoxinucleótido al final de la cadena. El enlace internucleotídico entre el último nucleótido, que es un didesoxinucleótido, y el siguiente nucleótido entrante no pueden formarse porque no hay un grupo 3 'hidroxilo del didesoxinucleótido.

7 Extensión del cebador durante la síntesis de ADN en presencia de didesoxinucleótidos. Cada uno de los cuatro tubos de reacción contiene un conjunto único de extensiones variables de nucleótidos. Sólo se sintetizarán unas pocas moléculas de ADN de longitud completa en cada tubo de reacción. dntp, desoxirribonucleósido trifosfato.

8 Autorradiografía simulada de un gel de secuenciación de ADN de didesoxinucleótido. Cada calle del gel se cargó con el contenido de uno de los cuatro tubos de reacción, que contenía ddatp, ddctp, ddgtp o ddttp. Por convención, las bandas de la autorradiografía se leen de abajo hacia arriba. En este ejemplo, los resultados de la determinación de secuencia se muestran a la derecha.

9 Secuenciación Sanger de ADN. Los fragmentos que se sintetizan con un cebador (verde) a partir de un molde de ADN (azul) y terminados con didesoxinucleótidos fluorescentes se separan mediante electroforesis capilar. Un detector registra cada señal fluorescente inducida por láser. Las sucesivas señales fluorescentes se representan como un cromatograma de secuenciación (picos de color). Los secuenciadores de ADN automatizados comerciales ejecutan 96 muestras (Applied Biosystems 3730xl) y 384 (GE Healthcare MegaBACE 4550) al mismo tiempo.

10 Lectura de la computadora (A) de la secuencia de nucleótidos de un gel de secuenciación de cuatro colores y un carril (B). Los números denotan posiciones de nucleótidos. (C) Separación electroforética de los fragmentos de didesoxinucleótidos marcados fluorescentemente en una única línea que corresponde a la secuencia de nucleótidos mostrada en el panel A. (D) Autorradiografía de un gel de secuenciación de cuatro vías y una etiqueta para la secuencia de nucleótidos mostrada en el panel A.

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14 Secuencia Base de datos

15 Amplificación. Se observan las temperaturas y duraciones aproximadas de cada paso. El cebador es verde, el ADN molde es azul y los fragmentos terminados con didesoxinucleótidos son rojos.

16 Secuenciación de ADN por caminata de cebador. (1) La secuenciación del ADN se inicia con un cebador (P1) que es complementario a un sitio en un plásmido cerca del punto de inserción del ADN clonado. (2) En base al segmento del ADN clonado que acaba de secuenciarse, se sintetiza un segundo cebador (P2) que es complementario a un tramo de aproximadamente 20 nucleótidos cerca del final de ese segmento. (3) P2 se usa para secuenciar el siguiente segmento de ADN clonado. (4) En base al segmento del ADN clonado que acaba de secuenciarse, se sintetiza un tercer cebador (P3) que es complementario a un tramo de aproximadamente 20 nucleótidos cerca del final de ese segmento. (5) P3 se usa para secuenciar el siguiente segmento de ADN clonado. (6) En base al segmento del ADN clonado que acaba de secuenciarse, se sintetiza un cuarto cebador que es complementario a un tramo de aproximadamente 20 nucleótidos cerca del final de ese segmento. El proceso de sintetizar y usar nuevos iniciadores sucesivamente continúa hasta que se secuencia todo el inserto. PRIMER WALKING

17 Formación de enlaces fosfodiéster y liberación de pirofosfato durante la incorporación de un nucleótido al final de una cadena de ADN en crecimiento. La formación del enlace fosfodiéster ocurre entre el 3 'OH del azúcar desoxirribosa del último nucleótido incorporado y el α-fosfato del nucleótido entrante (flecha azul). El enlace entre los fosfatos α y β se escinde (flecha verde) y se libera pirofosfato (flecha negra). PYROSEQUENCING

18 Reacciones de enzimas de pirosecuenciación. Negro, incorporación de nucleótidos y liberación de pirofosfato; rojo, generación de luz a partir de pirofosfato con ATP sulfurilasa y luciferasa. La secuencia de ADN se determina correlacionando el grado de emisión de luz con un nucleótido particular. Verde, desglose del desoxinucleósido trifosfato no incorporado (dxtp) y cualquier ATP restante a monofosfatos (dxmp) por la apirasa. AMP, monofosfato de adenosina. PYROSEQUENCING

19 PYROSEQUENCING Determinación de la secuencia de ADN mediante pirosecuenciación. (A) Hebra de plantilla (fondo azul) con secuencia de cebador (letras azules). (B) Intensidades de señal (luz) con cuatro ciclos de pirosecuenciación basados en la secuencia de plantilla en el panel A. Un ciclo de pirosecuenciación consiste en cuatro rondas, donde una ronda representa la adición de uno de los cuatro desoxinucleótidos. A cada ronda le sigue el tratamiento con apyrase. Un signo menos no indica emisión de luz, y los signos más indican la cantidad relativa de luz liberada después de la introducción de un desoxinucleótido particular. (C) Pirograma basado en los datos en el panel B y la secuencia de nucleótidos deducida de la cadena que es complementaria a la secuencia de plantilla en el panel A.

20 SECUENCIACIÓN DE 2 Y 3 GENERACIÓN Nat Protoc Feb;12(2):