Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill.

Transcripción

1 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos Rafael Mª Navarro Cerrillo, José Valero Galván, Jesús V. Jorrín Novo. Ávila, 24 de septiembre de 2009.

2 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 2/20 El éxito de una repoblación requiere el control de todas las variables implicadas en la respuesta de la planta al establecimiento: la elección de la especie, las condiciones ambientales, el manejo de la planta y la morfología y fisiología de la planta (calidad de la planta). Pinus halepensis Mill. en el ámbito mediterráneo, y en particular en ambientes semiáridos, ha demostrado ser una especie con buena adaptabilidad y capaz de sobrevivir en situaciones de fuerte estrés hídrico siendo una de las especies más utilizadas en los programas de reforestación del sureste español. En cuanto a la calidad de planta en vivero, además de los atributos clásicos de control actualmente se están incorporando otras de bioquímica y biología molecular, aplicadas a la ecofisiología forestal, entre las que hay que destacar las nuevas metodologías -ómicas, genómica, transcriptómica y proteómica.

3 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 3/20 La proteómica tiene como objetivo el estudio del proteoma, es decir, el estudio de las proteínas presentes en una unidad biológica, en un momento concreto y bajo condiciones ambientales determinadas. IEF pi 5 6 Este objetivo se realiza a través de cuatro aproximaciones diferentes: kda Proteómica descriptiva. 66 Proteómica Proteómica comparativa de expresión o diferencial de expresión (comparativa). diferencial. Compara las diferencias en el45perfil proteico entre distintas situaciones, genotipos, órganos, Proteómica estados de aplicada desarrollo al estudio o factores de las modificaciones ambientales, postraduccionales. siendo un buen indicador del estado 36 fisiológico de la planta y su respuesta a estrés. Interactómica SDS-PAGE 14

4 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 4/20 OBJETIVO Mostrar los resultados preliminares de un ensayo de respuesta de brinzales de Pinus halepensis Mill. a un ciclo de sequía de 42 días aplicando una aproximación fisiológica y proteómica

5 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 5/20 Material vegetal Material: Pinus halepensis Mill. (h=15,45±1,98; Ø=1,97±0,27) cultivado en turba/perlita (3:1 v/v). Procedencia: Bética Septentrional (Vivero La Resinera (EGMASA-Junta de Andalucía); Arenas del Rey, Granada.) Condiciones: Tª: 23±1ºC.; H.R.: 60±5%.; Fotoperiodo: 12h luz/12h oscuridad.

6 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 6/20 Diseño experimental Tratamiento T0. Tratamiento control regado durante todo el ensayo Tratamiento T1. Tratamiento moderado estrés. Tratamiento regado a partir del día 15. Tratamiento T2. Tratamiento severo estrés. Tratamiento regado a partir del día 28 Tratamiento T3. Tratamiento muy severo. Tratamiento regado a partir del día 35.

7 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 7/20 Variables medidas Supervivencia Disponibilidad hídrica Potenciales hídricos Fluorescencia Extracción, separación y visualización de proteínas: Electroforesis bidimensional

8 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 8/20 Extracción, separación y visualización de proteínas Homogeneización en molinillo con N 2 líquido Extracción proteica con TCA/Fenol (Wang et al., 2006). Determinación de la concentración de proteínas mediante el método de Lowry (Lowry et al., 1951) Electroforesis bidimensional Primera dimensión (IEF): Tiras IPG 17 cm, gradiente lineal ph 5-8; 400 µg de proteínas; Rehidratación pasiva: 12 h; Condiciones: 60 ma/gel (Protean IEF Cell, BioRad) Segunda dimensión SDS-PAGE: 12% poliacrilamida; Condiciones: 30 ma/gel (Protean II Cell, BioRad) Tinción con Coomassie coloidal Brilliant Blue G-250 Captura de geles mediante densitómetro GS-800 Calibrated Densitometer (BioRad) Análisis de imágenes mediante el software PD-Quest ph 5 ph 8

9 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 9/20 RESULTADOS

10 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 10/20 SUPERVIVENCIA Supervivencia (%) T0 T1 T2 T3 0 Día1 Día7 Día14 Día21 Día28 Día35 Día42 Días de sequía

11 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 11/20 DISPONIBILIDAD HÍDRICA Porcentaje humedad (%) T0 T1 T2 T3 Día0 Día7 Día14 Día21 Día28 Día35 Día42 Duración ensayo (días)

12 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 12/20 POTENCIAL HÍDRICO 0 Ψ Día0 Ψ Día7 Ψ Día14 Ψ Día21 Ψ Día28 Ψ Día31 Ψ Día35 Ψ Día42 Potencial hídrico (MPa) -0,5-1 -1,5-2 T0 T1 T2 T3-2,5 Duración ensayo (días)

13 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 13/20 FLUORESCENCIA Fv/Fm 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 T0 T1 T2 T Duración del ensayo (días)

14 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 14/20 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Tratamiento T2 Tratamiento T3 Tratamiento T0 Tratamiento T1

15 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 15/20

16 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 16/20 Nº Análisis SSP Mr pi T T T T

17 Aplicación de la proteómica a estudios de respuesta a estrés hídrico en plantones de Pinus halepensis Mill. David Ariza Mateos 17/20 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES En este trabajo queda de manifiesto que las variables disponibilidad hídrica y potencial hídrico son importantes, porque definen el estado hídrico de una planta, pero que el tiempo al que una planta está sometida a esa baja disponibilidad de agua es lo realmente limitante; después de 35 días sometidas a estrés las plantas son incapaces de recuperarse y alcanzar valores normales para ninguna de las variables estudiadas. En cuanto a la eficiencia fotosintética estudiada a través de la fluorescencia de la clorofila (variable Fv/Fm), ocurre lo mismo, las plantas sometidas a una situación de estrés durante 28 días recuperan, pero cuando esta situación se prolonga hasta el día 35, las plantas de este tratamiento son incapaces de recuperar sus valores óptimos. La eficiencia del fotosistema II se reduce con la perdida de agua pero la situación es reversible cuando ésta no es constante durante mucho tiempo. Del análisis proteómico cabe destacar la presencia de cuarenta y tres proteínas diferenciales en función del tratamiento (riego/no riego/recuperación). Estas proteínas se pueden considerar marcadores moleculares y a través de su estudio conocer de una forma relativamente sencilla el estado fisiológico de las plantas. Relacionando las variables fisiológicas con el análisis proteico se puede ver que funciones se ven alteradas, en que grado, a partir de que momento (expresado en días de sequía o valores de potencial hídrico) y como esa alteración influye en la fisiología de la planta y como consecuencia última en su supervivencia.

18 Agradecimientos. Dpto. Biología molecular y bioquímica (UMA) Francisco Canovas Javier Canales F. Cantón Servicio Central Apoyo a la Investigación SCAI_UCO Red de Viveros de la Junta de Andalucía-EGMASA Manuel Arroyo Contacto. oikos2002es@yahoo.es Nombre David Ariza Mateos