Guía Práctica 8 Sclerotium rolfsii Manejo del hongo en el laboratorio Contenido Guillermo Castellanos, Experto en Investigación 2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto Fitopatología de Frijol Generalidades 8-2 Procedimientos 8-3 A. Recolección y transporte de las muestras 8-3 B. Preparación del medio de cultivo PDA 8-5 C. Aislamientos de S. rolfsii 8-6 1. En el medio de cultivo PDA 8-6 2. Aislamiento monomicelial 8-8 D. Incremento de S. rolfsii 8-10 E. Inoculación en el invernadero 8-12 F. Conservación de S. rolfsii para almacenamiento 8-15 G. Recuperación del hongo almacenado 8-15
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Generalidades Sclerotium rolfsii es el hongo causante de la enfermedad conocida como añublo sureño. Este hongo patógeno habita en el suelo y hace su aparición, principalmente en las épocas lluviosas del año cuando la temperatura es alta. Foto 1 Los síntomas característicos de la enfermedad se observan en el cuello de la raíz de la plántula de frijol; luego la enfermedad se extiende por el tallo. Cuando el ataque del hongo es muy fuerte, en el cuello de la raíz se ve su micelio blanco y los esclerocios en formación (Foto 1), lo que indica la muerte próxima de la plántula. La Foto 2 presenta una semilla de frijol que ha germinado y es atacada por el hongo, que la cubre de micelio. Los esclerocios de S. rolfsii son de forma esférica y su color varía: son blancos al iniciar su formación y pocos días después, cuando han madurado, se tornan de color castaño. Foto 2 8-2
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii Procedimientos A. Recolección y transporte de las muestras Para aislar el hongo Sclerotium rolfsii es necesario obtener material vegetal enfermo de una planta de frijol que presente síntomas específicos de la enfermedad; éstos, generalmente, aparecen en el cuello de la raíz. Materiales Toallas de papel Bolsas de papel Rótulos para identificar el material Prensa para muestras o un cuaderno corriente Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (de la raíz, generalmente) que se colecta se envuelve en una toalla de papel que sirve, además, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en último caso, papel periódico. Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algún papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plásticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulación de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de 8-3
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán el aislamiento del patógeno que se hace a partir del tejido de frijol. Rótulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol, tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, país), fecha de recolección de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en cada muestra. Recomendaciones Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en el campo de un agricultor o en una estación experimental. Cuando no haya suficientes rótulos para todas las muestras, marcar las bolsas con un código y registrar la información completa en una libreta de campo. No recolectar material vegetal húmedo; si está en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas de papel al aire libre para que termine de secarse. 8-4
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii Pasos del proceso Paso 1 Tomar muestras de una raíz que presente síntomas de la enfermedad. Paso 2 Envolver la muestra en una toalla de papel, colocarla en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el rótulo que corresponda (ver A. Recolección y...) Paso 3 Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del hongo patógeno. Nunca envíe las muestras dentro de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio (ver A. Recolección y...). B. Preparación del medio de cultivo PDA Las siglas PDA corresponden a los componentes del medio: papa, dextrosa y agar. Este medio se usa para aislar el patógeno. Materiales PDA deshidratado 39 g/litro Agua destilada 1 litro Frascos erlenmeyer de 1000 ml 2 8-5
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Preparación Foto 3 Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en un recipiente grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada uno). Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA se esterilizan en el autoclave. Esta máquina, con una presión de 20 libras y una temperatura de 121 C, realiza el proceso total de esterilización en 40 minutos. El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda manipularse (Foto 4) y se vierte luego en cajas petri, a razón de 25 ml por caja (Foto 5). C. Aislamientos de S. rolfsii 1. En el medio de cultivo PDA Foto 4 Foto 5 Materiales Cámara de flujo laminar Tijeras Cajas petri de 60 y 100 mm Agua destilada estéril Hipoclorito de sodio al 2.5% Toallas de papel Mechero Marcador (punta de mediana a fina) Incubadora (a 24 C) 8-6
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii Medio de cultivo PDA Pinzas Muestra vegetal con síntomas Nota: Todos los procedimientos se deben realizar dentro de una cámara de flujo laminar; además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM). Foto 6 Pasos del proceso Paso 1 Cortar varios trozos del tejido infectado de la muestra utilizando una tijera estéril (Foto 6). Paso 2 Desinfectar, durante 3 minutos, los trozos de muestra en una caja petri de 60 mm que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2.5%. Foto 7 Paso 3 Lavar tres veces con agua destilada estéril los trozos desinfectados (Foto 7). Paso 4 Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel estériles durante 10 minutos para que se sequen (Foto 8). 8-7 Foto 8
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Foto 9 Paso 5 Una vez que los trozos estén secos, tomar los pedazos de tejido con una pinza estéril, sembrarlos (tres por caja) en cajas petri que contengan el medio de cultivo PDA (Foto 9). Incubar las cajas a 24 C durante 10 días, tiempo en que el hongo producirá micelio blanco (Foto 10), del cual saldrán más tarde esclerocios que pueden verse a simple vista como puntos negros (Foto 11); con el tiempo, estos esclerocios se tornarán de color café. 2. Aislamiento monomicelial Foto 10 El objetivo de este procedimiento es obtener una cepa del hongo genéticamente pura. Si el hongo se aísla de tejido vegetal con síntomas, éstos pueden ser producidos por varias cepas de un mismo hongo. Por eso es necesario purificar el hongo obtenido en el primer paso del aislamiento, empleando tejido de las puntas de algunas hifas. El procedimiento comprende los pasos siguientes: Paso 1 Con un sacabocado de aproximadamente 0.5 cm de diámetro, transferir el hongo que ha crecido en el medio de cultivo PDA (ver C., 1. En el medio, Paso 5) al centro de una caja petri que tenga el medio de cultivo PDA. Incubar a 24 C de 24 a 48 horas. Foto 11 8-8
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii Paso 2 Observar, durante este tiempo, el crecimiento del micelio bajo el estereoscopio en la cámara de flujo laminar. Enfocar los bordes de la colonia para identificar las puntas de las hifas. Paso 3 Cortar, con un alfiler flameado, un pedacito de agar que contenga la punta de una sola hifa, ejecutando luego las siguientes operaciones: Tener la precaución de no tocar otras hifas alrededor de la que se está aislando. Transferir el pedacito de agar con la hifa a una nueva caja petri que contenga medio de cultivo PDA; colocar solo una hifa en cada caja petri. Incubar estas cajas a 24 C durante 10 días. Después de este tiempo, el hongo producirá esclerocios, que se observan como puntos blancos pequeños; con el tiempo, éstos se tornan de color castaño o café y llegan a la madurez a los 25 días (Foto 12). Foto 12 Paso 4 Destapar, durante 3 días para que se sequen, las cajas petri que contienen estos esclerocios maduros (obtenidos partiendo del aislamiento monomicelial). Una vez secados, cosechar los esclerocios y almacenarlos a 20 C, ya sea en sobres de papel mantequilla o en tubos de vidrio cerrados. 8-9
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol D. Incremento de S. rolfsii En el laboratorio de Patología de Frijol se halló que la producción de esclerocios de S. rolfsii se favorecía cuando se suplementaba el medio de cultivo de agar con harina de frijol. Preparación del medio agar-harina de frijol (AHF) Materiales Agar granulado 15 g Agua destilada 1 litro Harina de frijol esterilizada 50 g Frascos erlenmeyer de 1 litro 4 Pasos del proceso Paso 1 Moler semillas de frijol que tengan una humedad menor que 14%, utilizando un molino o un mortero; el producto debe quedar molido, pero no muy finamente. Colocar luego esta harina en un recipiente cerrado y esterilizarlo en autoclave dos veces. Una vez esterilizada la harina, proceder con la preparación del medio AHF. Nota: Cada vez que se necesite harina de frijol para preparar el medio de cultivo, ésta debe obtenerse y esterilizarse un día antes de la preparación. 8-10
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii Paso 2 Mezclar muy bien el agar y la harina de frijol. Adicionar 1 litro de agua destilada a esa mezcla. Verter, en los frascos erlenmeyer de 1 litro, volúmenes de 250 ml de la mezcla líquida anterior. Colocar en la boca de cada frasco erlenmeyer un capuchón de gasa y ajustarlo con una banda de caucho; colocar papel aluminio sobre la gasa. Esterilizar los frascos erlenmeyer tapados en un autoclave. Cuando se enfríe la mezcla, vaciarla en cajas petri. Paso 3 Transferir un esclerocio almacenado (ver C., 2. Aislamiento monomicelial, Paso 4) empleando un alfiler flameado que lleve un pedacito de agar en la punta, y sembrarlo en el medio AHF contenido en una caja petri. Repetir este paso en varias cajas. El esclerocio da comienzo al crecimiento del hongo, el cual cubrirá todo el medio. A los 6 días de la siembra, se inicia la formación de los nuevos esclerocios; primero se observan pequeños puntos blancos que, con el paso del tiempo, se tornan de color castaño o café y alcanzan la madurez a los 25 días. Paso 4 Pasado este tiempo, destapar las cajas durante 3 días para que se sequen los esclerocios. Una vez secos, cosecharlos y almacenarlos en sobres de papel mantequilla o en tubos de vidrio, a 20 C. 8-11
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol E. Inoculación en el invernadero Preparación del inóculo de S. rolfsii en suelo Materiales Suelo Harina de frijol Agua destilada Bandejas autoclavables para preparar inóculo Papel aluminio y papel de envolver Esclerocios de S. rolfsii Pasos del proceso La preparación de inóculo de S. rolfsii, usando suelo como vehículo, comprende los siguientes pasos: Paso 1 Hacer una mezcla al 1% del suelo y la harina de frijol, así: 10 g de harina de frijol estéril por 1 kg de suelo. Homogenizar la mezcla manualmente agitándola dentro de una bolsa. Esparcir esta mezcla sobre la bandeja, de manera que forme una capa de 5 cm de profundidad (o menor) en la bandeja. Añadir enseguida 50 ml de agua destilada por kilogramo de suelo empleado en la bandeja. 8-12
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii Cubrir la bandeja con papel aluminio y luego con papel kraft (papel de envolver) y llevarlas al autoclave. Hacer bandejas de acuerdo a la cantidad de inóculo que se necesite. Paso 2 Dejar enfriar esta mezcla de suelo en la bandeja, una vez esterilizada en el autoclave. Pesar los esclerocios antes cosechados y almacenados (ver D. Incremento de..., Paso 4) y esparcirlos uniformemente sobre la superficie del suelo de cada bandeja, a razón de 0.2 g de esclerocios (200 mg) por kilogramo de suelo. Paso 3 Colocar las bandejas en el laboratorio a temperatura ambiente, y revisarlas semanalmente para comprobar que no se haya contaminado ese suelo inoculado. Pasados de 15 a 17 días, el hongo habrá crecido lo suficiente para colonizar con micelio el suelo y producir esclerocios. Este suelo (Foto 13) se empleará como inóculo en las pruebas de invernadero. Foto 13 8-13
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Inoculación Preparar en el invernadero el suelo para la siembra del modo siguiente: Foto 14 Mezclar suelo y arena en la proporción 2:1. Agregar a este suelo 5 g de harina de frijol estéril por cada kilogramo de suelo. Añadir a este suelo el suelo-inóculo al 3%, obtenido en el Paso 3 anterior (Foto 13); agregar, por tanto, 30 g de suelo-inóculo por cada kilogramo de suelo. En la Foto 14 observamos una bandeja de siembra de invernadero con una capacidad de 450 kg de suelo. A esta bandeja de siembra se le agregan 13.5 kg de suelo-inóculo obtenido en el Paso 3. Foto 15 La evaluación del germoplasma se realiza a los 7, 14, 21 y 28 días después de la siembra (Foto 15). Cuando el ensayo a que se somete el germoplasma requiere cantidades grandes de mezcla de suelo, se usa un mezclador o trompo eléctrico (Foto 16). Foto 16 8-14
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii F. Conservación de S. rolfsii para almacenamiento Este hongo se conserva en los esclerocios obtenidos en la etapa de incremento del hongo (ver D. Incremento de..., Paso 4), los cuales fueron almacenados a 20 C en sobres de papel mantequilla o en tubos de vidrio. G. Recuperación del hongo almacenado Para reactivar el crecimiento de S. rolfsii se toman varios esclerocios del aislamiento monomicelial que fueron almacenados a 20 C (ver C., 2. Aislamiento monomicelial, Paso 4) y se transfieren al medio de cultivo AHF, donde los esclerocios germinarán y se reiniciará el desarrollo del hongo (Foto 17). Foto 17 8-15