CATEDRA DE BIOQUIMICA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE AÑO 2007 Autores Dr. Gustavo Agolti. Profesor Adjunto por Concurso. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE Dr. Alexis Codutti. Jefe de Trabajos Prácticos Adscripto.Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE Sr. Carlos Alexis Vera. Ayudante alumno por concurso.cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE. Srta. Rocío M. Campos Collado. Ayudante Alumno por concurso.cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE. Dra. Nora C. Brandan. Jefa de Cátedra por concurso. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE 1
INDICE Bibliografía: ------------------------------------------------------------------- 33 CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DE MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE ----------------------------------------------------------4 GLOSARIO: ------------------------------------------------------------------ 30 INTRODUCCION: ------------------------------------------------------------2 ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS ------------- 29 OTRAS TECNICAS IMPORTANTES DE RECOMBINACION DEL DNA. ------------------------------------------------------------------------- 18 OTRAS TECNICAS RELEVANTES DE LA BIOLOGIA MOLECULAR ------------------------------------------------------------- 27 REVISIÓN DE LA ESTRUCTURA ADN / GEN: -----------------------3 SCREENING Y EXPRESION DE DNA EXTRAÑO EN CLONES BACTERIANOS: ---------------------------------------------------------- 12 2
TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE 1.INTRODUCCION: La habilidad para detectar y aislar genes normales y mutados, su secuencia y la expresión de sus productos proteicos ha tenido un importante impacto en la biología y la medicina. La tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y función de los genes, especialmente de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos. Estas investigaciones generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de los cuales tienen profundas implicancias éticas. La Tecnología del DNA recombinante se originó en los comienzos de 1970 con el descubrimiento de las endonucleasas de restricción, enzimas capaces de realizar el clivaje específico del DNA en fragmentos determinados. 2.REVISIÓN DE LA ESTRUCTURA ADN / GEN: El ácido desoxirribonucleico (DNA) está formado por dos cadenas polinucleótidicas antiparalelas (5' fosfato ÿÿ> 3' hidroxilo, 3' hidroxilo ÿÿ> 5' fosfato) unidas por puentes de hidrógeno entre los pares de bases (pb) complementarias damp - dtmp y dcmp - dgmp. Los genes son hileras lineales de pares de bases de DNA y son usualmente transcriptos en moléculas de ácido ribonucleico (RNA) de cadena única. El cromosoma es una hilera lineal (circular en bacteria) de genes y el genoma es el complemento haploide de DNA en la célula. 3
Una célula bacteriana (por ejemplo Escherichia coli) contiene un cromosoma (haploide) con 3 x 10 6 pb y cerca de 2.000 genes. Una célula humana contiene 46 cromosomas (diploide, 23 pares haploides) con cerca de 3 x 10 9 pb (tamaño del genoma haploide) y cerca de 50.000 genes. Debido al azar estadístico en la secuencia de DNA, cada 4 4 (256) pb o 4 6 (4096) pb se incluirán en el promedio, por ejemplo, las secuencias únicas que se encuentran a continuación (o alguna otra secuencia de 4 o 6 pb). G A T C G A A T T C O C T A G C T T A A G Por convención, la cadena superior en una secuencia de DNA de doble cadena se lee 5' fosfato a 3' hidroxilo y la cadena inferior se lee 3' hidroxilo a 5' fosfato. Las dos secuencias de doble cadena ilustradas se denominan Palíndromes ya que se leen exactamente igual en ambas cadenas en la dirección 5' a 3'. Figura 1: Secuencia de doble cadena denominada Palíndrome. 4
3.CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DE MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE: 3.1. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: Las enzimas de restricción son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma específica puentes fosfodiéster 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de DNA. Las enzimas de restricción reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens. Las tres primeras letras en el nombre de la enzima, corresponden la primera al genero (E) y las otras dos a la especie (co). Éstas pueden ir seguidas por la designación de una cepa ( R) y un número romano (I) para indicar el orden del descubrimiento. El tipo más común de enzimas de restricción (tipo II) usado en la tecnología del DNA recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energía para el clivaje del puente. Requiere en cambio iones Mg ++ para la unión específica al DNA y posterior clivaje. Otras enzimas de restricción clivan palíndromos de DNA de 4 o 6 pb. Algunas otras enzimas de restricción clivan una secuencia única. Estas enzimas que reconocen la misma secuencia se llaman ISOCHIZOMERS. Las enzimas de restricción de tipo OO son parte de un sistema de restricción / modificación en la bacteria. La misma tiene un sistema de protección contra sus propias enzimas de restricción a través de una enzima acompañante que metila nucleótidos de su ADN y los convierte en un sustrato inadecuado para ser digerido en las secuencias de 5
reconocimiento. Por esto es que las ADN metilasas de sitio específico y las enzimas de restricción siempre están por pares en una bacteria. En el palíndrome de 6 pb ilustrado antes, la enzima de restricción EcoRI (una enzima aislada de E. coli) cliva el puente fosfodiéster entre G y A en ambas cadenas para producir dos fragmentos asimétricos con el extremo 5' fosfato que sobresale del extremo 3' hidroxilo. Figura 2 : Clivaje de la enzima de restricción de EcoRI entre G y A. Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos o adherentes son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarias entre sí. Los extremos cohesivos o adherentes son particularmente útiles en la construcción de moléculas de ADN híbridas o quiméricas. Por otro lado, los extremos romos son generados 6
cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena. cohesivos o romos. Figura 3: Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos En promedio, un genoma de la bacteria E. coli tendría alrededor de 800 sitios de clivaje de EcoRI y el genoma humano tendría alrededor de 800.000 sitios de clivaje de EcoRI. Los fragmentos de DNA generados por digestión con enzimas de restricción pueden ser determinados por electroforesis en gel de agarosa. Este método toma en cuenta la porosidad del agar, símil agarosa a través del cual pequeños fragmentos de DNA migran más rápido que los fragmentos de mayor tamaño en presencia de una solución buffer y un campo eléctrico. 3.2.DNA LIGASA. La DNA ligasa es una enzima que cataliza la formación de puentes fosfodiéster entre los extremos adyacentes 3' OH y 5' fosfato en el DNA. Para la actividad la enzima 7
requiere Mg ++ y una unión covalente, derivada del ATP en el caso de la DNA ligasa del bacteriófago T4. La enzima T4 puede unir covalentemente moléculas de DNA con extremos cohesivos compatibles (por ejemplo, unión de hidrógeno del extremo más largo 5' de EcoRI digiriendo fragmentos de DNA) y también fragmentos de DNA con extremos sin punta. El uso en la digestión / restricción del DNA seguido por unión covalente de extremos cohesivos de diferentes fragmentos de DNA forma la base de la enzimología del DNA recombinante. Figura 4: Acción de la DNA ligasa. 3.3. PLÁSMIDOS Y CLONACIÓN DE DNA EXTRAÑO. Los plásmidos son pequeñas moléculas de DNA (de 5.000 pb aproximadamente) que se replican en forma autónoma en células bacterianas. 8
Son círculos covalentemente cerrados de DNA de doble cadena. La mayoría de los plásmidos contienen genes resistentes a antibióticos, los que permiten el crecimiento de células bacterianas refugiando a los plásmidos bajo condiciones selectivas. Los ejemplos de genes resistentes a antibióticos son los que codifican para la ß lactamasa o neomicina fosfotransferasa, enzimas que inactivan ampicilina o aminoglucósidos respectivamente. Figura 5: Genes resistentes a antibióticos. Sitios de replicación importantes PstI, EcoRI, BamHI, SalI, PvuII. Origen de replicación (ori). Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. Debido a su tamaño relativamente pequeño, los plásmidos contienen solo algunos únicos sitios de clivaje de enzimas de restricción. Luego de la digestión de un plásmido en un único sitio de restricción el plásmido circular se vuelve lineal. Se puede crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso consta de las siguientes etapas: 9
1. Se corta el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos. 2. Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurándose que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse. 3. Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima ADNligasa y luego se introduce el plásmido inserto en bacterias. 4. Se selecciona las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán. Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación. Figura 6: Clonación de DNA. 10
La unión por la DNA ligasa forma una molécula de DNA recombinante con una estructura covalentemente cerrada. Una molécula recombinante circular puede ingresar a la célula bacteriana, replicarse y por virtud el gen del plásmido con resistencia a antibióticos, transformar la célula normal sensitiva a una que crecerá en presencia de antibióticos. Si la unión es realizada en un tubo de prueba con millones de moléculas plásmidas digeridas por EcoRI y millones de fragmentos de DNA extraño único con extremos cohesivos (por ejemplo genoma humano digerido con EcoRI) son formadas millones de moléculas de DNA recombinante, cada una conteniendo el mismo DNA vector plásmido pero con un fragmento único (gen en algunos casos) de DNA humano. Cuando células bacterianas receptoras son transformadas con esta mezcla y colocadas en placas de agar conteniendo el antibiótico apropiado, solo una célula conteniendo un plásmido crecerá y formará una colonia visible conteniendo millones de bacterias, todas con el idéntico plásmido vector y el DNA extraño inserto (clones). De un pequeño número de placas de agar es posible tener suficientes clones bacterianos individuales, así cada gen en el genoma humano es clonado en una colonia bacteriana única. Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos, virus como el fago lambda, cromosomas creados de forma artificial y quimeras (DNA quimérico). Para clonar genes específicos se puede preparar una biblioteca genómica que consiste en una colección de fragmentos de DNA genómicos, clonados en vectores (plásmidos, bacteriófagos o cósmidos), que representan el genoma entero del organismo. Otra alternativa son las bibliotecas de cdna (DNA complementario) que representan la colección completa de los mrna que se sintetizan en un momento en una célula dada. El DNA extraño clonado que está en esta biblioteca son moléculas de DNA de doble cadena sintetizadas por la enzima transcriptasa inversa a partir de la población de RNA mensajeros, moldes encontrados en un tejido específico. Así una biblioteca cdna contiene regiones clonadas codificantes para todas las proteínas expresadas en un tejido particular y variará de tejido en tejido. 11
El DNA clonado no contendrá intrones (a diferencia del DNA genómico) y por consiguiente permite la expresión directa del RNAm transcripto a proteína in Vitro o en bacteria. Figura 7: Biblioteca de cdna. 12
4.SCREENING Y EXPRESION DE DNA EXTRAÑO EN CLONES BACTERIANOS: 4.1.BANCOS DE SCREENING DE CLONES. Tratando de escoger una colonia específica abrigando un gen específico o cdna inserto en un plásmido fuera de varios millones presentes en un banco de clones es semejante a la búsqueda proverbial para la aguja en un pajar. Es necesario conocer algo acerca del fragmento de DNA a ser aislado. En la mayoría de los casos esto involucra tener la secuencia de DNA de un gen evolutivamente relacionado conociendo la secuencia proteica codificada por el gen a ser aislado, o teniendo un anticuerpo específico contra esta proteína. El screening es a menudo realizado por hibridación selectiva con una indagación de DNA (DNA probe). La hibridación se refiere al proceso por el que bases apareadas o fortalecidas ocurre entre cadenas complementarias de una sola hebra de DNA. La indagación puede ser un fragmento de DNA o varios cientos de pares de bases o con más homología al gen a ser aislado. También una indagación pequeña de hebra única de DNA puede hacerse sintéticamente, el que hibridará con el código genético por una secuencia aminoacídica conocida. Luego de transferir de una biblioteca de colonias bacterianas de una o más placas de Petri a un papel de filtro o de nylon, el resto bacteriano es removido dejando el DNA celular y el plásmido unidos al filtro en precisamente la misma posición como la colonia bacteriana original (una réplica de la placa bacteriana es retenida). El DNA en el filtro es luego desnaturalizado e hibridizado con una indagación del DNA alterado marcado radiactivamente. Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. Las moléculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en 13
el filtro y su visualización se realiza por medio de auto-radiografía, técnica en la cual primero, cada filtro es cubierto con una película fotográfica y dejado en la oscuridad. Durante el período de exposición, el radioisótopo libera energía que impacta la emulsión fotográfica. Luego del revelado de la película, la posición del fragmento radiactivo se observa como una marca oscura, producida por un depósito de plata de la emulsión. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento, identifican las colonias originales que contenían vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar. El DNA plásmido conteniendo el gen de interés es luego purificado de la colonia bacteriana original. Un ácido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adición de fosfato radioactivo (fósforo 32) durante su síntesis. Así, si se añade fosfato radioactivo al medio de cultivo cuando está teniendo lugar la síntesis de DNA, el nuevo DNA será radioactivo. 32 P 3- -------> 32 P-nucleótido -------> 32 P-ácido nucleico Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato. El enzima polinucleótido quinasa quita específicamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5' del DNA. DNA 32 P-P-P-adenosina + HO-desoxiribosa-DNA -------> ADP + 32 P-O-desoxiribosa- Esta técnica es extremadamente útil y rápida ya que permite el marcaje de moléculas de DNA ya preformadas. Las bibliotecas de genes de screening también pueden ser determinadas usando un anticuerpo específico que reconocerá y unirá a la proteína del gen a ser aislado. El anticuerpo puede ser contra la proteína entera o dirigida contra un péptido sintético derivado de la secuencia primaria de la proteína. El anticuerpo puede ser marcado radiactiva o enzimáticamente y usado para filtrar bancos de clones bacterianos en los que los genes extraños han sido clonados en un plásmido de expresión especial. En este plásmido el gen 14
inserto es transcripto a RNAm y traducido a proteína por la RNA polimerasa y ribosomas bacterianos. Las colonias bacterianas en el papel de filtro son lisadas, así la proteína expresada en una colonia específica puede ser detectada por el anticuerpo. Se han desarrollado nuevos métodos de marcaje de ácidos nucleicos que usan compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse o bien porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y por tanto pueden detectarse por auto radiografía). Figura 8: Identificación de un clon con el fragmento de DNA deseado. 15
En los últimos años, se ha desarrollado una técnica que promete generar un salto cualitativo en los estudios de la expresión genética. Se trata de los micro-arreglos o chips de DNA que permiten monitorear la expresión de un genoma en forma integrada y en un tiempo récord. La base de la técnica es simplemente la hibridación de secuencias complementarias de ácidos nucleicos a una escala microscópica. Este altísimo nivel de miniaturización permite que la cantidad de sonda requerida sea mínima. Con el empleo de diferentes "etiquetas" fluorescentes se pueden comparar los patrones de hibridación de dos tipos celulares cualesquiera encontrando rápidamente aquellos genes que poseen un patrón de expresión diferencial. De este modo es posible detectar genes específicamente activados en células que han sufrido algún tipo de diferenciación, como células de diferentes tejidos, tumorales, sometidas a ciertos tratamientos, etc. Los microchips proveen una revolucionaria herramienta para explorar la expresión génica y el análisis de secuencias tanto en la investigación básica como aplicada. 4.2. EXPRESION DE GENES EXTRAÑOS EN SISTEMAS HETEROLOGOS. La habilidad de expresar genes extraños en bacterias, levadura o células mamíferas es importante en el screening de productos génicos deseados y también para producir grandes cantidades de proteínas recombinadas de importancia médica. Estas incluyen a la insulina humana, la obtención de nuevas vacunas, interferones, hormona humana de crecimiento, factores estimulantes de colonias, eritropoyetina, factores de la coagulación (estreptoquinasas, activador del plasminógeno de tejido) la clonación de animales y muchos más. Como la bacteria no puede procesar el RNA transcripto de genes separados (que contiene intrones) ellos solo pueden expresar cdna que codifica directamente para una secuencia proteica. 16
El cdna es inserto en un plásmido bacteriano entre señales para la iniciación correcta (promotor) y la terminación de la transcripción por la RNA polimerasa bacteriana. También, una secuencia para la iniciación de la traducción (secuencia SHINE - DELGARNO) por ribosomas bacterianos es necesaria corriente abajo del promotor. Puede ser importante regular la transcripción de cdna extraño en E. coli por ejemplo, usando la región promotor / operador del operón lac. La proteína expresada puede ser también trabajada con ingeniería genética para ser secretada fuera de la célula bacteriana si una secuencia señal es agregada al extremo N de la proteína. Un gen para somatostatina sintetizado artificialmente se fusiona con el gen para la beta-galactosidasa de un plásmido bacteriano. Introducido en E. coli, este plásmido dirige la síntesis de una proteína híbrida, que comienza como betagalactosidasa, pero termina como somatostatina. Figura 9: Proyecto de la Somatostatina 17
Una proteína humana expresada y aislada de bacteria es insulina. Normalmente en células pancreáticas la insulina es sintetizada como un precursor (preproinsulina que contiene una secuencia líder y otras regiones polipeptídicas que son clivadas dejando las cadenas A - B unidas por puente disulfuro. La síntesis de la proteína recombinada en E. coli involucra la expresión y purificación de las cadenas A y B en forma independiente seguido por una reensamblaje de la proteína activa A-B. La expresión y el screening génico pueden también ser realizado en células mamíferas en cultivo. El cdna eucariótico o DNA genómico puede ser clonado en plásmidos de expresión que funcionan en células eucariotas. Tales plásmidos deben contener transcripción eucariótica, procesamiento del RNA y regiones reguladoras de la transcripción. La transferencia de DNA exógeno a células eucariotas se denomina transfección de DNA. 5.OTRAS TECNICAS IMPORTANTES DE RECOMBINACION DEL DNA. 5.1.SECUENCIAMIENTO DEL DNA. La habilidad para secuenciar grandes fragmentos de DNA ha evolucionado la biología. En los Estados Unidos se investigará en los próximos veinte años para lograr el mapeo y secuenciamiento de las 3 x 10 9 pb del genoma humano. Existen dos metodologías básicas para secuenciar el DNA: (1) Método de Maxam- Gilbert: degradación química de fragmentos de DNA y (2) Método enzimático de Sanger o dideoxi: reacciones de terminación de cadenas durante la síntesis de DNA dirigida por moldes. Los fragmentos de DNA a ser secuenciados son clonados en el genoma de bacteriófago que 18
existe como una molécula de DNA de doble cadena durante la replicación, sino es una cadena única. El fago de DNA de cadena única contiene una de las cadenas del DNA extraño a ser secuenciado, y es sometido a una síntesis de DNA in Vitro usando la DNA polimerasa y un oligonucleótido sintético específico como molde de hibridación que une el molde del bacteriófago corriente arriba del DNA extraño insertado. La síntesis in Vitro del DNA es realizada en cuatro recipientes separados de reacción, cada uno conteniendo 4 dntps (uno marcado radiactivamente) más una pequeña cantidad de solo un dideoxinucleótido (ddgtp - ddatp - ddctp o ddttp). El deoxinucleótido contiene un azúcar 2'H y 3'OH y el dideoxinucleótido contiene hidrógenos en posiciones 2' y 3'. Una vez que son incorporados a la cadena de DNA en crecimiento durante la síntesis 5' fosfato se agrega a 3' OH, termina la síntesis de la cadena porque bloquean el 3'OH requerido para la adición del próximo 5' fosfato dntp. Debido a que los dideoxinucleótidos están presentes en pequeñas concentraciones en relación a los dntps en reacciones individuales, la terminación de la cadena es al azar y resulta en un amplio rango de tamaños de cadenas nuevas sintetizadas (20 a 1.000b). Como la electroforesis en gel de acrilamida es capaz de determinar las cadenas individuales que difieren en una base, las cuatro mezclas de reacción son sometidas a electroforesis a través de acrilamida polimerizada en caminos adyacentes. Luego el gel es expuesto a una película de rayos X donde los productos de terminación de la cadena radiactiva se revelan como bandas de diferente movilidad electroforética. La secuencia nueva sintetizada es leída en incrementos de una base a través de cuatro caminos de reacción (ddg, dda, ddt, ddc) de arriba a abajo la dirección 5' a 3'. dirección 3' a 5'. El complemento de esta secuencia será la secuencia del molde de DNA extraño en 19
Figura 10: Determinación de la secuencia exacta de un ácido nucleico. Hebra de DNA marcada en su extremo 5` con 32P. En la secuenciación por el método enzimático, se procede en varias etapas. En una primera etapa, el oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en 4 tubos, cada uno de los cuales contiene, además, uno de los nucleótidos terminadores (ddatp, ddctp, ddgtp o ddttp). Estos son dideoxinucleótidos que carecen del OH- en la posición 3', por lo que, una vez que son agregados a la cadena que se está sintetizando, no pueden reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman, así, en el último nucleótido de la cadena. En una segunda etapa, los productos de reacción son sembrados en la parte superior de un gel, en "calles" separadas. Luego de la corrida electroforética, se realiza la autorradiografía del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original. Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de nucleótidos incógnita de la siguiente manera: por ejemplo, el fragmento de un solo nucleótido que se ubica en la primera posición en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucléotido de la secuencia contiene, como base nitrogenada, una guanina. 20
Figura 11: Método enzimático de Sanger. Secuenciación de DNA. 5.2. POLIMORFISMO DE EXTENSION DE FRAGMENTO DE RESTRICCION. Excepto en gemelos idénticos, existen cantidades significantes de variación de la secuencia de DNA entre individuos. Genes idénticos en individuos diferentes (no limitado a humanos) pueden diferir en extensión en el mismo sitio de clivaje de la enzima de restricción. Este fenómeno se llama polimorfismo de extensión de fragmento de restricción (RFLP). Esto puede deberse a cambios de bases de nucleótidos (mutaciones puntuales, adiciones, deleciones) causantes de la pérdida de un sitio de restricción existente o ganancia de uno nuevo o debido a la presencia de un número variable de repeticiones en tandem (VNTRs, elementos pequeños repetitivos del DNA) entre dos sitios de restricción. 21
El significado funcional de RFLP no se conoce aunque diferencias en conjunto en la estructura del DNA pueden tener efectos patológicos (por ejemplo translocaciones de genes). Varios cientos de RFLP humano han sido identificados y existen muchos más. Debido a que los RFLP autosómicos son heredados en forma mendeliana (un alelo por cada padre), los genes responsables de la mayoría de las enfermedades genéticas, por ejemplo, fibrosis quística, pueden ser identificados y ubicados en familias afectadas utilizando el análisis de RFLP. Este proceso también es referido como genética reversa porque un gen específico es aislado en ausencia de una proteína conocida o función. El análisis de RFLP experimentalmente es realizado por aislamiento de DNA genómico de tejido, digestión del DNA con diferentes enzimas de restricción y luego electroforesis del DNA a través de gel de agarosa. Las bandas de DNA son transferidas por acción capilar en papel de nitrocelulosa, preservando el modelo de migración de gel (los fragmentos pequeños pasan antes que los fragmentos de mayor tamaño). Esta transferencia de DNA del gel al papel se conoce como SOUTHERN BLOTTING o SOUTHERN TRANSFER. 22
de DNA. Figura 12: Método de transferencia Southern aplicado a la determinación de la huella dactilar La transferencia de RNA o proteína del gel al papel se denomina NORTHERN o WESTERN BLOTT respectivamente. El DNA en el Southern blott es desnaturalizado y luego hibridizado con diferentes PROBES, conteniendo secuencias de DNA única o repetitiva. Las PROBES de DNA son marcadas isotípicamente o con un substrato no radioactivo que es identificado posteriormente en forma enzimática. 23
Los fragmentos de longitud variable en diferentes individuos generados por la misma enzima de restricción se observará si un RFLP está presente. La identificación del gen responsable de una enfermedad genética comienza con la detección de un fragmento único de RFLP o fragmentos que tiene el mismo modelo familiar de herencia así como la enfermedad. Este método ha sido usado para identificar positivamente los genes aberrantes responsables de la fibrosis quística y distrofia muscular entre otras. También se usa RFLP en medicina forense. La evidencia biológica hallada en la escena del crimen (sangre, piel, cabello) es fuente de DNA que puede ser sometida al análisis de RFLP. Como dos individuos no tienen modelos de RFLP idénticos (huellas dactilares del DNA) a loci genéticos múltiples (excepto en gemelos idénticos), el DNA de la víctima o sospechoso (obtenido de una muestra de sangre) pueden ser identificados y comparados. 5.3.REACCION DE LAS CADENAS DE POLIMERASA. La reacción de las cadenas de polimerasa (PCR) se desarrolló a mediados de los años 80 para amplificar concentraciones de ácido nucleico. Tiene especial significado en clonación de genes y diagnóstico médico. La clonación acelular o amplificación del ADN es un tipo de clonación de moléculas de ADN o ARN sin la intervención de una célula. Mediante esta técnica se amplifica un gen o fragmento de ADN, es decir, que se produce un gran número de copias. También puede realizarse una amplificación de ARN utilizando un ADN complementario de ARN. Para este proceso se necesita la acción de la enzima transcriptasa inversa. La amplificación se hace por la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (Polimerase Chaine Reaction). Las aplicaciones de esta técnica son, por ejemplo, la 24
clonación de ADN, la detección de secuencias sin purificar, la búsqueda de mutaciones, el diagnóstico de enfermedades, estudios evolutivos, resolución de problemas forenses, etc. El método es sencillo, fiable y rápido. Para que se produzca la amplificación, en la mezcla de reacción deben encontrarse los siguientes componentes: Fragmento de ADN que se desea amplificar. Puede provenir de distintos órganos, o de extracto de tejidos, o de sangre, o de mezcla de distintos fragmentos de ADN, etc. Los cuatro tipos de desoxirribonucleótidos. Dos oligonucleótidos de cadena sencilla que actuarán como cebadores. Una ADN-polimerasa termoestable, ya que debe actuar a altas temperaturas (unos 75º C) y debe mantener su estructura estable a temperaturas de 95º C. La amplificación dura unas dos horas y es un proceso cíclico ( de 20 a 40 ciclos). Cada ciclo dura entre un minuto y medio y cinco minutos. Cuantos más ciclos se realicen, más se amplificará el ADN. Cada ciclo consta de tres etapas que son: Desnaturalización: consiste en separar las dos hebras de ADN. Para ello, esta etapa se realiza a una temperatura superior a la temperatura de fusión. Es una fase corta, que dura entre 30 y 120 segundos. Hibridación o templado: se induce a un enfriamiento brusco de la mezcla, lo que genera la unión de los cebadores con las hebras de ADN. Esta fase dura entre 10 y 120 segundos y se realiza a una temperatura entre 37 y 65º C. Los extremos 3'-OH de los oligonucleótidos híbridos sirven como moldes para la síntesis de DNA por una DNA polimerasa termoestable, resultando la síntesis de dos fragmentos hijos. Replicación o elongación o polimerización: es la fase en la que el ADN se amplifica. Dura entre uno y tres segundos, a una temperatura de unos 75º C. La replicación de esa secuencia se realiza en sentido 5' 3'. Termina cuando lee toda la hebra molde, o hasta que empieza el siguiente ciclo. Por ejemplo, 20 ciclos resultarán en una amplificación de un millón de veces. Y 30 ciclos resultarán en una amplificación de un billón. 25
sangre. El PCR puede amplificar e identificar el virus de SIDA simple en un mililitro de Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se encuentran la detección precoz o prenatal de enfermedades genéticas, la detección de infecciones virales latentes o la producción de grandes cantidades de fragmentos de DNA humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros métodos. Esta técnica también se aplica para estudios de identidad y filiación. Figura 13: a). La mezcla de reacción contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (P1 y P2) que servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato -datp, dgtp, dctp y dttp-. b). b. La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación y una de elongación-. c). La hibridación-. d). La elongación. 26
6.OTRAS TECNICAS RELEVANTES DE LA BIOLOGIA MOLECULAR. En la técnica del Southern blott el DNA es sometido a electroforesis y luego transferido al papel o nylon. RNA y proteínas pueden ser analizados en forma similar. La electroforesis del RNA por agarosa o acrilamida seguida de transferencia al papel o nylon se llama NORTHERN TRANSFER. El RNA transferido puede ser detectado por hibridación con una PROBE radioactiva. células o tejidos. El NORTHERN BLOTT revela el modelo de expresión génica a nivel de RNA en La electroforesis de proteínas desnaturalizadas por acrilamida seguida por transferencia al papel se llama WESTERN BLOTTING. La proteína transferida puede ser detectada más fácilmente por métodos inmunológicos. Por ejemplo, un anticuerpo de conejo específico puede unirse a su antígeno proteico en el papel. Otro anticuerpo (anti-conejo) conjugado con una enzima (fosfatasa alcalina) luego pueden unirse al anticuerpo original del conejo en el papel. Cuando el papel es humedecido en una coloración un precipitado oscuro se depositará sobre la banda del antígeno. El Western Blott se usa para detectar la presencia de antígenos HIV o anticuerpos para HIV en suero humano así como otros agentes virales. La hibridación in situ es un proceso por el cual las PROBES de ácidos nucleicos se hibridan a ácidos nucleicos complementarios dentro de células fijas y cortes de tejidos (in situ). Esto permite localizar secuencias específicas de DNA o RNA en células y tejidos mediante el uso de sondas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, localizar una determinada secuencia en un cromosoma. Las sondas, que también pueden ser marcadas con un colorante fluorescente, son hibridizadas a los cromosomas, expuestos previamente a un alto ph que rompe las uniones puentes de hidrógeno y separa las dos cadenas de DNA. 27
El método de hibridación in situ también puede ser usado para detectar la presencia de moléculas de RNA específicas en células de distintos tejidos e indicar, de esta manera la expresión diferencial de genes en esos tejidos. En la hibridación in situ, las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes. Cada color indica la localización de una secuencia de DNA diferente: rojo, localización en el cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil mas común; verde, región del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Síndrome de Down; blanco, un oncogen en el cromosoma 8; violeta, un gen que codifica una proteína de membrana de los glóbulos blancos; amarillo, una secuencia sin determinar en el cromosoma 5. Este método puede usarse con propósitos diagnósticos usando ácidos nucleicos virales, genes alterados u oncogenes. Figura 14: Hibridación de ácidos nucleicos. 28
7.ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS. Los organismos genéticamente modificados se crean introduciendo uno o más genes, pertenecientes a otros seres, o quitando uno o más genes, pertenecientes al organismo. Estos organismos son conocidos vulgarmente con el sobrenombre de transgénicos. Sin embargo, organismo transgénico es una clase específica de organismo genéticamente modificado. Los organismos transgénicos están genéticamente modificados, pero con genes pertenecientes a otros organismos muy distintos a ellos (distinta especie). Por ejemplo, un organismo genéticamente modificado podría ser una rata con genes de otra rata. Un organismo transgénico sería una merluza modificada con genes de un salmón. Los organismos genéticamente modificados han sido desarrollados para facilitar la mejora animal y vegetal, ya que acortan los tiempos de espera en la depuración de la especie por selección de individuos. También, se ha investigado en su desarrollo con otro fin distinto, el de crear organismos que, de otro modo no se formarían en la Naturaleza, como por ejemplo permitir la incorporación de ADN de otra especie. Las aplicaciones de los organismos genéticamente modificados son muy variadas. Se pueden destacar las siguientes: En investigación: para el estudio de la expresión de genes y la creación de genotecas. En medicina: para la obtención de fármacos o proteínas cuya síntesis es difícil conseguir "in Vitro". También, para la obtención de tejidos u órganos, o la reparación de anomalías genéticas en humanos. En agricultura y ganadería: para la mejora (no de forma tradicional) de plantas y animales. En la industria alimenticia: para la mejora de procesos biotecnológicos de elaboración de alimentos (pan, vino, cerveza, yogur, etc.) y para la creación de alimentos nuevos. 29
La creación y utilización de organismos genéticamente modificados tiene muchas trabas legales, debido al rechazo social existente. Los alimentos manufacturados a partir de este tipo de organismos sólo se aceptan para el consumo humano si no queda proteína o ADN del organismo genéticamente modificado. Si esto no se cumple, debe ponerlo en la etiqueta. Por ejemplo, en la fabricación del pan utilizamos levadura. Cuando el pan se cuece la levadura queda destruida. Esa levadura destruida puede ser natural o genéticamente modificada, pero nunca lo sabremos. 30
8.GLOSARIO: ANTICODON: triplete de nucleótidos en el RNAt que interacciona por apareamiento de bases complementarias al codón del RNAm durante la traducción. ANTIPARALELAS: cadenas del DNA en las que el sentido de cada una de ellas es opuesto al de la otra (5'-3' 3'-5'). CAP: estructura en el extremo 5' del RNAm que consiste en la 7' metilguanosina-pppx, donde X es el primer nucleótido codificado en el DNA. cdna: DNA copia de una RNA por transcripción inversa. CISTRON: fragmento de un gen que codifica un determinado polipéptido. CLON: población celular proveniente de una sola célula. CLONADO: procedimiento por el cual se obtiene una población celular (clon) a partir de una célula). Cuando esta célula es portadora de un plásmido híbrido se define como clonado molecular a la obtención del gen amplificado del que es portador ese plásmido. CODON: secuencia de tres nucleótidos que codifica un aminoácido o señal de terminación. CODON DE INICIACION: codón AUG (o GUG) que codifica el primer aminoácido en una secuencia proteica: la formilmetionina en bacterias y metionina en eucariotas. CODON DE TERMINACION: codón de secuencia UAA, UAG o UGA que codifica para la conclusión de una cadena polipeptídica. El codón UAG se denomina ámbar y el codón UAA: ocre. CÓSMIDO: son vectores sintéticos que combinan características del fago lambda (que tienen los extremos cohesivos o regiones COS) con propiedades de los plásmidos. CROSSING-OVER: proceso por el cual dos cromosomas se aparean a través de zonas de homología e intercambian material genético por recombinación. 31
EXON: porción de un gen intercalada entre intrones que codifica secuencias del RNAm maduro. EXTREMOS COHESIVOS: extremos de las moléculas de DNA de doble cadena constituidos por cadenas únicas complementarias y que por ello pueden aparearse y producir moléculas circulares. GEN: secuencia en el DNA que codifica un producto determinado, RNA o proteínas. GEN ESTRUCTURAL: gen que codifica la estructura primaria de un polipéptido o la secuencia de bases de un RNA. GEN REGULADOR: gen cuyo producto regula la expresión de otros genes. GENOMA: conjunto de genes de un organismo. HIBRIDACION: procedimiento por el cual dos muestras de DNA desnaturalizadas de distinto origen y una de ellas radioactiva, son re naturalizadas para formar moléculas híbridas con cadenas de ambos orígenes. INTRON: segmento de un gen intercalado entre exones que no participa en la codificación de secuencias de RNA maduro. LINKER: segmento corto de DNA de doble cadena portador de la secuencia de reconocimiento de una nucleasa de restricción. NTP: nucleósido trifosfato. OPERON: unidad genética que especifica uno o varios polipéptidos. Consta de un operador que regula la transcripción del operón, de un promotor donde se inicia la transcripción del gen o los genes estructurales que codifican al polipéptido o los polipéptidos, y de un terminador donde concluye la transcripción. PALINDROME: parte de la cadena de DNA que presenta auto homología por la presencia de dos secuencias repetidas e invertidas. POLI A: secuencia de poliadenilato en el extremo 3' de los RNAm eucariontes. 32
PRIBNOW BOX: caja TATA. PRIMER: molde. Molécula de DNA o RNA que sirve como inicio en el proceso de síntesis de ácidos nucleicos. PROBE: terminología que designa a una molécula específica de DNA, RNA, marcada radio activamente y que se utiliza para determinar la presencia de secuencias homólogas en muestras de DNA, RNA separados por electroforesis en gel o presentes en colonias bacterianas. PROMOTOR: zona al comienzo de un gen donde se inicia la transcripción. QUIMERA: es el ADN recombinante obtenido artificialmente mediante técnicas de manipulación de ácidos nucleicos, el cual se incluye en una cadena de ADN cromosómico o ADN plasmídico, uno o varios genes de interés. RECOMBINACION: transferencia de segmentos entre dos moléculas de DNA que se han apareado por homología de bases. REPLICACION: síntesis de DNA que utiliza un primer (molde) de DNA. RESTRICCION: corte de una molécula de DNA por enzimas denominadas endonucleasas de restricción que reconocen secuencias específicas. RNA: ácido ribonucleico. RNAm: ácido ribonucleico mensajero. RNAr: ácido ribonucleico ribosomal. RNAt: ácido ribonucleico de transferencia. SEUDOGEN: repetición no funcional de un gen y carente de intrones. SPLICING: terminología que significa eliminación de intrones en una molécula de RNA. TRADUCCION: proceso por el que el código genético contenido en una secuencia de nucleótidos del RNAm es expresada en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. 33
9.Bibliografía: Bioquímica de Harper. Murray.Mayes. Granner. Rodwell. 15º Edición. 1.999.- 9.1.Links Http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos5.htm Http://es.wikipedia.org/wiki/ADN_recombinante Http://aportes.educ.ar/biología/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnología-deladn-recombinante/como_amplificar_el_adn_reaccio.php http://nostoc.usal.es/sefin/mi/tem11mi.html www.educa.aragob.es/iescarin/depart/biogeo/varios/biologiacurtis/seccion%203/3 %20-%20Capitulo%2016.htm nante.pdf www.personales.ulpgc.es/ecastro.dbbf/descargas/transparencias/dna%20recombi http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html 34