Trabajo Práctico Nº 13 Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento) Introducción: El desarrollo normal de una planta depende de la interacción de factores externos: luz, nutrientes, agua y temperatura, entre otros, e internos: reguladores de crecimiento, también llamados hormonas vegetales. Las hormonas vegetales se han definido como compuestos naturales que poseen la propiedad de regular procesos fisiológicos muy por debajo de la de otros compuestos (nutrientes, vitaminas) y que en dosis más altas los afectan. Regulan procesos de correlación, es decir que, recibido el estímulo en un órgano, lo amplifican, traducen y generan una respuesta en otra parte de la planta. Interactúan entre ellas por distintos mecanismos: Sinergismo: la acción de una determinada sustancia se ve favorecida por la presencia de otra. Antagonismo: la presencia de una sustancia evita la acción de otra. Balance cuantitativo: la acción de una determinada sustancia depende de la concentración de otra. Características que las diferencian de las hormonas animales ejercen efectos pleiotrópicos, actuando en numerosos procesos fisiológicos su síntesis no se relaciona con una glándula, sino que están presentes en casi todas las células y existe una variación cuali y cuantitativa según los órganos. Las fitohormonas pueden promover o inhibir determinados procesos: - Dentro de las que promueven una respuesta existen 4 grupos principales de compuestos que ocurren en forma natural, cada uno de los cuales exhibe fuertes propiedades de regulación del crecimiento en plantas. Se incluyen grupos principales: auxinas, giberelinas, citocininas y etileno. - Dentro de las que inhiben: el ácido abscísico, los inhibidores, morfactinas y retardantes del crecimiento, Cada uno con su estructura particular y activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta. TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 1
Mientras que cada fitohormona ha sido implicada en un arreglo relativamente diverso de papeles fisiológicos dentro de las plantas y secciones cortadas de éstas, el mecanismo preciso a través del cual funcionan la mayoría de ellas, no es aún conocido totalmente TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 2
Auxinas El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de compuestos que estimulan la elongación de las células. El ácido indolacético (AIA) es la forma natural predominante, actualmente se sabe que también son naturales: IBA (ácido indol butírico), ácido feniácetico, ácido 4 cloroindolacético y ácido indol propiónico (IPA), Existe gran cantidad de auxinas sintéticas siendo las mas conocidas: ANA (ácido naftalenacético), IBA (ácído indolbutírico), 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético), NOA (ácido naftoxiacético) 2,4-DB (ácido 2,4 diclorofenoxibutilico) 2,4,5,-T (ácido 2,4,5 triclorofenoxiacético) Biosíntesis Aunque las auxinas se encuentran en toda la planta, la más altas concentraciones se localizan en las regiones meristemáticas, las cuales están en crecimiento activo, siendo éste el sitio de síntesis. Su síntesis puede derivar del triptofano, que por transaminación y descarboxilación da origen al AIA o de la triptamina por oxidación. Se le encuentra tanto como molécula libre que es la forma activa o en formas conjugadas (con proteínas solubles), inactivas. La forma conjugada es la forma de transporte, de almacenamiento en semillas en reposo, y de evitar la oxidación por acción de la AIA oxidasa. Este proceso de conjugación parece ser reversible. La concentración de auxina libre en plantas varía de 1 a 100 µg/kg peso fresco. En contraste, la concentración de auxina conjugada ha sido demostrada en ocasiones que es sustancialmente más elevada. Traslado Una característica sorprendente de la auxina es la fuerte polaridad exhibida en su transporte a través de la planta. La auxina es transportada por medio del parénquima que rodea los haces vasculares, sin penetrar en los tubos cribosos. Su movimiento es lento y basipéto, alejándose desde el punto apical de la planta hacia su base, aún en la raíz, y requiere energía. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de brotes axilares laterales a lo largo del tallo, TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 3
manteniendo de esta forma la dominancia apical. El movimiento de la auxina fuera de la lámina foliar hacia la base del pecíolo parece también prevenir la abscisión. Las auxinas asperjadas sobre las hojas, en concentraciones bajas, pueden ser absorbidas, penetran en los elementos cribosos, pero posteriormente se trasladan al parénquima vascular, las auxinas sintéticas, aplicadas en altas concentraciones, se trasladan por floema, junto a los fotoasimilados. Modo de Acción Existe acuerdo en que las auxinas actúan a nivel génico al desreprimir o reprimir la expresión de los genes. EL AIA se liga a un receptor de naturaleza proteica, formando un complejo receptor-hormona de carácter reversible, especifico, con alta afinidad y saturable. Este complejo activa un promotor que controla la expresión de los genes que codifican la síntesis de las enzimas catalizadoras de los compuestos de la pared El efecto inicial preciso de la hormona que subsecuentemente regula este arreglo diverso de eventos fisiológicos no es aún conocido. Durante la elongación celular inducida por la auxina se piensa que actúa por medio de un efecto rápido sobre el mecanismo de la bomba de protones ATPasa en la membrana plasmática, y un efecto secundario mediado por la síntesis de enzimas. Efectos Fisiológicos La acción fisiológica de las auxinas puede resumirse como: Actúan en la Mitosis. Alargamiento celular. Formación de raíces adventicias. Dominancia Apical Herbicida Partenocarpia Graviotropismo Diferenciación de xilema Regeneración del tejido vascular en tejidos dañados Inhibición del crecimiento radical en concentraciones bajas Floración, Senectud, Geotropismo, Retardan la caída de hojas, flores y frutos jóvenes Dominancia apical TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 4
Aplicaciones en la Agricultura. Herbicidas (2,4-D, 2,4-DB) y arbusticidas (2,4,5-T) Enraizamiento de estacas leñosas (IBA, ANA) Evitar la caída de frutos (ANA, 2,4-DP) Raleo de frutos (ANA) Partenocarpia Inhibición de brotación lateral en forestales (ANA) Cultivo in vitro de tejidos Giberelinas El Acido giberélico GA3 fue descubierto en Japón como derivada de extracto del hongo Giberella fujikuroi que producía en crecimiento inusual de las plantas de arroz derivando de allí su nombre. Su designación es AG seguida de un número y al momento hay mas de 150 formas conocidas de esta hormona. Biosíntesis Las giberelinas son terpenos; su estructura se forma por ciclación de estas unidades, formando kaureno. Sintetizado en el camino metabólico del ácido mevalónico, de este mismo camino derivan, también, los retardantes del crecimiento. Su síntesis se produce en todos los tejidos de los diferentes órganos y puede estar afectada aparte de por procesos internos de retroalimentación negativa por factores externos como la luz que según su duración lleva a la producción de giberelinas o inhibidores del crecimiento Traslado Se realiza a través de floema y xilema, no es polar como en el caso de las auxinas. Modo de acción Las giberelinas provocan la división celular al acortar la interfase del ciclo celular e inducir las células en fase G1 a sintetizar ADN. También promueven la elongación celular al incrementar la plasticidad de la pared y aumentar el contenido de glucosa y fructosa, provocando la disminución del potencial agua, lo que lleva al ingreso de agua en la célula y produce su expansión, inducen la deposición transversal de microtúbulos y participan en el transporte de calcio. También pueden actuar a nivel génico para provocar algunos de sus efectos fisiológicos. TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 5
Efectos fisiológicos Controlan el crecimiento y elongación de los tallos. Elongación del escapo floral, que en las plantas en roseta es inducido por el fotoperíodo de día largo. Inducción de floración en plantas de día largo cultivadas en época no apropiada Crecimiento y desarrollo de frutos Estimulan germinación de numerosas especies, y en cereales movilizan reservas para crecimiento inicial de la plántula. Inducen formación de flores masculinas en plantas de especies diclinas. Reemplaza la necesidad de horas frío (vernalización) para inducir la floración en algunas especies (hortícolas en general). Aplicaciones en la Agricultura En alcaucil para producir agrandamiento y alargamiento del escapo floral En perejil para aumentar crecimiento (en épocas de frío principalmente) En cítricos retarda la senescencia de los frutos En vid para alargar de los pedúnculos florales para evitar enfermedades fúngicas, obtener bayas de mayor tamaño sin semillas En manzano para aumentar tamaño y calidad de la fruta En Coníferas, para incrementar la producción de semillas induciendo la floración precoz En caña de azúcar para aumentar rendimiento en sacarosa Romper latencia en tubérculos de papa y dormancia en semillas. En malterías para aumentar la hidrólisis del almidón del endosperma de cebada Citocininas Las citocininas son hormonas vegetales naturales que derivan de adeninas sustituidas y que promueven la división celular en tejidos no meristemáticos. Inicialmente fueron llamadas cinetinas, sin embargo, debido al uso anterior del nombre para un grupo de compuestos de la fisiología animal, se adaptó el término citocinina (citocinesis o división celular). Existen citocininas en musgos, algas café, rojas y en algunas Diatomeas. TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 6
Estructura de las citocininas Naturales Sintéticas Biosíntesis Son producidas en los órganos en crecimiento y en el meristema de raíz. Se sintetizan a partir del isopentenil adenosina fosfato (derivado de la ruta del ácido mevalónico) que por perdida de un fosfato, eliminación hidrolítica de la ribosa y oxidación de un protón origina la zeatina, es una citocinina natural que se encuentra en el maíz (Zea mays L.) de allí su nombre. TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 7
Traslado Las citocininas se trasladan muy poco o nada en la planta, sin embargo se las identifica en xilema (cuando se sintetizan en la raíz) y floema. Sin embargo, cuando los compuestos se encuentran en las hojas son relativamente inmóviles. Modo de acción Como derivan de una purina: Se unen a la cromatina del núcleo Efecto promotor sobre el ARN y las enzimas. Estimulan el estado de transición del estado G2 en la mitosis Actúan en la traducción del ARN. Incrementan la rapidez de síntesis de proteínas Efectos Fisiológicos División celular y formación de órganos. Retardo de la senescencia (debido a su propiedad de generar alta división celular son fuente de nutrientes, por lo que realizan su efecto de retardo de la senescencia) Desarrollo de yemas laterales. Inducen partenocarpia Floración de plantas de días corto. Reemplazo de luz roja en germinación de semillas fotoblásticas Aplicaciones en la Agricultura Retardo de la senescencia de flores y hortalizas de hojas, manteniendo por mas tiempo el color verde En manzanos, rosas o claveles promueve la ramificación lateral En combinación con giberelinas controla forma y tamaño de algunos frutos (manzano) Inducen partenocarpia en algunos frutos Reemplazan la necesidad de luz roja en semillas de lechuga Interrumpen dormancia en vid Disminuyen contenido de alcaloides en plantas del género Datura Promueven la formación de vástagos en el cultivo in vitro Etileno El etileno, es una de las hormonas de estructura más simple, gaseoso, al ser un hidrocarburo, es muy diferente a otras hormonas vegetales naturales. Aunque se ha sabido desde TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 8
principios de siglo que el etileno provoca respuestas tales como geotropismo y abscisión, no fue sino hasta los años 1960s que se empezó a aceptar como una hormona vegetal. Biosíntesis Deriva de los C3 y C4 de la metionina, que pasa, con gasto de ATP, a S- adenosilmetionina (SAM), por acción de una enzima pasa a ácido aminociclopropano- 1 carboxílico (ACC) y por oxidación de este y por la acc oxidasa se forma etileno. Una característica de esta hormona es que posee acción autocatalítica, esto se debe a que la presencia de etileno activa la acción del gen que codifica la enzima que pasa de ACC a etileno. TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 9
El etileno parece ser producido esencialmente por todas las partes vivas de las plantas superiores, y la tasa varía con el órgano y tejido específicos y su estado de crecimiento y desarrollo. Las tasas de síntesis varían desde rangos muy bajos (0.04-0.05 µl/kg-hr) en blueberries (Vaccinium sp.) a extremadamente elevadas (3.400 µl/kg-hr) en flores devanecientes de orquídeas Vanda. Modo de acción Su acción se da principalmente porque: Se une a receptores del tipo proteico que reconocen moléculas pequeñas de doble ligadura Deber ser una metalproteína que contiene CU o Zn Los receptores son principalmente dos (ETR y ERS) uno formado por dos elementos: un sensor y otro de respuesta (ETR) y otro con solo el elemento sensor (ERS) Actúan en la traduccción y amplificación de la señal de la hormona, al unirse el etileno a sus receptores, se desencadenan las reacciones que llevan a la respuesta al etileno. En general se observa un aumento en la síntesis de enzimas TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 10
Efectos Fisiológicos Maduración de frutos Senescencia de órganos Epinastia Tigmomorfogénesis o perturbación mecánica Hipertrofias Exudación de resinas, latex y gomas Promoción o inhibición de los cultivos de callos in vitro Inhibición de la embriogénesis somática Apertura del gancho plumular Inducción de raíces Inhibición del crecimiento longitudinal Incremento del diámetro caulinar Antagonistas [CO2] Compite por el sitio de unión del etileno con el receptor. Por eso se utiliza para la conservación de frutas Ag+ Interfiere la unión del etileno con su receptor. Se lo utiliza para la conservación de flores 2,5 norbornadieno cis buteno Inhibe la acción del etileno de manera competitiva por unirse al mismo receptor. Aplicaciones en la Agricultura Maduración de frutos climatéricos Evitar vuelco en cereales Provoca abscisión de órganos y frutos Estimula la germinación Inducción de floración Incremento del flujo de latex, gomas y resinas Inhibición de la nodulación inducida por Rizhobium, de la tuberización y bulbificación Promoción de la floración femenina en Cucurbitáceas El etileno se aplica como gas en ambientes cerrados o en forma liquida como pulverizaciones de Etephon que al ponerse en contacto con la planta libera etileno. TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 11
Objetivo: Comprobar el efecto de los Reguladores de Crecimiento en vegetales Metodología Materiales: Tubos de ensayo conteniendo Medio de Cultivo Murashige y Skoog (Ver formulación en T.P. Nutrición Mineral) con concentraciones de reguladores de crecimiento detalladas en Tabla 1. Alcohol Vasos de precipitados y cápsulas de Petri estériles Pinzas y bisturís estériles (dejar al menos 24 hs. en estufa) Gradillas Mecheros de alcohol Plantas de papa (Solanum tuberosum) micropropagadas 1 Planta de cretona (Coleus) con al menos 3 entrenudos 3 plantines de tomate Solución de AIA 100 y 1000 ppm. Solución AIA 200 ppm. Lanolina Los materiales subrayados deben ser provistos por los estudiantes. Procedimiento 1) Micropropagación de esquejes uninodales de papa en medios con distintas concentraciones y combinaciones de reguladores de crecimiento - Limpiar la mesada de trabajo con lavandina. - Lavarse las manos con agua y jabón y una vez secas pasarse alcohol. - En condiciones de esterilidad sacar las plántulas micropropagadas del tubo hasta la altura de la raíz. Seccionar dejando la raíz dentro del tubo. - Cortar esquejes uninodales (con una hoja y una yema axilar). - Colocar los esquejes uninodales en tubos con el medio fresco indicado en Tabla 1. - Rotular los tubos indicando fecha, variedad de papa, regulador de crecimiento y concentración. Dispone en gradillas y llevar a cámara de cultivo. - Registrar condiciones de cultivo (Luz, temperatura, fotoperíodo) - Armar una planilla para registrar los siguientes datos cada 10 días: Aspecto general de cada planta, tamaño del brote, cambios en el color de la hoja plantada y/o de las nuevas; TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 12
raíces: tamaño, número, relación parte aérea/raíces, distancia entrenudos y cualquier otro dato distintivo. - Si durante los controles detecta algún tubo contaminado, retírelo de la cámara de cultivo. - Discutir los resultados obtenidos y compararlos con datos bibliográficos según los principales síntomas que visualice. Tabla 1: Detalles de reguladores de crecimiento que se utilizarán en la experiencia 1 Cant. Proporción reguladores tubos 5 Sin reguladores 5 AG3 0,25 ppm (Completa) 5 AG3 1 ppm 5 ANA 0,25 ppm 5 ANA 1 ppm 5 BAP 0,25 ppm 5 BAP 1 ppm. 5 BAP/ANA 1ppm/0,1 ppm 5 ANA/BAP 1ppm/0,1 ppm 2) Abscisión de pecíolos - Utilice plantas de cretona y, comenzando por el tercer par de hojas visibles a partir del ápice vegetativo, corte el pecíolo en la base de la lámina de cada hoja en tres pares sucesivos. Mida la longitud de los pecíolos inmediatamente después de cortadas las hojas. - Identifique el 1 er par de pecíolos con un anillo de papel y aplique sobre la superficie cortada lanolina más AIA 1000 ppm. - Al pecíolo del 2 do par de hojas aplicar lanolina más AIA 100 ppm e identificar. - Al último pecíolo colocarle lanolina sola e identificar. - En cada una de las prácticas siguientes, revise la planta, anote la fecha de caída de los pecíolos y reponga la lanolina cuando sea necesario. - Anote los datos en la siguiente planilla y fundamente los resultados obtenidos. Tratamiento Lanolina sola Lanolina + 100 ppm AIA Lanolina + 1000 ppm AIA Fecha de caída Hoja tratada Hoja no tratada TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 13
3) Dominancia Apical - Utilizar para esta experiencia tres plántulas de tomate u otra de crecimiento rápido apical - Cortar los tallos de dos de las plántulas por debajo del primer nudo que lleva una hoja. Aplicar a uno de los tallo seccionados lanolina + AIA 200 ppm y al otro lanolina sola. Identificar cada plántula. - La tercera planta se utilizará como testigo. - Regar las macetas cuando sea necesario. Reponer la lanolina y el regulador de crecimiento cuando sea necesario. - En cada una de las prácticas siguientes, durante dos semanas, realice controles, anotando la aparición de ramificaciones laterales y la longitud de éstas. - Completar la siguiente planilla y justificar los resultados obtenidos Número de ramificaciones laterales Testigo Lanolina Lanolina + AIA Largo promedio en mm de las ramificaciones laterales Conclusiones Discuta los resultados obtenidos y elabore sus conclusiones. Bibliografía http://fai.unne.edu.ar/biologia/plantas/reguladores_vegetales_2005/_reguladores_vegetales.htm TP13, Hormonas Vegetales (Reguladores de Crecimiento), 14