CLART ENTHERPEX DETECCIÓN Y TIPADO DE HERPES Y ENTEROVIRUS HUMANOS MEDIANTE IDENTIFICACIÓN GENÓMICA PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO - 1 -

CLART ENTHERPEX DETECCIÓN Y TIPADO DE HERPES Y ENTEROVIRUS HUMANOS MEDIANTE IDENTIFICACIÓN GENÓMICA PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO - 1 -

CLART ENTHERPEX Extracción 24 determinaciones Ref: AT-0908-24 48 determinaciones Ref: AT-0908-48 Amplificación 24 determinaciones Ref: AT-1008-24-MT 48 determinaciones Ref: AT-1008-48-MT Genotipado 24 determinaciones Ref: AT-1108-24 48 determinaciones Ref: AT-1108-48 CLART ENTHERPEX AS (Visualización en Array Strip) Genotipado Versión 1 Marzo 2010 48 determinaciones Ref: AS-1108-48 96 determinaciones Ref: AS-1108-96 EL CE0318 sólo ampara el diagnóstico in vitro de CMV. - 2 -

ÍNDICE: 1. GLOSARIO DE TÉRMINOS 2. INTRODUCCIÓN 3. DESCRIPCIÓN DEL KIT CLART ENTHERPEX 4. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT 4.1. Reactivos de extracción-purificación 4.2. Reactivos de amplificación 4.3. Reactivos de visualización 4.4. Otros componentes 5. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO 5.1. Reactivos y material 5.2. Equipos 6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN 6.1. Recomendaciones generales 6.2. Precauciones para la visualización 7. TOMA DE MUESTRAS 7.1. Torundas 7.2. Suero, plasma 7.3. Líquido cefalorraquídeo 7.3. Tejido fijado en formol o etanol e incluido en parafina 8. PROTOCOLO DE TRABAJO 8.1. Extracción manual del ADN/ARN a partir de diferentes muestras 8.1.1. Torundas 8.1.2. Suero, plasma 8.1.3. Líquido cefalorraquídeo 8.1.4. Tejido fijado en formol o etanol e incluido en parafina 8.2. Extracción automática: - Torundas - Suero/plasma/líquido cefalorraquídeo - Sangre total 8.3. Reacción de amplificación 8.4. Visualización del producto amplificado 8.4.1. Visualización en Array Tubes (AT) 8.4.2. Visualización en Array Strip (AS) 9. LECTURA DE RESULTADOS 10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO 12. BIBLIOGRAFÍA - 3 -

1. GLOSARIO DE TÉRMINOS Atención, ver instrucciones de uso Fecha de caducidad Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro Lote 25ºC Conservar a temperatura ambiente 20ºC 8ºC Conservar entre 4 ºC y 8 ºC 4ºC -18ºC 30ºC Conservar entre 30 ºC y 18 ºC - 4 -

2. INTRODUCCIÓN De los más de 100 tipos diferentes de herpes virus que se conocen, sólo ocho infectan exclusivamente al hombre: Virus Herpes Simple tipos 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2), Virus la Varicela-Zoster (VZV), Virus Epstein-Barr (EBV), Citomegalovirus Humano (CMV), Herpesvirus Humano tipos 6, 7 y 8 (HHV6, HHV7 y HHV8). Un virus herpes de primates, conocido como virus B, puede también infectar ocasionalmente al hombre. Los estudios epidemiológicos demuestran que los virus de la familia Herpesviridae son extraordinariamente ubicuos y están ampliamente extendidos en la población general. Los menos ubicuos son el HSV-2 y el HHV-8, debido quizás a que su principal vía de transmisión es la sexual. En contraste con la gran prevalencia en la población general, la mayor parte de las infecciones son asintomáticas. Este tipo de infecciones pueden clínicamente oscilar desde la benignidad hasta un grave compromiso de la salud o la vida del paciente. Son estas últimas, las que motivan el interés principal del diagnóstico de laboratorio, máxime teniendo en cuenta la inespecificidad de los signos y síntomas clínicos que se presentan. Aunque estos virus pertenecen a distintas subfamilias, todos ellos comparten una característica única de los herpes virus, como es la de persistir latentes en las células o tejidos específicos tras la infección primaria. Durante este período de latencia el genoma del virus puede o no integrarse en el ADN del huésped y ser replicado. Esto conlleva el peligro de reactivaciones posteriores, las cuales se ven favorecidas por ciertos factores; como el stress, la inmunodepresión (enfermos de SIDA, transplantados ), una edad avanzada, cambios hormonales (menstruación y gestación), exposiciones a la luz solar, etc. En estos casos pueden aparecer diversos tipos de síndromes, principalmente neurológicos, como encefalítis, polirradiculitis o neuropatías periféricas. Los Enterovirus causan de 10 a 30 millones de infecciones anuales en Estados Unidos, siendo la causa más común e importante de las infecciones pediátricas, que oscilan desde estados febriles a meningitis, miocarditis u otras sepsis neonatales. Dentro de la familia de los Enterovirus los más importantes desde el punto de vista clínico humano son: Poliovirus, Coxsackivirus y Echovirus. El Poliovirus a pesar de ser causa de parálisis infantil en 4 de cada 100 niños es el virus menos significativo ya que actualmente se dispone de una vacuna en el mercado. El diagnóstico microbiológico de estas patologías es de gran interés, especialmente de las más graves, como la Encefalitis que puede ser causada tanto por herpesvirus como por Enterovirus. Muchas de las patologías presentan el mismo cuadro clínico que el causado por otros agentes víricos y bacterianos por lo que la posibilidad de realizar un diagnóstico diferencial es de gran importancia. - 5 -

Históricamente, el diagnóstico microbiológico de Herpesvirus y Enterovirus ha dependido de su cultivo en el laboratorio, pero esta técnica tiene los inconvenientes de ser un procedimiento largo (1-2 semanas), poco sensible, laborioso y difícil de implantar en la práctica rutinaria del laboratorio. Además, no puede ser utilizado con algunos tipos de muestras clínicas (líquido cefalorraquídeo). El kit CLART ENTHERPEX se ha desarrollado para determinar de forma rápida el agente (Herpes o Enterovirus) causante de enfermedad, permitiendo así instaurar el tratamiento clínico más efectivo en cada caso. El Kit CLART ENTHERPEX para el genotipado de Herpesvirus humanos y Enterovirus está basado en la amplificación de fragmentos específicos del genoma vírico mediante RT-PCR múltiple y su posterior hibridación con sondas de captura en arrays, específicas para cada microorganismo. Esto conlleva una serie de ventajas: 1 Alta sensibilidad permitiendo la detección de cantidades mínimas de ADN. Esto supone una gran ventaja en muestras clínicas en las que la cantidad de moléculas de virus son escasas. 2 Detección simultánea de múltiples virus presentes en una misma muestra. 3 Elevada especificidad, al utilizar una secuencia correspondiente a una región altamente conservada dentro del genoma vírico y sondas de captura específicas para cada tipo de Herpes humano y Enterovirus. 4 Fácil de estandarizar en un laboratorio hospitalario. 5 Rápido ya que se obtienen los resultados de los análisis en 8 h. 3. DESCRIPCIÓN DEL KIT CLART ENTHERPEX CLART ENTHERPEX detecta la presencia en muestras clínicas (torundas, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo y biopsias) de los 8 virus herpes humanos: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7 y HHV-8; y de los tres virus más importantes desde el punto de vista clínico humano de la familia de Enterovirus, pero sin diferenciarlos entre ellos: Poliovirus, Echovirus y Coxsackievirus. La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de entre 106-328 pb, cuya secuencia aunque está altamente conservada es lo suficientemente específica como para identificar cada tipo de virus. De esta manera, se asegura la especificidad de la detección. - 6 -

La amplificación de los distintos virus se lleva a cabo en dos tipos distintos de tubos de RT-PCR/PCR (PCR reversa). Los tubos de la Mix 1 son transparentes y se utilizan para la amplificación y posterior detección de HSV-1, HSV-2 y VZV. Los tubos de la Mix 2 son de color verde y se utilizan para la amplificación y visualización de los virus: CMV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 y Enterovirus (Echovirus, Poliovirus y Coxsackivirus). La detección del producto amplificado por RT-PCR/PCR se lleva a cabo mediante una nueva plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART (Clinical Array Technology). La plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez muy cómodo y eficaz que consiste en incluir un microarray en la parte inferior de un tubo de 2 ml (Array Tube-AT) o en el fondo de un pocillo de una tira de 8 (Array Strip-AS) (Figura 1), lo que simplifica todo el proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de arrays clásicos. Tubo AT Tira de 8 pocillos AS 12 tiras de 8 pocillos Figura 1: Esquema de la plataforma CLART *El sistema ArrayTube TM está licenciado por CLONDIAG Chip Technologies GMBH. Este tipo de tecnología permite la detección simultánea de múltiples marcadores moleculares de utilidad diagnóstica y de los controles necesarios para asegurar la fiabilidad de los resultados obtenidos. El sistema de detección con CLART ENTHERPEX se basa en la precipitación de un producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la hibridación de los productos amplificados con las sondas específicas. Durante la RT-PCR/PCR, los productos amplificados se marcan con biotina. Después de la amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas sondas específicas que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la estreptavidina con la biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en las que ocurre la hibridación (Figura 2). - 7 -

Sondas sobre array Producto marcado biotina Hibridación Incubación con el conjugado Conjugado Reacción de revelado Precipitación del sustrato Figura 2: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A través de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-hrp (peroxidasa de rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la acción de la HRP, produce un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación. La sensibilidad obtenida combinando la amplificación genómica y la visualización en el microarray con el kit CLART ENTHERPEX es tan alta, que no es necesario hacer dobles amplificaciones (nested-pcr), evitando así el riesgo de contaminación que éstas conllevan. Uno de los principales inconvenientes de la detección por amplificación genética son los falsos negativos, debidos principalmente a la presencia de inhibidores de la mezcla de enzimas (RT y ADN polimerasa) en las muestras en las que se quiere detectar el virus (hemoglobina, sales, etc). Con el kit CLART ENTHERPEX se han eliminado estos falsos negativos añadiendo a cada uno de los tubos de amplificación un control interno de la eficiencia de la reacción de amplificación. Si la extracción RNA/DNA se realiza de forma incorrecta la técnica dará lugar a un falso negativo, por lo que se recomienda especial cuidado a la hora de realizar este proceso. - 8 -

A su vez, se debe incluir un control negativo de extracción para comprobar que las muestras no hayan sufrido contaminaciones durante los procesos de extracción, amplificación y visualización; lo que daría lugar a un falso positivo. 4. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT El kit CLART ENTHERPEX contiene suficientes reactivos para la extracción y análisis del ADN/ARN de 24 ó 48 muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad del kit. 4.1. Reactivos de extracción El kit de Extracción y Purificación CLART ENTHERPEX se envía a -20º C y se debe conservar a esta temperatura hasta su uso. Sus componentes son: SEML (solución de extracción). Una vez descongelada se debe guardar a 4ºC y consumir antes de 8 días. SD (solución de dilución). Conservar a -20ºC o a 4ºC. IP (Isopropanol). Conservar a -20ºC. DE (Etanol 70%). Conservar a -20ºC. DB (Solución de digestión 5X). Una vez descongelada guardar a 4ºC. PK (Proteinasa K 10X). Una vez descongelada se debe mantener en hielo y guardar a 4ºC. No usar este reactivo si ha transcurrido más de un mes tras su descongelación. 4.2. Reactivos de amplificación Se envían y conservan a -20º C. Tubos de amplificación Se envían dos tipos de tubos de amplificación: Tubo incoloro (multiplex PCR 1) para la amplificación de HSV- 1, HSV-2 y VZV. Contienen 45 µl de mezcla de reacción. Mix1. Tubo verde (multiplex-rt-pcr 2) para la amplificación de CMV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 y Enterovirus (Echovirus, Poliovirus y Coxsackivirus). Contienen 43 µl de mezcla de reacción. Mix2-9 -

ADVERTENCIA!: Hay que añadir 2 µl de mezcla de enzima antes de introducir el material genético extraído en los tubos de amplificación verdes. Los tubos incoloros ya llevan incorporada la enzima. Mezcla de Enzima: es una mezcla de las enzimas de RT (retrotranscriptasa) y DNA Polimerasa. Lista para su uso. Conservar a -20ºC. NOTA: En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura; la aparición de un color rojizo en la ventana de visualización indica que en algún momento los productos han sobrepasado la temperatura de conservación de 20 o C y no deben utilizarse. 4.3. Reactivos de visualización Se envían a 4º C. Son los siguientes: Microarrays: Tubos AT o tiras de 8 pocillos (AS) (sondas específicas incluídas). Se suministran en un sobre termosellado. Conservarlos siempre cerrados, a temperatura ambiente y protegidos de la luz. SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4 ºC. DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC. CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes de usar. RE (Solución de Revelado). Conservar a 4º C. TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4º C. ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, los microarrays deben conservarse a temperatura ambiente. 4.4. Otros componentes La técnica requiere un equipo que capture y procese la imagen obtenida del microarray, generando de manera totalmente automática un único informe por cada muestra analizada. En la siguiente tabla se indican las características del equipo del que dispone GENOMICA. Cuenta con un Software específico para CLART ENTHERPEX, diseñado y validado por GENOMICA. CAR CLINICAL ARRAY READER Hasta 12 tubos Procesamiento - 10 -

manual muestra por muestra. Lectura de hasta 12 tubos a la vez. - lector CAR: Este lector está fabricado para su uso exclusivo con los kits de diagnóstico de GENOMICA. Es distribuido por GENOMICA. uso. - Software: específico para CLART ENTHERPEX, instalado y listo para su 5. MATERIAL REQUERIDO, NO SUMINISTRADO A continuación enumeramos todo el material requerido y que no es suministrado. 5.1. Reactivos y material 5.2. Equipos Agua destilada. Suero salino. Guantes desechables. Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo. Recipiente con hielo picado. Tubos Eppendorf de 1,5 ml autoclavados. Gradillas para tubos de 1,5 ml. Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml. Microcentrífuga. Termociclador. Cabina de bioseguridad para el laboratorio de extracciones Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de extracción. Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir la mezcla de enzimas al tubo de color de amplificación y para añadir el material - 11 -

genético a los tubos de amplificación Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de visualización. Termobloque con agitación ajustable a 25ºC, 30ºC, 50ºC y 53ºC. Compatible con tubos tipo Eppendorf y con tiras de 8 pocillos. Vortex. Sistema de vacío (opcional). 6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN Muy importante para evitar contaminaciones! Leer detenidamente antes de comenzar la técnica. 6.1. Recomendaciones generales: 1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar la contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada una de las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas, puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas. 1 Área pre-pcr: En esta área se hace la extracción del ADN/ARN, se añade a los tubos de amplificación la mezcla de enzimas y se añade el ADN/ARN a los tubos de amplificación. Se debe usar campana de flujo laminar. 2 Área post-pcr: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la visualización del producto amplificado. El material de esta área nunca ha de entrar en contacto con el del área de extracción. Evitar ir al área de pre- PCR después de haber estado trabajando en el área de visualización. 2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empiece a trabajar en las áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se preparen los tubos de amplificación y cuando se añada el ADN/ARN a esos tubos. 3. Limpiar las zonas de trabajo, material y equipos (poyatas, campanas, gradillas, pipetas, termociclador ) en profundidad con lejía diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras, y obligatoriamente después de una contaminación. Poner papel de filtro nuevo cada vez que se comience a trabajar. Se recomienda limpiar los pocillos del termociclador y termobloque con un hisopo humedecido con la concentración de lejía indicada (no añadir la lejía directamente sobre el bloque). - 12 -

4. Emplear siempre puntas con filtro o pipetas de desplazamiento positivo para evitar contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de pipetas distinto para cada área. 5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado. 6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes aunque sean del mismo lote. 7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para evitar contaminaciones. 8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo. 9. Separar los tubos unos de otros en todo momento durante la manipulación, con especial precaución durante la extracción. 10. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se emplean otras muestras distintas a las indicadas o ADN/ARN extraído por un protocolo distinto al indicado. 6.2. Precauciones para la visualización 1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el cristal situado en el fondo del tubo, ya que podría dañarse el micro-array. 2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del tubo AT/AS, nunca directamente sobre el fondo. 3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los productos desnaturalizados de PCR. 4. A la hora de aspirar la solución de hibridación utilizar una punta distinta para cada muestra con el fin de evitar contaminaciones. 5. En el caso de procesar AT es muy importante eliminar completamente todo resto de solución antes de añadir la siguiente. En el caso de procesar AS se dejará un ligero remanente de volumen de manera que el array en ningún momento quede seco. 6. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el tubo AT/AS y la tapa del tubo para evitar que queden restos de éste y que reaccionen con la solución RE, produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar a interpretaciones erróneas del resultado. - 13 -

7. Tras los lavados tener la precaución de retirar todo el TL, de manera que el cristal quede completamente seco antes de echar cualquier reactivo de la visualización. Esto es especialmente importante en los lavados tras el conjugado. 8. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las distintas soluciones. 9. Mantener limpia la base del tubo AT/AS para evitar posibles interferencias en la lectura de resultados. 10. Antes de realizar la lectura de las muestras, asegurarse de haber elegido el programa correcto de lectura. 11. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de posición y de que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso contrario, limpiar el fondo del tubo por fuera con un papel de celulosa, golpear suavemente el tubo con el dedo o eliminar las burbujas con micropipeta. 7. TOMA DE MUESTRAS 7.1. Torundas Tomar la muestra con una torunda seca y estéril, de algodón o alginato, preferentemente del tipo uretral (incluso para los frotis vaginales). No utilizar dispositivos que produzcan el sangrado de la lesión. Volver a introducir la torunda en su tubo sin ningún tipo de medio. Conservar la muestra a 4º C si se va a procesar antes de 7 días o a -20º C si se va procesar después. Las torundas son de un solo uso con lo que una vez procesadas deben desecharse. Es importante evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. 7.2. Suero o plasma Las muestras de sangre de las que se desee extraer el plasma han de tomarse en tubos que contengan citrato o EDTA como anticoagulante, nunca heparina. Para extraer el suero hay que dejar coagular la muestra de sangre durante 30 min y centrifugar a 1500 g durante 20 min. En algunos casos, tras la toma de este tipo de muestras es posible aislar la fracción celular y proceder a la extracción del DNA/RNA a partir de ésta. Si la muestra se va a procesar antes de 12 h se debe conservar a 4º C. Si el análisis se realiza con posterioridad, la muestra se debe alicuotar y almacenar congelada a -70º C y descongelar justo en el momento de su procesamiento. Es importante evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. - 14 -

7.3. Líquido cefalorraquídeo Si la muestra se va a procesar antes de 12 h se debe conservar a 4º C. Si el análisis se realiza con posterioridad, la muestra se debe alicuotar y almacenar congelada a -70º C y descongelar justo en el momento de su procesamiento. Es importante evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. 7.4. Biopsias fijadas en formol o etanol e incluidas en parafina Fijar las muestras en formol tamponado durante el menor tiempo posible (nunca más de 24h), para evitar la degradación del DNA/RNA. El empleo de formol no tamponado o la fijación durante más de 24h podría conducir a un resultado falso negativo. Es importante limpiar cuidadosamente la cuchilla con xileno o usar cuchillas de un solo uso, antes y después de cortar la muestra, para evitar arrastrar restos de otra muestra cortada anteriormente. Hacer con el microtomo 2-3 cortes de 5 µm y ponerlos en un tubo estéril de 1,5 ml. 8. PROTOCOLO DE TRABAJO 8.1. Extracción manual del ADN/ARN a partir de diferentes muestras Se recomienda que, para obtener unos óptimos resultados, el rendimiento de la extracción sea, como mínimo de 5-10 ng/µl de ARN, independientemente de que la extracción se realice de forma manual o automática. Recomendaciones específicas antes de comenzar la extracción: Trabajar en el área pre-pcr de extracción, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 6.1. Antes de comenzar y al finalizar se debe limpiar cuidadosamente el área de la campana con lejía diluida al 10%. Limpiar las pipetas antes y después de cada uso con lejía diluida al 10%. Mantener las muestras en hielo. Utilizar tubos eppendorf de 1.5 ml estériles. Mantenerlos lo más separado posible en la gradilla durante la extracción para evitar contaminaciones. Extracción del ADN/ARN - 15 -

8.1.1. Torundas Al final de cada serie de muestras incluir un control negativo constituido por 1,5 ml de suero salino y procesarlo igual que el resto de las muestras. 1. Añadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9 %) al tubo que contiene la torunda y agitar en el vortex durante 1 min. 2. Decantar el sobrenadante en un tubo Eppendorf de 1,5 ml autoclavado y centrifugarlo durante 10 minutos en microcentrífuga a la máxima velocidad. 3. Quitar el sobrenadante con la pipeta cuidando de no arrastrar el precipitado de células. 4. Descongelar un tubo de DB 5X (Solución de Digestión 5X), un tubo de PK 10X (Proteinasa K 10X) y un tubo de SD (Solución de Dilución). La Proteinasa K se debe mantener en hielo mientras se esté usando y después se debe guardar a 4ºC. Nunca volver a congelarla una vez descongelada. Preparar la mezcla de digestión, mezclando las siguientes cantidades por cada muestra a analizar: 70 x (nº tubos + 1) = µl de SD (Solución de Dilución). 20 x (nº tubos + 1) = µl de DB5X (Solución de Digestión 5X). 10 x (nº tubos + 1) = µl de PK 10X (Proteinasa K 10X). 5. Añadir 100 µl de mezcla de digestión a cada muestra. Resuspender suavemente el precipitado de células con la ayuda de la micropipeta. 6. Incubar a 55-60ºC durante 2 h. 7. Hervir durante 10 min para inactivar la Proteinasa K. Si el cierre de los tubos no es lo suficientemente fuerte, se recomienda perforar los tapones con una aguja para impedir que se abran durante la incubación a 100 ºC. Procurar que el agua del baño no entre en el tubo por este agujero. No cerrar la tapa del baño. 8. Centrifugar en microcentrífuga a máxima velocidad durante 10 min. Pasar inmediatamente el sobrenadante a un tubo limpio y tomar una alícuota de 5 µl para hacer la reacción de amplificación. Guardar el resto a -20 ºC. 8.1.2. Suero o plasma Es necesario procesar una muestra formada por 100 µl de suero salino y que servirá como control negativo de la reacción de amplificación y visualización. 1. Descongelar la muestra en hielo. 2. En un tubo Eppendof poner 100 µl de muestra clínica - 16 -

3. Añadir 400 µl de SEML (solución de extracción de muestras líquidas). Esperar a que la solución se descongele y se vuelva transparente antes de usarla. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces e incubar durante 15 min a Tª ambiente. 4. Añadir 500 µl de Isopropanol (almacenado a -20º C), mantener el isopropanol en hielo hasta su uso. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces y centrifugar, preferiblemente a 4º C, a 13000 rpm durante 20 min. 5. Aspirar el sobrenadante con micropipeta. Se puede utilizar la micropipeta de 1000 µl para eliminar el sobrenadante, siempre y cuando se emplee al final una micropipeta de menor escala, por ejemplo la de 20 µl, para los restos del fondo del tubo y evitar eliminar el precipitado por equivocación. 6. Añadir 500 µl de Etanol 70% (almacenado a -20º C), mantener en hielo hasta su uso. Agitar ligeramente para limpiar el precipitado del fondo y centrifugar 15 min a 13000 rpm. 7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente como se indica en el paso 5. Secar perfectamente en la campana durante 15 ó 20 min dejando los tubos abiertos. Antes de resuspender la muestra comprobar que no queden restos de etanol que podrían inhibir la PCR. 8. Resuspender en 25 µl de Solución de dilución. El ADN/ARN extraído se puede utilizar directamente para su análisis (se mantendrá en hielo hasta el momento de añadirlo al tubo de amplificación) o se puede guardar a -20º C. 8.1.3. Líquido cefalorraquídeo Es necesario procesar una muestra formada por 50 µl de suero salino y que servirá como control negativo de la reacción de amplificación y visualización. 1. Descongelar las muestras en hielo. 2. En un tubo Eppendof poner 50 µl de muestra clínica 3. Añadir 200 µl de SEML (solución de extracción de muestras líquidas). Esperar a que la solución se descongele y se vuelva transparente antes de usarla. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces e incubar durante 15 min a Tª ambiente. 4. Añadir 250 µl de Isopropanol (almacenado a -20º C), mantener el isopropanol en hielo hasta su uso. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces y centrifugar, preferiblemente a 4º C, a 13000 rpm durante 20 min. - 17 -

5. Aspirar el sobrenadante con micropipeta. Se puede utilizar la micropipeta de 1000 µl para eliminar el sobrenadante, siempre y cuando se emplee al final una micropipeta de menor escala, por ejemplo la de 20 µl, para los restos del fondo del tubo y evitar eliminar el precipitado por equivocación. 6. Añadir 500 µl de Etanol 70% (almacenado a -20º C), mantener en hielo hasta su uso. Agitar ligeramente para limpiar el precipitado del fondo y centrifugar 15 min a 13000 rpm. 7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente como se indica en el paso 5. Secar perfectamente en la campana durante 15 ó 20 min hasta que no queden residuos de etanol. Antes de resuspender la muestra comprobar que no queda etanol. 8. Resuspender en 25 µl de Solución de dilución. El ADN/ARN extraído se puede utilizar directamente para su análisis (se mantendrá en hielo hasta el momento de añadirlo al tubo de amplificación) o se puede guardar a -20º C. 8.1.4. Biopsias fijadas en formol o etanol e incluidas en parafina 1.a. Incluidas en parafina: Hacer con el microtomo 2 cortes de 5 µm y ponerlos en un tubo Eppendorf de 1,5 ml autoclavado. Es importante limpiar cuidadosamente la cuchilla con xileno, antes y después de cortar la muestra, para evitar arrastrar restos de otra muestra cortada anteriormente. 1.b. Fijadas en formol o etanol: Cortar/Machacar un fragmento de muestra de unos 2-3ml con una cuchilla estéril sobre un porta estéril e introducirlo en un tubo estéril de 1,5 ml. Machacar el tejido con la punta de la pipeta, mezclar en el vortex para facilitar la lisis. 2. Descongelar a temperatura ambiente un tubo de DB 5X (Solución de Digestión 5X), un tubo de PK 10X (Proteinasa K 10X) y un tubo de SD (Solución de Dilución). La Proteinasa K se debe mantener en hielo mientras se esté usando y después se debe guardar a 4ºC, nunca volver a congelarla una vez descongelada. Preparar la mezcla de digestión, mezclando las siguientes cantidades por cada muestra a analizar: 70 x (nº tubos + 1) = µl de SD (Solución de Dilución). 20 x (nº tubos + 1) = µl de DB5X (Solución de Digestión 5X). 10 x (nº tubos + 1) = µl de PK 10X (Proteinasa K 10X). Añadir 100 µl de mezcla de digestión a cada muestra. Empujar el corte con la punta de la micropipeta para que quede completamente cubierto por la mezcla de digestión. Añadir 100 µl de la mezcla a un tubo de 1,5 ml vacío, que se procesará como control negativo de extracción y visualización. - 18 -

3. Incubar a 56º C durante 3 h en un termobloque o en un baño. 4. Hervir durante 10 min para inactivar la Proteinasa K. Si el cierre de los tubos no es lo suficientemente fuerte, se recomienda perforar los tapones con una aguja para impedir que se abran durante la incubación. 5. Centrifugar inmediatamente en microcentrífuga durante 10 min. Recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml limpio, atravesando con la micropipeta la capa superior de parafina solidificada. El DNA extraído se puede utilizar directamente para su análisis o se puede guardar a -20º C. 8.2. Extracción automática Seguir recomendaciones del fabricante. 8.3. Reacción de amplificación 8.3.1 Recomendaciones específicas para la amplificación: Trabajar en el área de Pre-PCR, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 6.1. Tener especial cuidado a la hora de añadir la mezcla de enzimas a los tubos de amplificación, ya que contiene un elevado porcentaje de glicerol, de forma que si se introduce demasiado la punta de la pipeta, la mezcla se adhiere a las paredes provocando, por un lado, que se añada más mezcla de lo necesario al tubo de reacción, y por otro lado, se produzca una pérdida del producto, pudiendo darse el caso de no tener suficiente para el resto de tubos de amplificación del kit. Añadir el ADN/ARN en el área de Pre-PCR, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 6.1. Durante el proceso mantener los tubos cerrados separados y en hielo. 8.3.2 Protocolo de la Reacción de amplificación: 1. Descongelar por cada muestra que se vaya a analizar dos Tubos de amplificación (uno incoloro y otro verde, correspondientes a las dos multiplex difierentes) y mantenerlos en hielo. No usar temperaturas superiores a 37º C para la descongelación. 2. Centrifugar unos segundos en la microcentrífuga para que quede todo el líquido en el fondo del tubo. Si no se dispone de adaptadores de microcentrífuga, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamaño mayor a los que se les haya cortado la tapa. - 19 -

3. Añadir 2 µl de la mezcla de enzima a los tubos de amplificación verdes (Mix 2). Mantener la mezcla de enzimas en hielo durante su manipulación. 4. Añadir 5 µl del ARN/ADN con una concentración mínima de 3ng/µl extraído de las muestras, a cada uno de los Tubos de Reacción y resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo. 5. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas para ambos tipos de multiplex: 1 ciclo 45ºC 45min 95ºC 15min 45 ciclos 95ºC 30 seg 56ºC 1:30 min 72ºC 1 min 1 ciclo 72ºC 10 min 4ºC continuo hasta la recogida de tubos (opcional) 6. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reacción en el termociclador. La duración de la amplificación es de unas 5 horas, aunque puede variar ligeramente dependiendo del equipo empleado. 8.4. Visualización del producto amplificado 8.4.1. Visualización en Array Tubes (AT) Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización: EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR. Encender el lector de ATs al comienzo del proceso, la autocalibración del equipo tarda unos minutos y debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado. - 20 -

PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO REUTILIZAR SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON ANTERIORIDAD. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner en marcha el programa de desnaturalización. Es recomendable limpiar los pocillos con un hisopo humedecido con dicha concentración de lejía y no aplicar esta directamente sobre el bloque. Colocar los tubos de amplificación lo más separados posible y nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro, salvo en la adición de amplificados al tubo AT donde si es necesario. Cambiar las pipetas Pasteur utilizadas para la aspiración en las bombas de vacío obligatoriamente después de terminar un ensayo y cada vez que se aspire una nueva muestra tras el paso de hibridación Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente, asegurarse antes de utilizarlo que no tiene cristales, si los tuviera dejarla a temperatura ambiente hasta que desaparezcan. Asegurarse de que los termomixers han alcanzado la temperatura adecuada antes de introducir los tubos AT. Si no es así dejar el AT en tampón de lavado antes de retirarlo, nunca dejar seco el cristal. En caso de fallo de lectura, introducir manualmente el número que aparece en el tubo AT especificado como Assay ID. Visualización 1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador, lo más separado posible, e incubar a 95º C durante 10 minutos, NUNCA SOBREPASAR LOS 10 MINUTOS. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95º C. Sacar los tubos de la incubación a 95º C y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo. 2. Preparación de la Solución TL diluida: Para 12 muestras, añadir 2 ml de Solución TL a 18 ml de agua destilada. Para 24 muestras, añadir 3 ml de Solución TL a 27 ml de agua - 21 -

destilada. Para 48 muestras, añadir 6 ml de Solución TL a 54 ml de agua destilada. 3. Pre-lavado del tubo AT: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los tubos AT añadiendo 300 µl de Solución TL diluida a cada AT e invirtiendo el tubo 10-15 veces. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con vacío. Repetir este paso de lavado una vez más. Este paso es necesario para lavar los tubos, que vienen envasados, antes de añadir la muestra. El tubo debe quedar sin restos de la solución de lavado, para ello también secamos las tapas, pero en ningún momento se deben dejar los tubos secos durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente. 4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª ambiente. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de Solución SH (evitar que se forme espuma) a cada tubo AT. Añadir 5 µl de producto de PCR desnaturalizado de cada uno de los tubos de amplificación (incoloro y verde) al tubo AT. Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar en el termobloque durante 1 hora a 50ºC, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar los tubos y desechar la Solución SH con pipeta o vacío. UTILIZAR UNA PUNTA O PIPETA PASTEUR DIFERENTE PARA CADA TUBO en el caso de utilizar vacío. Dejamos programado el termobloque a 30ºC y en movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura. 5. Lavado: añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o vacío. Si llegado a este paso, el termobloque no hubiera llegado a los 30ºC se dejan los tubos con Solución TL diluida hasta que el termobloque alcance la temperatura. 6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridación, se debe preparar la solución de conjugado y mantener en hielo. Se recomienda centrifugar la solución CJ durante 10 segundos antes de usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Hacer este proceso en hielo. Para ello, mezclar en un tubo 100 µl de Solución DC y 1 µl de Solución CJ por cada AT (preparar mezcla para un AT extra por cada serie de diez, para compensar los errores de pipeteo). La Solución - 22 -

CJ diluida conservada a 4º C es válida hasta 4 horas después de su preparación. No utilizar una vez transcurrido este tiempo. Vortear la solución una vez diluida para homogenizar y añadir al tubo AT 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos* a 30ºC, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, desechar la solución del tubo AT con pipeta o vacío rápidamente, asegurarse de que se ha retirado todo el volumen y el cristal quede seco. Bajamos la temperatura del termomixer a 25 ºC para su utilización en el paso 8. * El margen de esta incubación es de 13-18 minutos, Genómica no se responsabiliza de los resultados obtenidos fuera de este rango de tiempo. 7. Lavado 1: Añadir inmediatamente 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces, desechar la solución con la pipeta o vacío. Si este lavado no se realiza rápidamente puede causar en la lectura una señal no legible. Asegurarse de que se ha retirado todo el volumen y el cristal quede seco. 8. Lavado 2: Este lavado es el más importante. Añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces, desechar la solución con la pipeta o vacío. Es importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica. No es necesario el cambio de punta para cada tubo, pero sí es importante no tocar el cristal. 9. Revelado con Solución RE: Se recomienda trabajar en tandas de 12 tubos AT. Coger en el momento de su uso y mantener durante su manipulación en hielo Quitar la solución TL, asegurarse de que se ha retirado todo el volumen y el cristal quede seco. Añadir 100 µl de solución RE al tubo AT e incubar 10 minutos exactos* a 25º C en el termobloque sin agitación. * El margen de esta incubación es de 10-15 minutos, Genómica no se responsabiliza de los resultados obtenidos fuera de este rango de tiempo. Advertencia! Es muy importante utilizar el Termobloque sin agitación y leer las muestras inmediatamente después de la incubación. 10. Leer en forma Análisis seriados en la que se toman las imágenes de todos los tubos para posteriormente ser analizadas automáticamente. 8.4.2. Visualización del producto CLART ENTHERPEX AS Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización: - 23 -

EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR. 1. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de placas ha estado a 53ºC al menos durante 30 min. 2. Calentar la solución de hibridación (SH) específica para AS hasta que desparezcan los cristales precipitados. Esta recomendación es muy importante. 3. Encender el CAR (Clinical Array Reader) al comienzo del proceso. La autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario, si se desea, introducir el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura. El aparato debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado. 4. PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO REUTILIZAR SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON ANTERIORIDAD. 5. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner en marcha el programa de desnaturalización. Colocar los tubos de amplificación separados en el termociclador durante el proceso y nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización. 6. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro pero sí es necesario usar una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se añada un nuevo reactivo, aunque se trate de TL. Sí es necesario utilizar puntas con filtro durante la adición de amplificados al pocillo AS. 7. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja restos en el fondo del pocillo. 8. En el caso de que se realicen un número alto de tiras a la vez, se recomienda añadir los reactivos de visualización con pipetas multicanal y cubetas específicas; para esto se debe seleccionar una cubeta para cada tipo de reactivo y se deben lavar primero con lejía al 10% y después con agua destilada cada vez que se concluya el ensayo. 9. Al aspirar las diferentes soluciones dentro de los pocillos de la tira se dejará un ligero remanente de volumen (aproximadamente 35 µl) de manera que el cristal en ningún momento quede seco. Ver figura 3: - 24 -

Figura 3 VISUALIZACIÓN: 1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador lo más separados posible e incubar a 95º C durante 10 minutos, NUNCA SOBREPASAR LOS 10 MIN. Sacar los tubos de la incubación a 95º C y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo. 2. Preparación de la Solución TL diluida: Por cada tira AS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado diluida, añadiendo 1ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada. 3. Prelavado de los AS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar añadiendo 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del AS, resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la superficie del array. Se recomienda realizar este lavado mientras se desnaturalizan los amplificados y mantener la solución de lavado en la tira hasta la adición de los mismos. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío. El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente. 4. Hibridación: antes de usar la Solución SH, hay que asegurarse que han desaparecido los cristales completamente. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de solución SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los AS. Añadir al mismo 5 µl del amplificado del tubo incoloro y 5 µl del amplificado del tubo verde. Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación, con cuidado de no tocar el cristal. Se recomienda cargar cada tira de manera independiente y separada del resto para evitar contaminaciones. Incubar la tira cubierta con la tapa de plástico transparente en el termomixer de placa tapado durante 1 hora a 53º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH de AS con pipeta o bomba de vacío dejando un remanente de volumen (ver figura 3). (Dejamos programado el termomixer de placa a 30º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 5. Doble Lavado: Añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del AS, resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío multicanal (ver figura 3). Repetir la operación. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los pocillos con esta solución hasta que el termomixer alcance la temperatura. - 25 -

6. Bloqueo y conjugado: se recomienda centrifugar la solución CJ durante 10 segundos antes de usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Por cada AS, se añade 1 ml de solución DC y 15 µl de Solución CJ. Desechar la Solución TL diluida y añadir a cada pocillo del AS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el termomixer de placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la solución rápidamente con pipeta o bomba de vacío multicanal (ver figura 3). (Dejar programado el termomixer de placa a 25º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 8. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del AS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar la solución con la pipeta o vacío sin dejar seco el array. Repetir la operación dos veces más. Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica. 8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida, añadir 100 µl de solución RE a cada pocillo del AS e incubar 10 minutos a 25 º C en el termomixer de placa sin agitación. Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación 9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe quedar seco 10. CAR (Clinical Array Reader): Se coloca la placa en el CAR para tomar las imágenes de todos los pocillos para posteriormente ser analizadas automáticamente. 9. LECTURA DE RESULTADOS El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe en el que se indican los resultados. En la pantalla del equipo aparecerá una tabla con tres columnas, en la columna de la izquierda aparecerán los virus que se caracterizan en el micro-array. En la columna del centro aparece el resultado de positivo o negativo para cada virus, y en la columna de la derecha aparecerá la conformidad del control de amplificación. 10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos negativos debidos fundamentalmente a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las muestras en las que se quiere analizar la presencia del virus (hemoglobina, restos de parafina, sales, etc). Con el kit CLART - 26 -

ENTHERPEX se han eliminado estos falsos negativos de amplificación gracias a la introducción de un control interno en ambos tubos de reacción donde se analiza la muestra. Cada tubo de amplificación contiene los siguientes oligos: Oligos que amplifican un plásmido modificado incluido en el tubo de amplificación y que se usa como control de amplificación de la reacción de RT-PCR/PCR. Oligos específicos de Herpes virus y Enterovirus. El tubo de RT-PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de los virus frente a la del control de amplificación. De manera que, en ciertas condiciones (ej. cuando hay un elevado número copias de un virus o cuando la muestra presenta coinfecciones con varios virus a la vez), puede suceder que no se amplifique el control y aparezca una lectura de: CONFORME. Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes interpretaciones de los resultados de lectura: 1. Muestras positivas: 1.1. Con control de amplificación positivo Virus Resultado Control Especie Positivo Conforme Control Señal Resultado Control Interno > 0.150 Conforme Marca de alineamiento VIRUS Control de amplificación Este se considera un RESULTADO VÁLIDO. Podemos decir que se trata de un verdadero resultado positivo. 1.2. Con control de amplificación negativo Virus Resultado Control Especie Positivo Conforme - 27 -

Control Señal Resultado Control Interno < 0.150 Sin señal Marca de alineamiento VIRUS Este se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque el control de amplificación se muestre SIN SEÑAL. Esto se debe al efecto de la competencia con los virus. Podemos decir que se trata de un verdadero resultado positivo. 2. Muestras negativas Virus Resultado Control Especie Negativo Conforme Control Señal Resultado Control Interno > 0.150 Conforme Marca de alineamiento Control de amplificación Este se considera un RESULTADO VÁLIDO. En este caso podemos decir que se trata de un verdadero resultado negativo. 3. Muestras inadecuadas, inhibidas Virus Resultado Control Especie Negativo PCR Inhibida - 28 -

Control Señal Resultado Control Interno < 0.150 Sin señal Marca de alineamiento Este se considera un RESULTADO NO VÁLIDO. Esto se debe a que algunas sustancias pueden inhibir la reacción de PCR al perjudicar la actividad de la enzima ADN polimerasa. La solución es verificar que en la muestra o el material genético extraído no hay presencia de ninguna de estas sustancias. Se recomienda repetir la extracción o, si esto no es posible, pedir al facultativo una nueva toma de muestra al paciente. Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de Virus No Concluyente: En aquellos casos en que las réplicas de una sonda sean muy distintas entre sí. En coinfecciones de más de 5 virus. 11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO Control de interferencias conocidas: Existen sustancias que pueden interferir en funcionamiento del kit CLART ENTHERPEX. Principalmente, son sustancias que inhiben la mezcla de enzimas y, por tanto, la reacción de amplificación. Las interferencias más conocidas son: 1 Presencia de hemoglobina o parafina tras la extracción del DNA/RNA. Tanto el ADN extraído a partir de muestras de sangre total o hemoderivados, como el obtenido a partir de muestras de tejidos incluidos en parafina, puede contener restos de hemoglobina y parafina respectivamente. Este problema se puede evitar purificando el DNA/RNA tras su extracción 2 Restos de Isopropanol en el ADN/ARN. En el proceso de extracción del ADN/ARN a partir de muestras de suero, plasma y LCR, se tiene que precipitar este con Isopropanol. Si no se procede a un secado correcto del precipitado, la presencia de Isopropanol en la muestra puede producir una inhibición de la - 29 -