BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 3: SEPARACIÓN POR GRADIENTES DE DENSIDAD (FICOLL-HYPAQUE) 1. INTRODUCCIÓN Es necesario para realizar los estudios funcionales de células mononucleares de sangre periférica, el aislamiento de éstos a partir de muestras de sangre, órganos linfoides u otros tejidos. Este aislamiento se puede realizar por varios métodos pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la Separación por gradiente de densidad, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque. El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica. 2. OBJETIVOS Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la separación de CMSP. Realizar un procedimiento rápido y accesible para la obtención de CMSP para su posterior utilización en la extracción de ARN. 3. MARCO TEORICO Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrífuga. Consiste en la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra se dispone por encima o se mezcla con un gradiente de densidad más pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una concentración muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad. Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa, percol, cloruro de cesio, y el Ficoll. Los gradientes pueden ser
autogenerados como es el caso de los basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio proceso de centrifugación, o preformados como es el caso de la sacarosa o del percol. En este último caso la preparación se realiza antes de la centrifugación mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste en dos cubetas conectadas por la base y con agitación en las que se colocan las soluciones con los dos extremos de concentración. A medida que se va sacando de una de ellas la otra reemplaza el líquido extraído y modifica linealmente la concentración. En la centrifugación por gradiente de densidad, la separación de una muestra se logra por sedimentación a través de un gradiente de densidad, esto es, una solución que incrementa en densidad desde la parte superior hacia la inferior del tubo de centrifuga. Dos aproximaciones distintas son posibles usando esta técnica; centrifugación zonal y centrifugación de equilibrio en gradiente. Las soluciones de Ficoll-Hypaque consisten en un medio de polisucrosa y radiopaco, la cual está ajustada a una densidad de 1,077. Cuando la sangre se extiende sobre el Ficoll y se expone a fuerzas centrífugas, las células mononucleares permanecen entre el plasma y la solución HISTOPAQUE, mientras que los eritrocitos y los granulocitos gravitan hacia el fondo. Sería viable crear un sistema por el que las células de las series mieloides también pudieran ser cosechadas empleando un procedimiento de un solo paso. 4. PRE-LABORATORIO Explique detalladamente el fundamento de la separación por gradientes de densidad. Detalle cómo se realiza una separación por sacarosa, cloruro de cesio, percol. 5. PRECAUCIONES Las muestras obtenidas si se destinan para cultivo se les deben realizar 3 lavados con SSE, pues el Ficoll-Hypaque es una solución a largo plazo tóxica para las células. 6. MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES Tubos Falcón para centrífuga de 15 ml estériles (2 tubos) Tubos Falcón de plástico de 50 ml estéril (1 tubo) Ficoll-Hypaque (4 ml) Suero Fisiológico estéril (50 ml) Pipetas Pasteur de plástico estériles Guantes de látex o vinilo estériles Gradilla
Centrífuga Campana de flujo laminar (en caso de no disponer de una, disponer de un ambiente donde trabajar con la máxima esterilidad posible) 7. PROCEDIMIENTO 1. Obtener la muestra de sangre en tubo lila o verde con medidas de bioseguridad. 2. Diluir la sangre en proporción 1:1 en Solución Salina Estéril (SSE) 3. Dispensar 2 ml de Ficoll-Hypaque en tubo Falcón de 15 ml 4. Cargar 8 ml de sangre diluida con suero fisiológico y dispensar muy cuidadosamente y lentamente sobre el Ficoll-Hypaque en el tubo de centrifuga. Poner el tubo inclinado y apoyar la punta de la pipeta sobre la pared del tubo para dejar deslizar la sangre suavemente sobre el Ficoll y poder formar una interfase (Ficoll abajo y sangre arriba). 5. Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 30 minutos, a temperatura ambiente y sin freno al final de centrifugación. 6. Retirar cuidadosamente de la centrifuga y llevar a la gradilla. Verificar la formación de las fases de gradiente de densidad (arriba el plasma sanguíneo, debajo la banda de células mononucleares, debajo el Ficoll- Hypaque, debajo las células PMNs y debajo los eritrocitos aglutinados).
7. Extraer toda la banda de células mononucleares utilizando pipetas Pasteur de plástico y dispensar en tubo de centrifugación nuevo. Dispensar la banda en un único tubo de centrifugación y luego completar hasta 10 ml con suero fisiológico. Cubrir tubo y llevar a centrifugación. 8. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la centrifugación. 9. Extraer tubo de la centrífuga sin agitarlo. 10. Decantar sobrenadante y resuspender células del fondo con un pulso de vórtex o con golpes con las yemas de los dedos. 11. Completar nuevamente hasta los 10 ml con suero fisiológico, cubrir tubo y llevar nuevamente a centrifugar igual que en el paso anterior. 12. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la centrifugación. 13. Decantar sobrenadante y resuspender células del fondo con un pulso de vórtex o con golpes con las yemas de los dedos, y pasar a un tubo eppendorf de 1,5 ml. 14. Agregar 1 ml de TRIzol y dejar incubar. 15. Realizar protocolo de extracción de ARN.
8. POST-LABORATORIO 1. A qué se le denomina una centrifugación diferencial? 2. En qué consiste una centrifugación isopícnica? 3. Consulte y explique detalladamente otras técnicas de centrifugación 9. BIBLIOGRAFÍA - English D, Andersen BR: Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll-hypaque. J Immunol Methods 5:249, 1974 - Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad, Biologend, Bioline, etc. - David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986 - Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons, 1988 - Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2 nd edition, Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. - Catálogos de los Kit de Promega, Corpogen, Dnazol y Probes 10. AUTOEVALUACION. NUMERO DE LA PRACTICA SI LOGRO (Objetivos cumplidos) NO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD