UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE ODONTOLOGÍA EFECTOS DE LA TERAPIA LASER DE BAJA POTENCIA EN LA CICATRIZACION DEL HUESO ALVEOLAR. MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE CIRUJANO-DENTISTA MARIA JOSE LANDAETA B. PROFESOR GUIA: DR. IVAN SUAZO G. TALCA-CHILE 2007 1
Autorización para la publicación de memorias de Pregrado y tesis de Postgrado Yo, María José Landaeta Bendezú, cédula de Identidad Nº 15.323.978-9 autora de la memoria o tesis que se señala a continuación, autorizo a la Universidad de Talca para publicar en forma total o parcial, tanto en formato papel y/o electrónico, copias de mi trabajo. Esta autorización se otorga en el marco de la ley Nº 17.336 sobre Propiedad Intelectual, con carácter gratuito y no exclusivo para la Universidad. Título de la memoria o tesis: EFECTOS DE LA TERAPIA LÁSER DE BAJA POTENCIA EN LA CICATRIZACIÓN DEL HUESO ALVEOLAR Unidad Académica: Carrera o Programa: DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS, BIOMÉDICAS Y MICROBIOLOGÍA ODONTOLOGÍA Título y/o grado al que se opta: CIRUJANO DENTISTA/ LICENCIADO EN ODONTOLOGÍA Nota de calificación 6.9 Firma de Alumno Rut: 15.323.978-9
ÍNDICE. Introducción 3-5 Pregunta de Investigación 6 Hipótesis 7 Objetivos 8 Revisión bibliográfica 9-34 Materiales y métodos 35-44 Resultados 45-49 Discusión 50-51 Conclusión 52 Resumen 53 Referencias Bibliográficas 54-60 2
1. INTRODUCCIÓN. El hueso es un tejido vivo, muy activo que cumple tres funciones principales: de soporte para el sistema músculo esquelético, de protección para órganos vitales (cerebro, corazón, pulmones) y como reserva metabólica en la hematopoyesis y en la homeostasis del calcio. También se describe como función del hueso, el almacenamiento de lípidos por la médula ósea como reserva de energía. El tejido óseo es un tipo especializado de tejido conectivo cuya matriz extracelular se halla mineralizada en su mayor parte (Gardner & Hiatt, 2002). El hueso es un tejido conectivo mineralizado, compuesto por una parte no celular o material osteoide, la cual tiene dos fases (proteica y mineral) y otra parte celular (osteoblastos, osteocitos y osteoclastos) (Serrano, 1998). El tejido óseo se caracteriza por su gran dureza y consistencia. Este tejido representa la parte más importante del esqueleto y a pesar de su dureza y resistencia, posee cierta elasticidad. Al igual que el cartílago, el tejido óseo es una forma especializada del tejido conectivo denso, además provee al esqueleto de la dureza para funcionar como sitio de inserción para los músculos, soporte del peso y le da rigidez al organismo para protegerlo de la fuerza de gravedad (Bloom & Fawcett, 2000). El tejido óseo está en proceso permanente de recambio, sin modificar su integridad anatómica y estructural. El recambio no se realiza simultáneamente en toda la superficie ósea sino únicamente en áreas predeterminadas, llamadas Unidades de Remodelado Óseo. El proceso de recambio óseo tiene varias etapas: activación, 3
reabsorción, reversión, y formación (Bloom & Fawcett, 2000). El tejido óseo esta permanentemente eliminando tejido viejo (procesos de reabsorción o de remodelado) y formando tejido nuevo (actividad formativa o de modelado). El conjunto de estas actividades se conoce como recambio óseo y debe realizarse en una forma balanceada, de tal manera que a pesar de esta gran actividad metabólica, el hueso permanece con su integridad anatómica y estructural (Carranza, 1996). El desacople del recambio óseo determina patologías óseas relacionadas con la función de soporte o de sostén. Si el balance es negativo determina una osteopatía debilitante, como es la osteoporosis (Serrano, 1998). El surgimiento de la terapia láser y su aplicación en Estomatología abre nuevas perspectivas terapéuticas. La terapia con láser de baja potencia (LLLT, sigla en inglés para Low Level Laser Therapy ), con efectos analgésicos, antiinflamatorios y regenerativos, ha tenido resultados satisfactorios en el tratamiento de diferentes afecciones estomatológicas. Distintas investigaciones realizadas en Cuba avalan esta afirmación. Existen estudios realizados sobre la acción del láser de baja potencia sobre las células osteoblásticas en las cuales la velocidad del desarrollo celular y la síntesis del DNA se incrementaron en la fase de crecimiento de cultivo. Otros estudios han demostrado una rápida regeneración ósea, primero en animales de experimentación y posteriormente con pacientes que presentaban fracturas, en quienes fue evidente la aceleración de la regeneración ósea (Almeida, 2004). 4
Algunas experiencias de la acción del láser helio-neón sobre las células osteoblásticas y la regeneración ósea periodontal han demostrado in vitro que la irradiación láser activa las células osteoblásticas y acelera su desarrollo y calcificación. Teniendo en cuenta los resultados expuestos se decidió realizar la presente investigación con el objetivo de evaluar el efecto de la terapia con láser de baja potencia sobre la cicatrización del hueso alveolar. 5
2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN. Qué cambios morfológicos genera la terapia con láser de baja potencia (LLLT) en la cicatrización del hueso alveolar? 6
3. HIPÓTESIS. La terapia con láser de baja potencia (LLLT) favorece la formación de osteonas en el hueso alveolar. 7
4. OBJETIVOS. 4.1 Objetivo General. Determinar los cambios morfológicos del hueso alveolar ante la terapia con láser de baja potencia (LLLT) durante la cicatrización. 4.2 Objetivos Específicos. -Determinar un grupo experimental y uno control de ratas Sprague Dawley para ser sometidas a una lesión mecánica. -Someter al grupo experimental de ratas a un protocolo de aplicación de LLLT. -Determinar el número de osteonas en los cortes histológicos obtenidos del grupo sometido a LLLT. -Comparar los resultados de un grupo experimental con los de un grupo control. 8
5. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 5.1 Tejido Óseo. 5.1.1 Estructura y características. El tejido óseo es una variedad de tejido conjuntivo especializado que se caracteriza por su rigidez y su gran resistencia tanto a la tracción como a la compresión. Está formado por la matriz ósea, que es un material intercelular calcificado y por un componente celular. Dentro del componente celular encontramos: Osteoblastos: son células diferenciadas que sintetizan el colágeno y sustancia fundamental. Son encargados de sintetizar y secretar la parte orgánica de la matriz ósea durante su formación. También participan en el proceso de mineralización de la matriz orgánica y son ricas además en fosfatasa alcalina y pirofosfatasa, enzimas que son capaces de generar iones PO = 4, elevando su concentración en el medio extracelular y creando centros de nucleación para el deposito de las sales minerales. Los osteoblastos tienen dos destinos posibles: ser rodeados por la matriz ósea que producen y pasar a ser osteocitos inmersos en lagunas óseas, o permanecer en la superficie del tejido óseo recién formado, aplanándose y constituyendo las células de revestimiento óseo (Serrano, 1998). Se ubican siempre en la superficie del tejido óseo ya que este sólo puede crecer por aposición. 9
Los osteoblastos poseen abundante retículo endoplásmico rugoso, lo cual los capacita para su gran actividad de síntesis proteica. Los osteoblastos sintetizan la mayoría de las proteínas encontradas en el hueso: colágeno tipo I, osteocalcina, osteonectina, osteopontina, proteoglicanos y proteínas morfogénicas del hueso. Además sintetiza fosfatasa alcalina y receptores de superficie para vitaminas, hormonas y citoquinas. La osteopontina y la osteonectina se encargan de la adhesión celular (Gardner & Hiatt, 2002). Los osteoblastos tienen progenitores mesenquimatosos los cuales se diferencian en "unidades formadoras de colonias de fibroblastos" (CFU-F). La diferenciación se lleva a cabo en un microambiente especial donde participan diversas hormonas, factores de crecimiento y citoquinas. Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante beta (TGFβ), estimula la quimiotaxis de precursores de osteoblasto y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), activa el osteoblasto para formación de hueso (Sánchez, 2004). Las CFU-F tienen características histopatológicas de "formadoras de hueso", es decir son "fosfatasa alcalina positivas", productoras de colágeno I e incluso formadoras de nódulos calcificados en medios adecuados. Bajo el efecto de diferentes estímulos mediados por la interleuquina-6 (IL-6), la IL-11, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y la oncostatina M, se va diferenciando hasta llegar al osteoblasto maduro (Cano Sánchez, 2003). Los osteoblastos juegan también un papel fundamental en la resorción ósea, dado que ésta se inicia gracias a la recepción de un mensaje a través de estímulos como el 10
estrés mecánico o de moléculas como la hormona paratiroidea (PTH), la vitamina D, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), las cuales estimulan dichas células para sintetizar la IL- 1b y la IL-6, además de prostaglandinas, capaces de activar los osteoclastos (Alvarado, 2003). En la medida que el hueso se mineraliza el osteoblasto deja de tener actividad de síntesis de material osteoide y se convierte en osteocito el cual va quedando incluido en el hueso rígido y empieza a tener funciones de receptor de fuerzas externas principalmente determinadas por la actividad muscular. Osteocitos, son las células propias del tejido óseo formado responsables de la mantención de la matriz ósea, que se ubican en cavidades o lagunas rodeadas por el material intercelular calcificado. Son capaces de sintetizar y de reabsorber, en forma limitada, a componentes de la matriz ósea (osteolísis), actividades que contribuyen a la homeostasis de la calcemia. Los osteocitos son las células más abundantes del hueso, están embebidas en la matriz ósea mineralizada y están interconectadas entre sí y con los osteoblastos mediante prolongaciones celulares, ubicadas dentro de canalículos que a su vez son ricos en un líquido llamado fluido periosteocítico, cuya composición es similar al plasma. Todo este complejo se llama "complejo lacunado canalicular. La nutrición de los osteocitos depende de estos canalículos que penetran la matriz ósea y conectan a los osteocitos vecinos entre sí y con canales vasculares que penetran al hueso o que se ubican en las membranas conjuntivas que revisten las superficies del hueso (periostio y endostio). De hecho ningún osteocito se encuentra a más de una fracción de milímetro de un capilar sanguíneo (Blomm & Fawcett, 2000; Garner & Hiatt, 2002). 11
El osteocito es capaz de modificar la matriz ósea circundante por su actividad de síntesis y reabsorción. Morfológicamente tienen tres estados funcionales: -Osteocitos latentes: posee matriz calcificada madura. -Osteocitos formativos: célula joven capaz de formar tejido. -Osteocitos reabsortivos: estimulado por incremento de secreción de hormona paratiroidea. Contienen cisternas de retículo endoplasmático. Elimina matriz, mecanismo llamado osteolísis. Tiene enzimas (en lisosomas) que van a secretar y a reabsorber la MEC con el fin de liberar sales de Calcio al organismo (Serrano, 1998). El diseño arquitectónico que va adoptando el hueso a través del tiempo depende de las cargas que se le imponen. El sensor de estas cargas parece ser el osteocito con sus prolongaciones e interconexiones intercelulares ubicadas dentro de la matriz ósea. La intensidad de los estímulos es interpretada por los osteoblastos y osteoclastos, que a través de su función coordinada de recambio óseo constante permite generar más o menos rigidez al final del proceso. Se presenta readecuación estructural, cambiando la orientación de las trabéculas, el grosor de las mismas, o la reubicación del material óseo, por ejemplo localizándolo más hacia la periferia si se requiere una mayor resistencia. Todo este mecanismo de recepción y respuesta se conoce como mecanostato óseo (Carranza, 1996). El mecanismo por el cual el osteocito sensa la presencia de torsión ósea, parece ser por cambios piezoeléctricos, que modifican la actividad eléctrica de la célula y sus prolongaciones, quizás en paralelo con fenómeno similar en el fluido periosteocítico. Existen teorías que plantean que el fluido solo cumple el papel receptor, generándose impulsos eléctricos por salto de electrones en la periferia. También se postulan los movimientos de la albúmina a través de espacios interfibrilares. Finalmente se generan cambios de potenciales en la membrana osteoblástica con el consecuente flujo iónico, especialmente mediante canales de calcio (Fernández-Tresguerres et al., 2006). 12
Osteoclastos, son células móviles, gigantes y multinucleadas responsables de la reabsorción del tejido óseo, a través de una activa digestión proteolítica. La acción del osteoclasto sobre el hueso se ejerce al crear un ambiente ácido y al excretar enzimas proteolíticas, además de tener actividad de fagocito sobre los detritos de la matriz ósea degradada. La acidificación de la zona en contacto con el hueso se debe a la acción de hidrogeniones, en forma similar como actúan los túbulos renales y las células parietales del estómago, donde intervienen bombas de protones y la acción de la anhidrasa carbónica (Gardner & Hiatt, 2002). Los osteoclastos se localizan adosados a la superficie de tejido óseo que debe ser removido, y pueden encontrarse en depresiones superficiales de la matriz ósea llamadas lagunas de Howship. Estas células participan en los procesos de remodelación de los huesos. Son los macrófagos del tejido óseo. Por acción de la hormona paratiroidea (PTH) reabsorben matriz ósea (Carranza, 1996). Células osteoprogenitoras, son células alargadas con citoplasma poco prominente, que proceden de las células mesenquimáticas primitivas y forman una población de células troncales capaces de dividirse y dar origen a los osteoblastos. Células de revestimiento óseo, son células aplanadas que revisten la superficie ósea del interior de los huesos, y en su mayor parte corresponden a osteoblastos inactivos que están asociados entre sí y con prolongaciones de los osteocitos. 13
5.1.2 La matriz intercelular ósea. El hueso es un tejido conectivo mineralizado, compuesto por una parte no celular (material osteoide), la cual a su vez presenta dos fases: una proteica con componente mineral, y otra celular. La matriz intercelular ósea está formada por matriz orgánica u osteoide que corresponde al 50% del peso seco del hueso. Más del 90% de ella corresponde a fibrillas de colágeno I organizadas en laminillas de unos 5 µm de grosor. En cada laminilla ósea, las fibrillas colágenas están paralelas entre si, pero las laminillas sucesivas alternan ordenadamente la orientación de sus fibrillas en ángulos rectos. Esta disposición alternada de las fibrillas colágenas en laminillas sucesivas destaca particularmente al observar cortes de hueso con microscopía de luz polarizada. El resto de los componentes orgánicos son principalmente glicoproteínas como la osteonectina, proteínas ricas en ácido g-carboxiglutámico como la osteocalcina, y proteoglicanos de condroitín y queratán-sulfato (Bloom & Fawcett, 2000). Son moléculas ricas en grupos ácidos con gran tendencia a asociarse entre sí, capaces de unirse a calcio y que juegan un rol importante en el proceso de mineralización de la matriz ósea. Sales minerales inorgánicas depositadas en el osteoide, que confieren al tejido su rigidez y dureza y actúan como una reserva de sales minerales, sensible a estímulos endocrinos. Las más abundantes son fosfato de calcio amorfo y cristales de hidróxidos de calcio y de fosfato llamados hidroxiapatita (Ca 10 (PO 4 )6(OH) 2 ). Los cristales de hidroxiapatita son aplanados (30nm por 3 nm) y se adosan a lo largo de las fibrillas colágenas, a intervalos de unos 67 nm. La superficie del cristal está hidratada y existe una 14
vaina de agua e iones rodeándolo, lo que facilita el intercambio de iones entre el cristal y el líquido intersticial (Fernández-Tresguerres et al., 2006). La fase proteica está compuesta principalmente por colágeno (70% del peso seco) y el 95% de las proteínas. El colágeno es predominantemente tipo I el cual consiste en tres cadenas de polipéptidos dos α1 y una α2, que conforman estructura en hélice. La secuencia de cada cadena contiene glicina-x-y en trímeros repetidos, donde X y Y son otros aminoácidos (los más comunes son la prolina y la hidroxiprolina). Las hélices son unidas por piridinolina y por deoxipiridinolina, las cuales son liberadas en el proceso de resorción. Las fibras de colágeno son la matriz para el depósito del mineral. Las otras proteínas no colágenas son la osteocalcina, de importancia en la formación de hueso nuevo, siendo su formación dependiente de las Vitaminas K y D, constituida por tres residuos gammacarboxiglutámicos las cuales le confieren afinidad por el calcio y capacidad reguladora durante la mineralización, es sintetizada por el osteoblasto, siendo sus niveles séricos un indicador de la actividad de estas células (actividad osteoblástica); y por el osteocito, al ser sometido a fuerzas mecánicas que estimulan la remodelación ósea. La osteonectina, actúa como un complejo con la fosfatasa ácida que une colágeno, calcio e hidroxiapatita. Las sialoglicoproteínas afectan la tasa de formación y el tamaño final de las fibras de colágeno. También participan factores de crecimiento, cuya acción se ejerce a nivel local. 15
La fase mineral consiste en hidroxiapatita: Ca 10 (PO 4 )6(OH) 2 El periostio es la envoltura conectiva que rodea el hueso. Tiene dos capas: Capa fibrosa: contiene fibras colágenas, fibrocitos y fibroblastos. Capa osteógena: contiene osteoblastos. Sintetizan matriz ósea, por acción de la hormona tirocalcitonina 5.1.3 Histología del Tejido Óseo. Histológicamente se distinguen 2 tipos de hueso: * Hueso esponjoso * Hueso compacto Hueso Esponjoso La unidad estructural del tejido óseo esponjoso es la trabécula ósea. Este tipo de hueso se localiza en la epífisis de los huesos largos y en el díploe los huesos planos. Su estructura es en forma de redes similares a una esponja caracterizada por trabéculas, en donde se ubican los osteocitos; y su función es actuar como andamio que provee rigidez y soporte en la mayoría del hueso compacto (Gardner & Hiatt, 2002). 16
Las trabéculas óseas contienen osteocitos dentro de osteoblastos, rodeados de matriz ósea. La parte interna del tejido óseo esponjoso, entre las trabéculas óseas, se encuentra la médula ósea roja (tejido hematopoyético). Hueso Compacto Este se localiza en porciones externas de todos los huesos y ramificaciones de los huesos largos. Poseen una estructura dura y predominan en la matriz ósea. Aquí se localizan los osteocitos dentro de las lagunas alrededor de los conductos de Havers (Gardner & Hiatt, 2002). La unidad estructural del tejido óseo compacto es el Sistema de Havers u osteona. Este tipo de hueso se localiza en la diáfisis de los huesos largos. El Sistema de Havers está constituido por: Canal de Havers: contiene el paquete vasculonervioso que pasa por el agujero nutricio del hueso. Laminillas óseas: su número aumenta a medida que crece el hueso. Osteoblastos: dispuestos en forma concéntrica, en cuyo interior se encuentran los osteocitos. Canalículos calcóforos: conecta el osteoblasto con el canal de Havers. Permite la nutrición y eliminación de desechos del osteocito (sus prolongaciones viajan a través del canalículo) Línea de cemento: limita un Sistema de Havers. 17
El canal de Havers está dispuesto paralelo a la longitud del hueso y en el centro de cada Sistema de Havers. El canal de Volkmann es una formación dispuesta transversalmente a la longitud del hueso y permite unir dos Sistemas de Havers (Gardner& Hiatt, 2002). El interior del hueso compacto (diáfisis) contiene médula ósea amarilla. Este hueso provee rigidez y soporte, y forma una capa exterior sólida sobre los huesos, lo cual evita que sean fácilmente rotos o astillados. Hueso Alveolar Porción ósea delimitada por un plano que pasa por la cortical del alveolo en su parte más profunda y que comprende a los nichos óseos destinados a alojar las raíces dentarias. El alveolo en formación presenta cortical delgada y trabeculado denso, rica vascularización. Siendo menos mineralizado, resulta más plástico que el hueso de un adulto (Figún & Garino, 2001). La pared de un alveolo definitivo esta formado por una cortical lisa, constituida por un hueso fasciculado para la inserción de las fibras del periodonto, que alterna con sectores del tipo laminar, producto de la actividad periodontal, coexistiendo con algunas cuencas medulares. Presenta en su superficie una serie de pequeños orificios correspondientes a los 18
canales de Volkmann, por donde llegan al periodonto y al diente elementos vasculares y nerviosos. Estos orificios en número a nivel del tercio apical, constituyendo la criba alveolar (Figún & Garino, 2001). La pared alveolar constituye un tipo de tejido compacto especial originado en la capacidad osteogenética del periodonto que, como conserva esa condición durante toda la vida, posibilita que la cortical interna aumente el grosor con el curso de los años. La orientación de la laminillas coincide con el eje del diente, pero con una trayectoria ondulada que evidencia la irregularidad de su formación, en la que se han alternado procesos de neoformación y reabsorción (Carranza, 1996). El tejido esponjoso interpuesto entre ambas corticales esta constituido por trabéculas de variadas formas, tamaños, espesor y dirección. Las cavidades que las trabéculas delimitan no están aisladas sino ampliamente comunicadas entre si, de modo que el contenido de la médula ósea forma una sola masa. La forma del hueso alveolar esta determinada por el arco dentario que aloja. Así las cavidades se disponen siguiendo el arco que mayormente responde a formas ovales o elípticas en el maxilar y parabólica en la mandíbula. Este hueso alveolar suma volumen óseo al maxilar y la mandíbula, su crecimiento y desarrollo es modelado e inducido por la deglución, fonación, respiración, pero sobre todo por la fuerzas de la oclusión y la biomecánica ejercida por la fisiología del periodonto. Es 19
así como se llega a completar la anatomía de estos huesos sometidos a la acción de grandes masas musculares, a fuerzas oclusales deglutorias y de la respiración. Hueso Basal Es el hueso que subyace, soporta y es continuo con el proceso alveolar. Comprende todo el tejido óseo del maxilar y la mandíbula que proporciona soporte para las prótesis dentales, excluyendo los procesos alveolares. Aunque la demarcación entre el hueso alveolar y basal no es específica, se piensa generalmente que se ubica en el nivel de los ápices de las raíces. 5.2 Reparación Ósea. La reparación es la sustitución de los tejidos lesionados por proliferación de los que sobreviven en la zona, tanto especializados como no especializados. Este nuevo tejido estructural y funcionalmente similar pero no igual al perdido (Garrigo & Valiente, 1996). Una fractura ósea causa daño y destrucción de la matriz ósea, muerte celular, desgarros en el periostio, y posible desplazamiento de los extremos del hueso roto. Se seccionan los vasos sanguíneos cerca de la fractura y la zona se llena de hemorragias localizadas, que dan lugar a la formación de un coágulo sanguíneo en el sitio de la lesión. Para que la reparación se inicie, el coágulo sanguíneo, los restos celulares y los de la matriz deben ser eliminados 20
por macrófagos. El sitio del coágulo es invadido por vasos sanguíneos pequeños y fibroblastos del tejido circundante y se forma tejido de granulación. El periostio y el endostio cercanos a la zona de fractura responden con una intensa proliferación, formando un tejido rico en células osteogénicas con capacidad de diferenciarse, formando un callo interno a modo de collar en torno a la fractura, el que penetra en los extremos óseos fracturado. En ese anillo o collar conjuntivo, así como en el tejido conjuntivo que se localiza entre los extremos óseos de la fractura, aparece tejido óseo inmaduro, tanto por la osificación endocondral de pequeños fragmentos de cartílago que se forman en él, como por la osificación intramembranosa. En consecuencia en el punto de reparación pueden encontrarse al mismo tiempo zonas de cartílago, zonas de osificación intramembranosa y zonas de osificación endocondral. Este proceso evoluciona de modo que, al cabo de algún tiempo, aparece un callo óseo externo que envuelve los extremos del hueso fracturado. Este callo está formado por tejido óseo inmaduro que se forma de modo desordenado, pero que une provisionalmente los extremos de la fractura. Después de una fractura, las fuerzas de tracción y presión del hueso durante su periodo de reparación, y posteriormente, con el retorno de la persona a sus actividades habituales, producen la remodelación del callo óseo y su completa sustitución por tejido laminar. En caso de que las fuerzas de tracción y presión sobre el hueso sean idénticas a las existentes anteriormente, su estructura volverá a ser la misma que se observaba antes de la fractura. 21
5.2.1 Histopatología de la reparación y remodelado óseo. En el hueso compacto, las láminas están dispuestas, en su mayor parte, en forma concéntrica alrededor de canales longitudinales del hueso denominados Conductos de Havers por lo que se forman los Sistemas de Havers u Osteonas corticales. En promedio los Conductos de Havers miden 50 μm de diámetro y cada conducto aloja 1 o 2 capilares, además de vasos linfáticos, fibras nerviosas y tejido conectivo. Una osteona cortical típica contiene unas 15 láminas, que en un corte transversal se visualizan como anillos concéntricos que rodean el conducto de Havers. Los osteocitos correspondientes se disponen de manera semejante. Las láminas se componen en su mayor parte de fibras colágenas que transcurren en paralelo en cada lámina. Cada osteona cortical forma un cilindro longitudinal en el tejido óseo, con un diámetro promedio de unos 150 μm y una longitud de 3000 μm. Además de los Sistemas de Havers, se encuentran zonas irregulares de tejido óseo laminar, denominadas láminas intersticiales, que son restos de osteonas degradadas. En los sitios donde los distintos sistemas laminares se encuentran hay limites netos denominados líneas de cemento, que solo contienen escasas fibras colágenas no calcificadas. El tejido óseo trabecular también esta compuesto por láminas, pero no forman sistemas de Havers, dado que no se observan conductos de Havers ni de Volkmann, ni vasos sanguíneos. El elemento básico estructural es la osteona trabecular, que tiene forma de un disco plano de unos 70 μm de espesor y una longitud promedio de 600 μm. El disco esta formado por aproximadamente por 20 láminas de transcurso paralelo a la superficie del disco. El espesor de la trabéculas varía entre 10 y 400 μm. Las trabéculas más delgadas están compuestas por una única osteona trabecular, con ambas superficies ubicadas hacia el 22
espacio medular recubiertas por endosito, mientras que las trabéculas más gruesas se conforman de varias osteonas trabeculares con líneas de cemento intermedias. En el tejido óseo compacto primitivo, las fibras de colágeno de los sistemas de Havers primitivos u osteonas primarias, formadas durante el crecimiento aposicional transcurren en todas direcciones para generar láminas no muy bien definidas. Estos sistemas de Havers primitivos u osteonas primitivas se asemejan a los sistemas de Havers debido a las capas concéntricas irregulares de osteocitos y a la cierta separación, en capas, de las fibras colágenas, pero sin la disposición densa paralela en cada capa. Por remodelación estos sistemas se transforman en sistemas de Havers definitivos u osteonas secundarias, que contienen láminas concéntricas formadas por fibras de colágeno de transcurso paralelo. La remodelación comienza cuando un grupo de preosteoclastos se activa y da lugar a la aparición de de osteoclastos, que comienzan con la resorción del tejido óseo y la formación de un conducto cilíndrico. Así este surco de resorción comienza en la superficie de una trabécula y desciende hasta una profundidad de unos 70 μm (espesor promedio de una osteona trabecular). La actividad osteoclástica continúa aumentando el diámetro y longitud de estas cavidades, que son invadidas por vasos sanguíneos. En este punto, cesa la reabsorción ósea, y los osteoblastos transformándose en células de recubrimiento óseo, forman una capa delgada sobre la superficie de la trabécula depositando nuevas láminas concéntricas alrededor de los vasos sanguíneos para crear nuevos sistemas haversianos. Este proceso de reabsorción ósea, seguido del reemplazo de hueso, se conoce como acoplamiento. El tejido óseo laminar recién formado que ocupa el surco de resorción representa una nueva osteona trabecular. El remodelado óseo se lleva a cabo mediante la acción sucesiva (acoplamiento) de osteoclastos y osteoblastos sobre una misma superficie ósea. Cada ciclo de remodelado consta de tres fases: reabsorción, reposo o inversión y formación. En la fase de reabsorción, 23
un grupo de osteoclastos se diferencia a partir de sus precursores y erosiona una superficie ósea dando lugar a imágenes en sacabocados conocidas como lagunas de Howship. La fase de reposo o inversión es un periodo de aparente inactividad. Durante la fase de formación un grupo de osteoblastos se diferencia a partir de sus precursores y rellena con hueso nuevo la zona excavada por los osteoclastos (Fernández-Tresguerres et al., 2006). La remodelación es un recambio gradual de todo el tejido óseo primitivo por hueso laminar maduro, pero además continúa durante toda la vida, donde se forman generación tras generación de osteonas para lograr reemplazar todo el tejido óseo primitivo por maduro. Los restos de las osteonas previas se distinguen en el hueso cortical bajo la forma de láminas intersticiales. Las láminas intersticiales que se observan en hueso adulto son remanentes de sistemas haversianos remodelados. Tanto el hueso cortical como el trabecular experimentan constantemente remodelación, en respuesta al desplazamiento de los dientes, y para equilibrar las fuerzas funcionales que actúan sobre ellos. La teoría de mineralización que más se acepta se basa en la presencia de vesículas de matriz dentro del osteoide. Los osteoblastos liberan estas vesículas pequeñas en la matriz, las que contienen una concentración elevada de iones calcio y fosfato, AMP cíclico, ATP, ATP-asa, fosfatasa alcalina, pirofosfatasa, proteínas de unión de calcio y fosfoserina. La membrana de las vesículas de matriz posee múltiples bombas de calcio, que transportan iones de calcio dentro de la vesícula, donde tiene lugar la cristalización, formando un cristal de hidroxiapatita, momento en el cual se rompe la vesícula de la matriz y se libera este contenido. 24
Los cristales de hidroxiapatita de calcio liberados de las vesículas de la matriz, actúan como nidos de cristalización. La concentración alta de iones en su proximidad, además de la presencia de factores de calcificación y proteínas de unión de calcio, fomenta la calcificación de la matriz. A medida que se depositan los cristales en las regiones de intersticio en la superficie de moléculas de colágeno, se reabsorbe agua de la matriz. La mineralización se observa alrededor de múltiples nidos de cristalización cercanos entre sí; conforme progresa, estos centros crecen y se fusionan unos con otros. En esta forma se deshidrata y calcifica una región de la matriz cada vez más grande. Los osteoblastos depositan en primer lugar matriz ósea no mineralizada que forma una capa de unos 10 μm de espesor denominada ribete de osteoide. Entre el depósito de tejido osteoide y su mineralización existe un tiempo de demora de unos 10 a 20 días. Durante este periodo la matriz ósea sufre cambios en su composición y estructura que la hacen apta para el depósito de mineral (maduración de la matriz). La mineralización se inicia en la interfase entre el osteoide y el hueso mineralizado preexistente y avanza hacia la superficie a lo largo de un plano de barrido de 2 a 3 micras de espesor. Este plano, integrado en parte por mineral amorfo, se denomina frente de mineralización. A medida que este frente se desplaza va dejando tras de sí matriz ósea mineralizada en forma de cristales de hidroxiapatita. Una vez completado el depósito de hueso los osteoblastos que no se han incorporado a la matriz se aplanan y pasan a formar parte del endostio (Serrano, 1998). La tinción de superficies es extensamente usada para estudios histológicos que implican secciones gruesas de hueso descalcificado. Las osteonas recién formadas, en particular se tiñen azul de con toluidina (TB), mostrando varias intensidades de color. Se han realizado estudios de las correlaciones entre la intensidad de color de TB y las diferencias de la 25
rigidez y el grado de mineralización de las osteonas en cortes histológicos descalcificados de diáfisis de fíbula de cabra, medido con microscopía (SAM) y micro radiografía de contacto (CMR), respectivamente. Los resultados de este estudio sugieren que la tinción de superficie de TB puede ser usado como un método simple para indicar diferencias de rigidez y grado de mineralización en osteonas en estudios histológicos comparativos (Lin Qin et al., 2001). Estudios realizados por Poole et al. (2005) concluyeron que la secreción esclerostina por osteocitos recién integrados es retrasada de modo que las células maduren o reciban una señal posterior que gatille la expresión de la esclerostina. La esclerostina, glicoproteína secretada producto del gen SOST es un inhibidor derivado de osteocito. Este estudio logro demostrar que osteocitos expresan esclerostina producido en o después de la mineralización primaria por los osteocitos en la neoformación de osteonas para restringir la formación del hueso por los osteoblastos. Estas conclusiones son compatibles con el concepto que osteocitos recién integrados secretan esclerostina sólo después del inicio local de mineralización para inhibir la formación de hueso cortical y que el osteón se llene de las células de linaje osteoblástico. De este modo, una suficiente pero no excesiva cantidad de hueso cortical puede ser formada para llenar la osteona y otros canales sin comprimir su contenido. De la misma manera es previsto que el trabeculado es mantenido en el grosor apropiado. Los osteocitos, las células más abundantes en el hueso adulto humano son pensadas para sensar estímulos de carga y regular remodelado y procesos de volumen de hueso. Las conclusiones sugieren que los osteocitos, que tienen acceso para revestir osteoblastos por sus conexiones dendríticas, pueden proporcionar la señal inhibitoria clave de esclerostina para inactivar la superficie de hueso. Al contrario osteoblastos activos dentro de la formación de osteonas son protegidos de la inhibición por esclerostina por una capa de osteocitos esclerostina negativo, permitiendo seguir la formación de hueso en sitios específicos incluyendo el periostio. 26
En la actualidad la novedad para el análisis de las osteonas son modelos de la representación de orientación del colágeno-hidroxiapatita, porcentaje relativo del hidroxiapatita, distribuciones de las lagunas y de los canalículos de los osteocitos, y variaciones biológicas en dimensiones de las estructuras relevantes de los sistemas harvesianos. 5.3 Láser. La palabra LASER es una sigla que responde a los vocablos ingleses "Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation" o sea, "Luz Amplificada por Emisión Estimulada de Radiación" y este fenómeno se basa en principios teóricos postulados por A. Einstein en 1917 a través del cual se obtiene una luz con propiedades específicas, muy diferente a la luz ordinaria y con un alto grado de concentración energética (Stiberman, 2000). Dederich (1991) fue uno de los primeros en estudiar y describir los distintos efectos durante la interacción láser - tejidos. Los primeros estudios en tejidos duros dentarios datan de 1964 en los que se demostró que utilizando láser de rubí se conseguía reducir la permeabilidad a la desmineralización ácida del esmalte. Sin embargo, las altas temperaturas generadas causaban daños pulpares irreversibles. 27
La primera aplicación de láser de rubí en un diente in vivo fue realizada por Goldman en 1965 y, siendo él médico, lo utilizó en un diente de su hermano, odontólogo y relató que el paciente no sintió dolor ni durante ni después del acto operatorio (Goldman, 1965). Los múltiples usos de los láseres en Odontología involucran cirugías de tejidos blandos, tratamientos de caries en tejidos duros reemplazando al instrumental rotatorio en gran medida, la fotopolimerización de resinas, así como la analgesia y aceleración de cicatrización y reparación de lesiones (Oltra-Arimon et al., 2004). Pueden clasificarse en relación a su medio activo, según sea su longitud de onda, forma de emisión u otros criterios, pero quizás la forma más habitual de clasificarlos es atendiendo a la potencia a la cual van a ser usados (Mier, 1989; Almeida, 2004). Existen diversos tipos de láseres que pueden ser clasificados en dos grandes grupos: 1) Los láseres de alta densidad de potencia o quirúrgicos: Estos tienen un efecto térmico ya que son capaces de concentrar una gran cantidad de energía en un espacio muy reducido y ello se demuestra por su capacidad de corte, coagulación y vaporización; y podemos organizarlos según su campo de aplicación en: a) láseres quirúrgicos para tejidos blandos. b) láseres quirúrgicos para tejidos duros. c) láseres quirúrgicos para fotopolimerización. 28
2) Láseres de baja densidad o de baja potencia o LLLT Los láseres de baja energía carecen de este efecto térmico ya que la potencia que utilizan es menor y la superficie de actuación mayor, y de este modo el calor se dispersa; sin embargo producen un efecto bioestimulante celular a nivel de ADN y principalmente en las mitocondrias. Su aplicación fundamental es para acelerar la regeneración tisular y la cicatrización de las heridas disminuyendo la inflamación y el dolor. Los más conocidos son el de Arseniuro de Galio (Ga, As, láser pulsado con longitud de onda de 904 nm), el de Arseniuro de Galio y Aluminio transmisible por fibra óptica (Ga,Al,As con longitud de onda de 830 nm) y el de Helio-Neón (He-Ne con longitud de onda de 632,8 nm), este último dentro del espectro visible, concretamente el rojo. El láser blando es aquel láser de baja energía que emite en la región del espectro rojo o del infrarrojo cercano, con una potencia media desde 50mW hasta 1W y que no produce efecto térmico. Así pues, al trabajar con una potencia baja, no estará indicado en el ámbito quirúrgico (De Nguyen & Turcotte, 1994). Este grupo de láseres de baja potencia podemos dividirlo en: a) láseres de baja potencia terapéuticos. b) láseres de baja potencia para diagnóstico. Además los láseres de baja potencia no atentan contra la vida celular. Son aparatos pequeños y fácilmente transportables. Tiene un efecto analgésico, antiinflamatorio y bioestimulante a través de un incremento del trofismo celular y de la microcirculación local, acelerando la velocidad de cicatrización de heridas, así como la reducción de edema e inflamación post - operatoria (Turner & Christenses, 1994). Suazo et al. (2006) 29
demostraron que la aplicación de láser de baja potencia producía cambios microvasculares en el tejido conectivo, observándose un aumento de la densidad microvascular. Las principales aplicaciones del láser de baja potencia son en hipersensibilidad dentinaria, lesiones aftosas y herpéticas, neuralgia del trigémino, disfunción de ATM, parálisis facial, lesiones periapicales, bioestimulación ósea, etc (Oltra-Arimon et al., 2004). Hoy en día aún no se conoce perfectamente su mecanismo de acción pero se cree que modula el comportamiento celular sin incrementar significativamente la temperatura tisular. De este modo, su actividad sobre los tejidos no obedece a efectos térmicos, sino a la interacción de las ondas electromagnéticas de esta radiación con las células. La energía es absorbida donde la concentración de fluidos es mayor; por lo tanto habrá una mayor absorción en los tejidos inflamados y edematosos, estimulando las numerosas reacciones biológicas relacionadas con el proceso de reparación de la herida (Almeida, 2004). Se produce una interacción entre las células y los fotones irradiados (reacción fotoquímica); la célula absorbe la energía del fotón y ésta es transferida a las distintas biomoléculas, que a su vez estimulan otras biomoléculas. La energía transferida, que dependerá del poder de penetración del haz de energía, provoca un aumento de la energía cinética activando o desactivando enzimas u otras propiedades físicas o químicas de otras macromoléculas principales. Los mecanismos exactos que fundamentan este proceso aún son desconocidos y actualmente son motivo de estudio por parte de la comunidad científica; por este motivo, para algunos autores su uso es muy empírico y fruto de estudios observacionales (Cano, 2003). 30
5.3.1 Láser como elemento terapéutico. Una aplicación más reciente y novedosa en la cirugía de implantes seria la utilización del láser a baja potencia, de esta manera el láser tiene un efecto de descontaminación y un efecto de bioestimulación. El láser de neodimio y el láser de diodo producen una descontaminación profunda y duradera de los tejidos duros (hueso) y blandos, destruyendo las colonias bacterianas hasta un 99% según diferentes estudios. La profundidad de la acción de descontaminación del Nd:YAG es superior a la de los agentes químicos más utilizados (antibióticos, clorhexidina, etc). La acción bactericida del láser no es exclusivamente debida al efecto térmico cuando se utiliza a baja potencia, sino que se produce además por un efecto electromagnético que modifica y destruye la membrana bacteriana. Por otro lado el láser actúa sobre el componente inflamatorio de las lesiones, reduciendo la concentración de algunas citoquinas mediadoras de la inflamación y responsables de la reabsorción ósea. El efecto de bioestimulación no está suficientemente estudiado, algunos autores refieren que el láser produce una activación del ciclo celular y de la actividad mitocondrial, a nivel clínico existe una mejoría en los procesos de reparación y regeneración a corto y a largo plazo. La introducción del láser como método físico de descontaminación en el protocolo de las técnicas regenerativas hace posible que estas funcionen en áreas infectadas con éxito (Martinelli & Sáez de la Fuente, 2005). Para acelerar los procesos de reparación ósea se utiliza la radiación láser de baja potencia, por el efecto antiinflamatorio que se produce al normalizar la microcirculación y 31
activar la fagocitosis, a la vez que estimula la proliferación celular aumentando la capacidad reparativa del hueso. Estudios han probado que la LLLT puede promover la curación de hueso y la mineralización de hueso y así puede ser clínicamente beneficioso en la promoción de la formación de hueso en defectos esqueléticos (Lirani-Galvao et al., 2000; De Souza et al., 2005). Existen estudios realizados sobre la acción del láser helio neón sobre las células osteoblásticas en las cuales la velocidad del desarrollo celular y la síntesis del DNA se incrementaron en la fase de crecimiento de cultivo (Yamada, 1991). Otros estudios han demostrado una rápida regeneración ósea, primero en animales de experimentación y posteriormente con pacientes que presentaban fracturas, en quienes fue evidente la aceleración de la regeneración ósea (Loumitzky, 1985; Katz, 1985). Los estudios experimentales en cultivos de células y en tejido óseo de animales indican que la radiación láser de baja potencia incrementa la actividad del DNA y estimula la proliferación de células clonales óseas, los osteocitos se mantienen normales y en fase activa con dosis de hasta 10 J/cm 2, mientras que con 30 J/cm 2 presentan signos de degradación e inclusive de destrucción total. Urasalin y Antipova y Lomnitzky y Biniashevsky, encontraron que la acción estimulante es particularmente importante en los períodos iniciales de diferenciación de los elementos celulares osteogénicos, por lo que recomiendan la irradiación diaria. La acción sobre la mineralización ósea, se demostró por Dickson et al. (1994), al encontrar incrementos apreciables en la expresión de fosfatasa alcalina y por Glinkowsky y Rowinsky, que reportaron un aumento de la densidad óptica del hueso irradiado, evaluado por radiografías en fracturas provocadas en animales de experimentación (Garrigo & Valiente, 1996; Ueda & Shimizu, 2003). 32
Silva et al. (2002) demostraron en ratones que la aplicación diaria de LLLT por más de siete días acelera la neoformación trabecular y a los cinco días se observa una mayor aposición de minerales. Barushka et al. (1995) también en ratones, demostraron que la LLLT aumenta la actividad y el número de osteoblastos y osteoclastos, así como incremento de la actividad de fosfatasa alcalina y la expresión de la osteocalcina, la primera es una proteína de superficie que participa en la migración, proliferación y diferenciación de células osteoblásticas (Lirani & Lazaretti-Castro, 2006). La osteocalcina es una pequeña proteína de la matriz sintetizada por osteoblastos y plaquetas, dependiente de la Vitamina D. Sus niveles plasmáticos son considerados como marcador bioquímico de osteogénesis, relacionándose con el número y actividad de lo osteoblastos (Stein et al., 2005). Estudios in vitro con odontoblastos humanos demostraron que existe un incremento en la diferenciación y maduración de estos al ser irradiados con LLLT (Martinasso et al., 2007). También se concluyó en este estudio que existe un aumento en la expresión de marcadores osteogénicos como la fosfatasa alcalina, la osteopontina y la sialoproteina ósea (Stein et al., 2005; Martinasso et al., 2007) La fosfatasa alcalina (ALP) es una proteína de superficie que podría participar en la regulación de la proliferación, migración y diferenciación de células osteoblásticas. Esta enzima también libera fosfato inorgánico a partir de ésteres fosfóricos, necesario para la mineralización del tejido osteoide. 33
La osteopontina y la sialoproteína, o sea, ambas proteínas con el tripéptido RGD son fundamentales en los procesos de remodelado y regeneración óseos; también actúan como receptores de superficie de células óseas (Abramovitich-Gottlib et al., 2005). Análisis histométricos en ratones de estudio revelaron una concentración de hueso neoformado mas rápida en ratas sometidas a LLLT (Pourzarandian & Watanabe, 2004; De Souza et al., 2005; Lirani et al., 2006) Estudios sobre la cicatrización ósea han demostrado que a partir del 2 do día de LLLT aumentaron los números de células. En este estudio la capacidad de irradiación LLLT para estimular la producción de hueso fue evaluada determinando la expresión de osteocalcina y fosfatasa alcalina, proteínas implicadas en la formación de nódulo de calcio. Estas proteínas aumentaron notablemente después de 3 días de tratamiento de láser. Estos resultados preliminares muestran que la irradiación LLLT estimula la proliferación de célula en el humano como células y, pretenciosamente, aumenta la expresión de proteínas esenciales para la formación de hueso (Osawa et al., 1998). 34
6. MATERIAL Y MÉTODO. 6.1 Materiales. 6.1.1 Animales de experimentación y medio de mantención. 19 ratas Sprague Dawley, adultas (Figura nº1). 3 cajas plásticas con tapas de reja metálica para alojamiento de ratas. Telón de género negro para control de ciclos de luz oscuridad. Dieta habitual: pellet y agua potable (Figura nº2). Figura nº 1. Ratas Sprague Dawley. Figura nº 2. Cajas para alojamiento y bebedero. 35
6.1.2 Materiales. Éter etílico (Figura nº3). Cámara de anestesia. Ambú. Mascarilla de anestesia. Mesón de disección. Fresa Carbide de 0.8. Algodón. Guantes. Mascarillas. Delantal de cirujano. Motor eléctrico Profile Dentsply (Figura nº4). Figura n o 3. Éter etílico 36
Figura n o Eléctrico 4. Motor 6.1.3 Materiales para aplicación de láser. Equipo láser de baja potencia, Brightness - Kondortech (Figura nº4). Fibra óptica para laserterapia. Lentes de protección polarizados. Alcohol del 70 o y algodón, para limpiar fibra óptica. Figura n o 4. Equipo láser. 37
6.1.4 Materiales para obtención y procesamiento de muestras. Éter etílico Biopack. Cámara de anestesia. Algodón. Guantes. Mascarillas. Delantal de cirujano. Cuchillo grande de disección. Lupa con aumento de 10 x. Hojas de bisturí n o 11 y mango. Pinza recta. 20 frascos para biopsia, etiquetados. Formalina 10%. Alcohol distintas concentraciones. Parafina. Micrótomo Shandon AS 325. 20 Portaobjetos. 20 cubreobjetos. Tinción Hematoxilina-Eosina (H/E). 6.1.5 Infraestructura. Laboratorio de Anatomía Normal de la Universidad de Talca. 38
6.2 Método. 6.2.1 Diseño De Investigación. El presente estudio es de tipo descriptivo experimental de cohorte longitudinal. 6.2.2 Población estudiada. La población se conformó de 19 ratas Sprague Dawley, adultas hembras, de 250 a 300 grs. Las cuales fueron adquiridas en el bioterio ANEXPA de la ciudad de Talca. Durante todo el periodo experimental se alojaron en jaulas al interior del laboratorio de anatomía de la Universidad de Talca, mantenidos con ciclos de 12-12 hrs. Luz-oscuridad, con calefacción y con una dieta estándar de alimentos sólidos (pellet) y agua potable ad libitum. La parte experimental de este estudio se desarrolló en los laboratorios de Anatomía Normal de la Universidad de Talca. 39
6.2.3 Variables de estudio Fueron incluidas las siguientes variables en el estudio: cambios histológicos y láser de baja potencia. Las cuales se detallan a continuación. Variable respuesta: cambios morfológicos en el hueso alveolar. Variable explicativa: aplicación de láser de baja potencia. Cambios Histológicos En el aumento o no del número de osteonas según si se aplicó radiación láser como terapia post-lesión durante las cuatro primeras semanas de cicatrización del hueso alveolar. Láser de baja potencia: En aplicación o no aplicación, según si se aplicó radiación láser como terapia post-lesión durante las cuatro primeras semanas de cicatrización del hueso alveolar. 40