RepublicofEcuador EDICTOFGOVERNMENT± Inordertopromotepubliceducationandpublicsafety,equaljusticeforal, abeterinformedcitizenry,theruleoflaw,worldtradeandworldpeace, thislegaldocumentisherebymadeavailableonanoncommercialbasis,asit istherightofalhumanstoknowandspeakthelawsthatgovernthem. NTE INEN 0734 (1985) (Spanish): Leche y productos lácteos. Determinación de bacterias aeróbias
CDU: 637 AL 03.01-328 Norma Técnica Ecuatoriana LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. DETERMINACION DE BACTERIAS AEROBIAS INEN 734 1. OBJ ETO Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Casilla 17-01-3999 Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro Quito-Ecuador Prohibida la reproducción 1.1 Esta norma establece el método para determinar bacterias aerobias en leche y productos lácteos. 2. TERMINOLOGIA 2.1 bacterias aerobias. Son los microorganismos que se desarrollan bajo condiciones aerobias. 3. DISPOSICIONES GENERALES 3.1 Deberán cumplirse las disposiciones establecidas en la norma INEN 17. 3.2 El contaje deberá realizarse por triplicado sobre la misma muestra preparada. 4. FUNDAMENTO 4.1 El método se basa en preparar la muestra de leche o producto lácteo en un medio de cultivo selectivo (agar para recuento en placa estándar), inocular e incubar en condiciones adecuadas y estimar la cantidad de bacterias aerobias en base al número de colonias que se desarrollen. 5. INSTRUMENTAL - EQUIPO 5.1 Area de trabajo. Limpia, bien iluminada, libre de corriente de aire. Mesa nivelada, de superficie amplia y no porosa, desinfectada antes de cada análisis. 5.2 Incubadora con regulador de temperatura, sensible ± 0,5 C. 5.3 Equipo de esterilización (autoclave). 5.4 Aparato para recuento de colonias, provisto de un lente de tres aumentos y campo iluminado con luz blanca difusa. 5.5 Balanza analítica, sensible al 0,1 mg. -1-
5.6 Utensilios, para preparación de los medios de cultivo, a base de borosilicato, o materiales anticorrosivos, como acero inoxidable. 5.7 Pipetas volumétricas de 10 cm 3, 5 cm 3 y 1 cm 3 con graduación de 0,1cm 3. 5.8 Porta pipetas, cajas de aluminio de acero inoxidable. 5.9 Frascos o tubos de dilución (de borosilicato con tapones de cristal o con tapa de rosca y empaques que no produzcan compuestos tóxicos o bactericidas durante la esterilización). 5.10 Cajas Petri de vidrio o plástico de 15 mm de altura x 100 mm de diámetro, estériles. 5.11 Frascos de muestreo, de borosilicato, con capacidad para contener el volumen necesario para análisis. 5.12 Refrigeradora, para almacenar medios de cultivo y guardar las muestras que lo requieran. 5.13 Baño de agua, con regulador de temperatura, para mantener el medio de cultivo ajustado a 45 ± 1 C. 6. REACTIVOS 6.1 Agar para contaje de aerobios en placa (ver Anexo A.1). 6.2 Solución buffer o stock (butter field's) para diluciones (ver A.2). 6.2.1 Diluyente (ver A.2.1). 6.3 Agua peptonada (ver A.3). 6.4 Agua destilada estéril. 7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 7.1 Mezclar completamente el producto lácteo, invirtiendo el recipiente que lo contiene varias veces, hasta que la muestra esté homogénea. 7.2 Si se forman grumos de crema y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua, entre 35-40 C. Mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al recipiente y enfriar rápidamente a 18-20 C. -2-
8. PROCEDIMIENTO 8.1 En condiciones asépticas, (ver Anexo A) transferir 25 g de la muestra preparada dentro de un frasco de vidrio (ver 5.11) y añadir 225 cm 3 de la solución peptonada (ver A.3) y colocaren una centrífuga entre 15 000 o 20 000 rpm, por un tiempo no mayor de 2,5 minutos. 8.1.1 En condiciones asépticas, transferir 1 cm 3 de la muestra dentro de un tubo de ensayo que contenga 9 cm 3 del agua peptonada (ver A.3), mezclar cuidadosamente. 8.1.2 De esta dilución primera (ver 8.1.1) transferir 1 cm 3 de la muestra a un segundo tubo que debe con- tener 9 cm 3 de la solución A.3 y mezclar cuidadosamente. 8.1.3 Repita las diluciones usando un tercero y cuarto tubo o más, según el número de diluciones que sean requeridas, y mezclar cuidadosamente cada uno de ellos (ver Nota 1). 8.1.4 En condiciones asépticas y por triplicado, transferir de cada dilución preparada 1 cm 3 a la caja Petri (ver 5.10) identificándolas convenientemente. 8.1.5 Fundir el medio de cultivo utilizando un baño de agua hirviente, evitar la exposición prolongada del medio de cultivo a altas temperaturas durante y después de la fusión. Descartar el agar fundido que contenga precipitado, mantener el medio tundido en baño de agua entre 44-46 C y usar en esta temperatura. Transferir 15 cm 3 del medio de cultivo a cada caja Petri, evitando derramar por las paredes del recipiente a la parte interna de la caja Petri. 8.1.6 Mezclar la muestra diluida con el agar o medio de cultivo, mediante movimientos rotatorios en di- recciones opuestas o por inclinación de la caja. Evitar salpicaduras de la mezcla. 8.1.7 Dejar que las placas se solidifiquen sobre una superficie nivelada. 8.1.8 Colocar las cajas en forma invertida dentro del incubador a una temperatura de 35 C ± 0,5 C, por un tiempo de 48 ± 2 horas. 8.1.9 Usar cajas de control para comprobar la esterilidad del medio de cultivo. 8.1.10 Con ayuda del contador de colonias, examinar las cajas de Petri (correspondientes a las diferentes diluciones), sin tener en cuenta aquellas que presentan mas de 300 o menos de 30 colonias. Si varios cultivos correspondientes a diferentes diluciones caen dentro de tal intervalo, deberán seleccionarse aquellos que den un mayor contaje o cumplan con lo establecido en el numeral 10.1. NOTA 1. Una dilución en preparación 1/10 significa un volumen de leche o producto lácteo diluido con 9 volúmenes de agua peptonada. -3-
9. CALCULOS 9.1 El número de bacterias aerobias en la leche o producto lácteo, se calcula mediante la ecuación siguiente: c = (n) (f) Siendo: c = número de bacterias aerobias, por cm 3 de la muestra, n = número de colonias contadas en cada cultivo f = factor de dilución de la muestra (inverso de la proporción de la dilución). 10. ERRORES DE METODO 10.1 La diferencia entre los resultados extremos de la determinación efectuada por triplicado, no debe exceder del 10% de la media aritmética de los resultados; en caso contrario debe repetirse la determi- nación. 11. INFORMES DE RESULTADOS 11.1 Como resultado final debe reportarse la media aritmética, aproximada a centenas, de los resulta- dos de la determinación. 11.2 En el informe de resultados debe indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma, o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido en el resultado. 11.3 Debe incluirse todos los detalles necesarios para la completa identificación de la muestra. -4-
ANEXO A A.1 Medio de cultivo: Agar para contaje de aerobios en placa. Caseína dirigida pancreática 5,0 g Extracto de levadura en polvo 2,5 g Glucosa 1,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1 000 cm 3 A.1.1 Disolver los ingredientes en frascos adecuados (ver 5.11) que contengan un litro de agua destilada, hervir hasta la ebullición y agitar frecuentemente. Distribuir en tubos o frascos (ver 5.9) y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. El ph del medio debe estar entre 7,0 ± 0,1. A.2 Solución buffer o solución stock butter field's para diluciones. Fosfato ácido monopotásico 34 g Agua destilada 500 cm 3 Solución N, de hidróxido de sodio 175 cm 3 Añadir agua destilada, hasta obtener 1 000 cm 3. La solución deberá tener un ph igual a 7,2. Almacenar. A.2.1 Diluyente. Tomar 1,25 cm 3 de la solución A.2 y colocar en un balón volumétrico de 1 000 cm 3 y llevar a la marca con agua destilada. Distribuir en frascos (ver 5.9) adecuados y esterilizar a 121 C por 15 minutos. A.3 Agua peptonada, solución al 0,1%. Peptona 1,0 g H 2 O destilada estéril 1 000 cm 3 Disolver la peptona en 1 000 cm 3 de agua destilada estéril, ajustar al ph a 6.8 ± 0,2. El agua peptonada se distribuye en proporción que se permita obtener volúmenes de 99 ± 2 cm 3 o de 9,9 ± 0,2 cm 3 y colocar en el autoclave a 121 C por 15 minutos. -5-
ANEXO B Contaje de bacteria aerobias por el método del agar para recuento en placa estándar -6-
APENDICE Z Z.1 NORMAS A CONSULTAR INEN 17 Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones generales. Z.2 BASES DE ESTUDIO Manual oxoid. Medios de cultivo. Ingredientes para su preparación y otros elementos de laboratorio. Stand- ard plate count agar (A.P.H.A). Agar para recuento en placa standard pp 297. Hampshire, England, 1981. M.R. Refai. FAO/FOOD and nutrition paper. Enumeration of mesophilic. Bacteria (Aerobic plate count) Manuals of food quality control. Microbiological Analysis. FAO consultant faculty of veterinary medicine. Egipt. Food and agriculture organization of the United Nations, Rome, 1979. F.D.A Food and Drug Administration. James W. Messer, James T. Pecler and James E. Gilchrist. Division of microbiology. Food and Drug Administration. Chapter IV. Aerobic Plate count. pp IV-I, 5th edition, Washington, 1978. AOAC. Official methods of analysis of the Association of official Analytical chemists. 46 Microbiological methods. Aerobic plate count pp 915. Association official analytical chemist. Washington, 1975. Bacteriological analytical Manual. Plate count agar. U.S. Department of Health. Education and welfare. Public Health service. Division of microbiology, Washington, 1969. Dr. D.A.A Mossel, Director del servicio de bacteriología del Instituto Central de Alimentos TNO, de Holanda. Control microbiológico de los alimentos. Numeración de los microorganismos aerobios estrictos y facutativos viables pp 17, Lima, 1967-7-
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA