TEMA 11.- CINÉTICA ENZIMÁTICA Introducción: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis-Menten. Ecuación de Lineweaver-Burk. Reacciones con múltiples substratos. Inhibición enzimática: - Reversible Competitiva. No competitiva. Acompetitiva. - Irreversible. Ejemplos de inhibidores irreversibles
Introducción. Cinética enzimática La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Perfil cinético de un enzima micaeliana Perfil cinético de un enzima alostérico
Modelo Cinético de Michaelis-Menten Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: Primera etapa, se forma el complejo enzima-sustrato. Segunda etapa, el complejo enzima-sustrato se transforma en el producto, liberando el enzima. V 1 = k 1 [E] [S] V 2 = k 2 [ES] V 3 = k 3 [ES] En equilibrio la V de formación de ES es igual a la velocidad de descomposición. V 1 = V 2 + V 3 k 1 [S] [E] = (k 2 + k 3 )[ES] [E] = [ET] - [ES] donde la expresión (k 2 + k 3 )/k 1 se ha sustituído por K M, o constante de Michaelis-Menten
Modelo Cinético de Michaelis-Menten La velocidad de reacción = la velocidad de formación del producto: v = v 3 = k 3 [ES] = La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando el enzima está saturada por el S. Vmax = k 3 [E T ] Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:
Modelo Cinético de Michaelis-Menten La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una hipérbola K M es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si K M = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = V max /2. El valor de K M da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor K M, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor K M, menor afinidad.
Representación de Lineweaver-Burk Para determinar gráficamente los valores de K M y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk 1 v 1 K M /Vmax 1 v = V max [S] v = Km + [S] [ Km ] V max 1 + 1 [S] V max V max y= m. x + b - 1 Km 1 [S] pendiente es K M /Vmax abscisa en el origen es -1/K M ordenada en el origen es 1/Vmax A partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de K M y Vmax de un enzima para diversos sustratos.
Reacciones con múltiples substratos a) Reacción enzimática con formación de un complejo ternario (ES 1 S 2 ) a.1. Unión aleatoria de los S a.2. Unión ordenada de los S b) Reacción enzimática en la que no se forma de un complejo ternario Mecanismo ping pong
Inhibidor: Efector que se une al enzima y hace disminuir su actividad, mediante interacciones con el centro activo u otros centros específicos. Se excluyen todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática. Dos tipos de inhibidores: Inhibición Enzimática * Inhibidores reversibles: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato, o con ambos. - COMPETITIVOS: El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato. - NO COMPETITIVOS: El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el sustrato. No impide la fijación del sustrato a la enzima, pero sí la acción catalítica. - ACOMPETITIVOS: El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-sustrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica * Inhibidores irreversibles: modifican químicamente a la enzima mediante uniones covalentes.
Inhibición reversible Inhibición competitiva S I E ES E + P EI Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor K i = [E] [I] [EI] Características: -Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes. - A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición. - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo estructural del sustrato. - El inhibidor es tan específico como el sustrato.
Inhibición reversible Inhibición competitiva Representación directa Inhibición competitiva v = V max [S] [ ] Km 1+[I] + [S] Ki v 120 100 Sin Inhibidor 80 60 40 20 0 Con Inhibidor Km = Km (1+[I]/Ki) 0 20 40 60 80 100 120 s
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble 1/v 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 1/V max -1/K m 0.02 0.01 1/s 0.00-0.3-0.2-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6-1/(K m (1 + i/k i ))
Ejemplo de inhibición competitiva CH 2 FAD FADH 2 CH CH 2 Succinato SDH Succinato deshidrogenasa CH Fumarato Inhibidores competitivos CH 2 Malonato C O CH 2 Oxalacetato
Inhibición reversible Inhibición no competitiva S E ES I I S E + P EI ESI Características: - El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre (E) y al complejo enzima-sustrato (ES) - Ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos
Inhibición reversible Inhibición no competitiva Vmax < Vmax V max = V max /(1+[I]/K i ) V = Vmax. [S] Km. (1+[I]/Ki) + [S]. (1+[I]/Ki) Vmax = Vmax/(1+[I]/Ki)
Inhibición reversible Inhibición acompetitiva o mixta - El I sólo se une al complejo ES y en un sitio distinto al que se fija el S en el centro activo - Baja la Km y Vmax, pero el cociente Km/Vmax no se altera. -Ocurre en reacciones multisustratos El lugar de unión del I se crea tras la unión del S al E
Inhibición reversible Inhibición acompetitiva o mixta Inhibición acompetitiva
Inhibición Irreversible - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente E + I E - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos. - Una clase especial de inhibidores irreversibles son los Inhibidores suicidas: Son poco reactivos hasta que se unen al centro activo del enzima, donde se transforman en un compuesto muy reactivo, inactivando irreversiblemente al enzima. Algunos tipos de inhibidores irreversibles: 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosforados 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados
Ejemplos de inhibidores irreversibles Compuestos organofosforados Ser Diisopropil fluorofosfato (DFP) CH CH 2 OH H 3 C CH 3 CH F P O CH H 3 C CH 3 Ser H 3 C CH 3 CH CH CH 2 O P O CH H 3 C CH 3 Malation - Actúan sobre enzimas serínicas (serin proteasas, acetil colinesterasa...), uniéndose covalentemente a través del grupo fosfato. Ejemplos: DFP, Insecticidas (Paration, Malation) Gases de guerra (Sarín), gas mostaza.
Ejemplos de inhibidores irreversibles Ión cianuro, CN - : Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico del complejo citocromo oxidasa. Penicilinas. Inhiben enzimas serínicas que participan en la formación de la pared bacteriana.
Inhibidor suicida (Inhibidores activados enzimáticamente) - Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos - Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola - Tienen por tanto la especificidad del inhibidor competitivo y la potencia de los inhibidores irreversibles Modo de acción de los inhibidores suicidas 1 2 3 E + I EI EI* E + I* 1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un inhibidor competitivo convencional. 2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*. 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
Ejemplo de inhibidores suicidas Sistema de la β-lactamasa bacteriana La utilización masiva de antibióticos β-lactámicos (penicilinas,derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la β-lactamasa, que inactiva a los antibióticos β-lactámicos. Penicilina (activa) S R CO NH CH 3 N CH 3 O β-lactamasa S R CO NH CH 3 O C HN CH 3 O - Ác.peniciloico (inactivo) Con frecuencia los preparados de penicilinas se formulan añadiendo un inhibidor suicida de la β-lactamasa, el ácido clavulánico O N O C CH 2 OH H Ác.clavulánico CH Ser CH 2 O C O β-lactamasa HN O C O C O - CH 2 OH H HN O C CH 2 OH Esta molécula reacciona con la serina activa de la β-lactamasa, produciendo su inactivación H
Resumen de los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas: efecto de los distintos tipos de inhibición. Tipo de inhibición Ecuación de velocidad Km Vmáx Sin inhibidor Vmáx. [S] V = Km + [S] Km Vmáx Inhibición competitiva Vmáx. [S] V = Km. (1+[I]/Ki) + [S] Km (1+[I]/Ki) Vmáx Inhibición no competitiva Vmáx. [S] V = Km.(1+[I]/Ki)+[S].(1+[I]/Ki) Km Vmáx/(1+[I]/Ki) Inhibición acompetitiva o mixta V = Vmáx. [S] Km +[S].(1+[I]/Ki) Km/(1+[I]/Ki) Vmáx/(1+[I]/Ki)