Química CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD La cromatografía de afinidad ocupa un lugar importante en la tecnología de separación, ya que es una técnica capaz de purificar biomoléculas sobre la base de su función biológica o estructura química individual. Esto hace que sea un método de mayor resolución precisamente por la extraordinaria selectividad en que se basa su principio de separación. La primera aplicación de este tipo cromatografía se llevó a cabo en 1910 en la purificación de amilasa sobre la base de un almidón insoluble. Posteriormente en 1967, algunos autores reportaron que las moléculas que contenían grupos aminos primarios, podían ser acopladas a matrices de polisacáridos activadas con bromuro de cianógeno y ya en 1972, la Pharmacia había desarrollado la Sepharose-4B activada con bromuro de cianógeno, un gel listo para la inmovilización del ligando. En la actualidad existen una serie de productos (geles) listos para la inmovilización del ligando a través de diferentes grupos funcionales. Ejemplos: Thiopropyl-Sepharose 6B (contiene un grupo tiol activo, para inmovilizar ligandos pequeños que contengan grupos tioles, enlaces C=O, N=N o C=C ). Epoxy-activated-Sepharose 6B (contiene grupos oxiranos libres para interactuar con ligandos que contengan hidroxilos, grupos amino o grupos tioles). Activated CH-Sepharose 4B (contiene un brazo espaciador de 6 átomos de carbono y un grupo éster activo para interactuar con ligandos que contengan grupos aminos primarios). Esta cromatografía es un tipo de cromatografía de adsorción en la que la molécula a ser purificada es adsorbida de forma reversible y específica, a una sustancia complementaria (ligando) inmovilizada en un soporte insoluble (matriz). Tiene un efecto concentrador, lo que permite procesar grandes volúmenes de muestra. La alta selectividad de las separaciones depende de la especificidad natural de las moléculas interactuantes. Este método puede ser usado para: Purificar sustancias de mezclas biológicas complejas. Separar la forma nativa de la desnaturalizada de una misma sustancia. Eliminar pequeñas cantidades de material biológico de grandes cantidades de sustancias contaminantes. Este tipo de cromatografía a la cual hacemos referencia se desarrolla en tres etapas fundamentales (Figura 1): 1. Inmovilización del ligando. 2. Adsorción de la sustancia a purificar. 3. Desorción de la sustancia fijada.
Figura1. Etapas fundamentales de la cromatografía de afinidad. 2
Fig. 2 Procedimiento para la cromatografía de afinidad. La interacción entre las dos moléculas, producto (P) y ligando (L), puede presentarse en el siguiente equilibrio: 3
donde: P + L k 1 k -1 PL P es la molécula que debe ser purificada L es el ligando k 1 y k -1, son las constantes de asociación y disociación de este equilibrio respectivamente. La constante de disociación (k d ) es igual a la relación k 1 /k -1 y representa la afinidad entre el ligando y la proteína. Los sistemas biológicos más usados, en la cromatografía de afinidad, son los pares biológicos: Enzima - Inhibidor, cofactor, virus Anticuerpo - Antígeno, virus Hormona - Receptor Vitamina - Proteína transportadora Macromoléculas que interactuan con metales - Iones metálicos El procedimiento general de como llevar a cabo un proceso cromatográfico de afinidad se representa en la Figura 2. 1- Selección del ligando. En la cromatografía de afinidad el ligando es un compuesto que presenta una afinidad reversible y más o menos específica, con el producto que se desea separar. En general el ligando seleccionado para este tipo de cromatografía debe tener las siguientes características: 1.1. Ser capaz de formar complejos reversibles con la molécula a separar, sino conllevaría a utilizar métodos drásticos en la separación. La interacción reversible con la molécula a ser separada debe ser en el orden de una k d = 10-4 -10-8 mol/l, lo cual aumenta la resolución. 1.1.1. Si k d es menor de 10-8 (o sea una k d baja), ocurriría una unión L-P extremadamente fuerte, por lo que la forma de desorción traería consigo la desnaturalización de P o la destrucción del L. 1.1.2. Si k d es mayor que 10-4 (o sea una k d alta), ocurriría una unión L-P débil debido a la poca afinidad de P por el L y ésto pudiera dar lugar a que no se fije toda la proteína o nada, promoviendo la unión de otras moléculas o contaminantes. 1.2. Poseer al menos un grupo químicamente reactivo que permita su inmovilización. Este grupo no debe estar involucrado en el proceso de interacción con el producto. 1.3. Ser estable durante las reacciones de inmovilización. Tipos de ligando: Existen diferentes tipos de ligandos: 4
Monoespecíficos de bajo peso molecular (ej. vitaminas y hormonas). Cromatografía de Afinidad Monoespecíficos de alto peso molecular (ej. complejos inmunoenzimáticos Ag-Ac). Grupos específicos de bajo peso molecular (ej. cofactores enzimáticos y NADH). Grupos específicos de alto peso molecular (ej. lecitinas). 2. Selección de la matriz. Los factores que caracterizan un soporte apropiado para cromatografía de afinidad son los siguientes: 2.1. Que sea lo más inerte posible pero con grupos que interactúen con el ligando. 2.2. Insoluble en agua. 2.3. Hidrofílico. 2.4. Que posea una porosidad que permita la difusión de la partícula al ligando y está relacionada con la capacidad de adsorción del soporte, ya que a mayor tamaño, mayor superficie y mayor capacidad. 2.5. Rigidez, tamaño y forma de la partícula. 2.6. Estabilidad química, mecánica y biológica. 2.7. Poseer grupos químicos disponibles para la activación. 2.8. Resistencia al ataque microbiano. 2.9. Facilidad de regeneración. 2.10. Bajo costo. La capacidad de adsorción de un soporte generalmente depende de la cantidad de ligando inmovilizado y su accesibilidad. Una inmovilización máxima de ligando se produce o bien cuando la reacción tiene lugar tanto sobre la superficie como en el interior de la partícula de gel activada o cuando los grupos funcionales de la matriz están altamente concentrados. Sin embargo, debe señalarse que el alto grado de sustitución, particularmente en el caso de las macromoléculas, da lugar a un gran número de sitios de adsorción no específicos y que una alta concentración de polímero en el soporte produce insuficiente porosidad. Por lo tanto, la selección de la matriz es un compromiso entre un alto grado de sustitución y una pobre porosidad en la matriz. En general los soportes cromatográficos utilizados en cromatografía de afinidad, pueden ser de origen natural o sintético. Dentro de los soportes de origen natural, los más usados son los polisacáridos, como la agarosa, la celulosa y la dextrana. Son utilizados también frecuentemente algunas matrices sintéticas como geles de poliacrilamida. 5
También en este tipo de cromatografía, a veces es necesario utilizar un Brazo Espaciador, que se usa cuando el ligando tiene un peso molecular relativamente pequeño (menor o igual a 5000), cuando tiene una baja afinidad hacia el P a separar y cuando hay problemas de accesibilidad. Generalmente el brazo espaciador está constituido por una cadena hidrocarbonada pequeña y lineal. En un extremo se localiza el grupo químico que se une a la matriz (ej. amina primaria) y el otro extremo contiene el grupo seleccionado, sobre la base del ligando que va a ser fijado. Este grupo, se conoce como "Terminal" y usualmente es una amina primaria o un grupo carboxilo. Fórmula general de un brazo espaciador (B.E.) donde: NH 2 -(CH 2 ) n -X X = -COOH ó -NH 2 La longitud del B.E. es crítica. La cadena debe tener de 2 a 12 átomos de carbono. - Si es muy larga, favorece las adsorciones no específicas, particularmente cuando la cadena hidrocarbonada tiene un carácter hidrofóbico. - Si es muy corta, no permite la eliminación de los efectos estéricos, o sea no resuelve el problema de accesibilidad P-L. A pesar de que existe la posibilidad de seleccionar brazos espaciadores de longitudes diferentes, el más utilizado contiene 6 átomos de carbono (ácido aminohexanoico o hexametilendiamino). 6
Fig. 3. Principales métodos de inmovilización. 3. Acoplamiento del ligando. 7
En principio, la matriz en su forma nativa no está preparada para inmovilizar el ligando, por lo tanto se requiere de un proceso de activación-inmovilización (o sea, primero activar la matriz y después inmovilizar el ligando. Sólo en el caso que se utilicen matrices comerciales preactivadas, la activación no tiene lugar. 3.1. Principales métodos de inmovilización (Figura 3) 3.1.1. Inmovilización directa: unión del ligando a un soporte activado. 3.1.2. Inmovilización indirecta: unión del ligando a un brazo espaciador previamente fijado a un soporte activado. Existen diferentes técnicas de activación de la matriz, que difieren de acuerdo a los grupos disponibles de la misma. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno, bisepoxiranos, divinilsulfona, epiclorhidrina, benzoquinona, carbonildiimidazol, peryodato y cloruro de tosilo reaccionan con los grupos hidroxilos de la matriz. En la Tabla 1 se muestran las características fundamentales de los diferentes métodos de activación e inmovilización. Los ácidos nucleicos y azúcares pueden ser inmovilizados en matrices activadas con bisepoxiranos. La unión de macromoléculas que contienen tirosina (ej. proteínas), puede ser realizada por activación de los grupos diazonios. Para ello se requiere unir a la matriz un derivado aromático (ej. cloruro de p-nitro bencilo), seguido de una reducción del grupo -NO 2 y diazotación en medio ácido. El más usado es el bromuro de cianógeno (Figura 4). el cual reacciona con los grupos hidroxilos de polisacáridos y da lugar fundamentalmente a dos productos reactivos (éster de cianato, que es muy reactivo y predomina cuando la matriz es agarosa, y el imidocarbonato cíclico que predomina cuando la matriz es celulosa), a los cuales pueden acoplarse proteínas, ácidos nucleicos y otros biopolímeros, grupos amidas, tales como poliacrilamida y para la inmovilización de L que contengan amino. Estos métodos no funcionan sobre matrices de polisacáridos. Es rápido, un tiempo de activación de 0.2-0.4 horas, inestable a ph menor que 5 y mayor o igual que 10 y es tóxico. La simplicidad del método, el hecho que trabaja también en combinación con la agarosa, una matriz con excelentes propiedades cromatográficas y que es lo suficientemente suave para enlazar ligandos sensibles tales como proteínas (anticuerpos y enzimas) ha hecho que sea la técnica más usada para la preparación de adsorbentes de afinidad. Por otra parte la activación con glutaraldehido e hidracina (Figura 5), son usadas con matrices que tienen grupos amidas o amino primario. 8
Fig. 4 Activación de la matriz con CNBr 9
Fig. 5 Activación de la matriz con Hidracina. 3.2 Detalles prácticos en el acoplamiento del ligando. 3.2.1. Como en el L se usan más los grupos aminos, no se debe inmovilizar con buffer Tris- HCl porque tienen grupos NH 2 también y podría bloquear la unión del ligando a la matriz. 3.2.2. Los buffers más usados son los de carbonato-bicarbonato, normalmente a μ no elevadas y ph = 9. 3.2.3. El tiempo y la temperatura de reacción ideal es durante toda la noche a 4ºC ó a 20ºC y siempre en agitación para evitar las limitaciones difusionales. 3.2.4. Cuando se detiene la inmovilización se debe filtrar al vacío (nunca a sequedad) y 10
resuspender en una solución que contenga una agente bloqueador (etanolamina 1 mol/l ph=8). Si el L tiene grupos carboxilos se utiliza cualquier agente bloqueador que tenga COOH (acetatos). 3.2.5.. Luego la matriz se lava alternando buffer acetato y buffer de acoplamiento para eliminar cualquier grupo activo que haya quedado libre. De forma general se plantea que la cantidad de ligando inmovilizado depende de las condiciones que se elijan, o sea, cantidad de ligando, ph, temperatura, fuerza iónica, buffer, entre otras. También es importante tener en cuenta el grado de sustitución (Sº), que no es más que la cantidad de ligando inmovilizado por ml de gel o por gramos de matriz seca. Generalmente se expresa como μmoles por ml de gel o por gramos de gel y como mg/ml o mg/g en el caso de proteínas y ácidos nucleicos. El grado de sustitución garantiza una buena capacidad de adsorción de la matriz (cantidad de producto, que puede ser adsorbido por ml de gel o por g de matriz que contiene el ligando), siempre y cuando se tenga en cuenta el tamaño del ligando, la especificidad del ligando y la porosidad de la matriz. No debe ser muy alto ni muy bajo: Si es muy alto, de lugar a impedimentos estéricos, limitaciones difusionales porque la porosidad disminuye, aumentan las interacciones inespecíficas sobre el brazo espaciador o sobre el mismo ligando. Además pueden producirse interacciones multipuntuales entre el L y la P lo que conlleva a dificultades en la elución de la sustancia adsorbida. Si es muy bajo, se adsorbe menos proteína y por tanto disminuye la capacidad del gel. Se recomienda: Si el L es de bajo peso molecular, un Sº de 1-10 μmoles de L por ml de gel. Si el L es de alto peso molecular, un Sº de 2-10 mg de L por ml de gel. Lo más frecuente es aproximadamente 5 mg de L por ml de gel y para inmunoadsorrbentes 2 mg de L por ml de gel. Por ejemplo si estamos en presencia de un ligando de bajo peso molecular (PM) y el P a separar es una macromolécula se recomienda un Sº bajo. En general un Sº demasiado alto conduce a efectos adversos, en este tipo de cromatografía, tales como: Reducción de la eficiencia de unión del adsorbente por impedimentos estéricos entre los sitios activos. Dificultad en la elución de la sustancia adsorbida. Incremento del grado de interacciones no específicas, reduciendo la selectividad del adsorbente. De aquí, que para un adsorbente eficiente (agarosa), se recomienda un Sº de 1-10 μmoles 11
de ligando por ml de gel. Para proteínas como L, es de 5-10 mg/ml de gel y para inmunoadsorbentes un Sº menor puede ser más eficiente. 3.3. Como determinar la cantidad de L inmovilizado? Pues bien, existen dos formas: la evaluación directa y la evaluación indirecta. 3.3.1. Evaluación directa. Si el L contiene nitrógeno, se mineraliza el soporte y el nitrógeno resultante se mide por micro kjeldhal. Evaluación espectrofotométrica, si el L tiene una absorbancia típica a una determinada longitud de onda. Evaluación directa de grupos funcionales del L (aminos ó carboxilos). 3.3.2. Evaluación indirecta. Cálculo diferencial de la cantidad de L original y la cantidad encontrada en las fracciones de lavado. 3.4. Cómo determinar la capacidad de un adsorbente? Una de las formas, pudiera ser, por recirculación de una concentración en exceso de P, a través de la columna, durante un tiempo y análisis diferencial de la cantidad de P original utilizada y la cantidad no adsorbida. 4. Empaquetamiento del gel. Al igual que en la cromatografía de adsorción convencional, la relación altura-diámetro de la columna debe estar en el rango de 1-6. Entre las recomendaciones por Pharmacia tenemos: K 9/15, 9/30, 15/30 y 16/20. En la mayoría de los casos el tamaño de columna depende de la capacidad del adsorbente y de la cantidad de sustancia a ser purificada. El volumen de adsorbente se selecciona sobre la base de usar sólo del 15-25 % de su capacidad de adsorción. Bajo estas condiciones la molécula a separar puede ser recuperada en un volumen mínimo de eluente. Si se desea mayor productividad se recomienda trabajar a más del 15-25 % de su capacidad y luego concentrar el producto. La velocidad de flujo depende del sistema y en particular de la afinidad del P con el L. A pesar de que se han reportado flujos lineales de hasta 100 ml.cm -2.h -1, se recomienda para trabajar con presión, flujos entre 20-50 cm/h. Es imposible especificar una velocidad de flujo óptima en la cromatografía de afinidad, debido a que la velocidad de disociación varía ampliamente. A mayor kd, menor afinidad, lo que sugiere usar flujos bajos para facilitar la interacción P-L. Se recomienda, de forma general, trabajar en la adsorción con flujos lentos, el lavado con flujos más bien rápidos y la elución lenta. 5. Selección del equipamiento. 12
En este caso se trata de seleccionar una serie de aditamentos que son necesarios en una corrida cromatográfica, tales como: 1. Bomba peristáltica. 2. Uvicord. 3. Recorder. 4. Colector de fracciones. 6. Proceso de purificación. El proceso cromatográfico consta de dos pasos: a) Adsorción de la molécula a separar sobre el L inmovilizado. b) Desorción de la molécula a purificar. Éste puede realizarse tanto en batch, semibatch, como en columna. No basta que P tenga afinidad con la matriz, sino que es importante mantener la molécula en condiciones estables, tanto en la adsorción como en la desorción. El buffer utilizado para la etapa de adsorción de la muestra debe ser compatible con la misma y las condiciones de ph y fuerza iónica deben favorecer las interacciones bioespecíficas entre el L y el P. La selección de las condiciones de desorción dependen de la selección anterior del L y en particular de la constante de asociación con la molécula que se desea separar, así como de su estabilidad. 7. Aplicación de la muestra. Para ello, debemos tener en cuenta: Primero: Segundo: La muestra debe estar disuelta en el mismo buffer de equilibrio para que no se afecten las interacciones primarias L-P. El volumen, que dependen de la concentración de la muestra. Se recomienda trabajar de 5-20 mg/ml, ya que muy concentrada trae consigo un aumento de la viscosidad, lo cual dificultaría la corrida y soluciones muy diluidas, implicaría aplicar grandes volúmenes de muestra, en este caso se puede utilizar cualquier método de concentración conocido (ej. diálisis, ultrafiltración). 8. Lavado del gel. Después de la aplicación de la muestra la columna debe ser lavada con el buffer inicial de 4-10 veces el volumen del gel, para eliminar sustancias no adsorbidas, antes de comenzar la etapa de elución. 13
9. Desorción o elución de las sustancias adsorbidas. 9.1. Selectivos o específicos: En este caso se utiliza un compuesto, que tiene una afinidad específica, por el P o por el L, para desorber el producto unido al Ligando, o sea que estamos en presencia de un proceso competitivo. 9.2. No selectivos o inespecíficos: Significa que la disociación de las interacciones P-L se hace con eluentes que cambian la afinidad entre estas dos moléculas. Se puede realizar mediante variación del ph, fuerza iónica o utilización de agentes caotrópicos (urea, cloruro de guanidina) en caso de que traten de interacciones hidrofóbicas, así como el etilénglicol que reduce la polaridad. Este tipo de elución (no específica), requiere en algunos casos una elución por pasos o inclusive gradientes lineales. En ambos casos puede ser por ph (generalmente disminución de ph), por μ (generalmente aumento de μ) o combinados. El gradiente se justifica cuando el L se une a dos o más compuestos diferentes, presentes en la muestra, con constantes de disociación diferentes. 10. Desalinización de la muestra. Como generalmente se usa disminución de ph o aumento de fuerza iónica en la elución inespecífica, es importante la desalinización o diálisis de la sustancia purificada en un buffer adecuado, o sea, una rápida renaturalización del producto. Para ello podemos utilizar una columna pequeña de Sephadex G-25, el Amicón (un sistema de ultrafiltración), o cartuchos de diálisis. 11. Regeneración del gel. El reuso de un adsorbente depende de la naturaleza de la muestra y la estabilidad M-L con respecto a las condiciones de elución usadas. Uno de los métodos utilizados es lavando primero con buffer Tris-HCl. luego con buffer acetato y por último con el buffer de equilibrio. 12. Análisis de los resultados. Constituye un paso importante en un proceso de purificación, debido a que se refiere a la evaluación del producto purificado. Entre los ensayos más utilizados tenemos: Determinación de la concentración de proteínas. Determinación de la actividad enzimática. Barrido espectral. Entre los criterios de pureza pudieran utilizarse la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), SDS-PAGE, inmunoelectroforesis, focalización isoeléctrica, una cromatografía de baja presión y el HPLC. 14
13. Optimización. Cromatografía de Afinidad Depende de los resultados de la primera separación y consiste en modificaciones de velocidad de flujo, cantidad de muestra y sensibilidad entre otros. 14. Almacenamiento de los adsorbentes de afinidad. Las condiciones para el almacenamiento de los adsorbentes de afinidad preparados depende de la estabilidad de la matriz, el ligando y el enlace covalente mediante el cual el ligando es inmovilizado a la matriz. El procedimiento de inmovilización pudiera disminuir o incrementar la estabilidad del sistema. Varios procedimientos, por ejemplo el acoplamiento con epiclorhidrina y CNBr, conducen a la introducción de un entrecruzamiento o enrejado covalente en la matriz lo que conlleva a la obtención de un producto más estable. Ciertos ligandos pueden también ser estabilizados como un resultado de su inmovilización; por lo tanto la agregación y autodigestión que ocurre en solución, por ejemplo por proteasas, pudiera ser prevenida. Normalmente el adsorbente de afinidad puede ser almacenado como una suspensión en un buffer apropiado a ph fisiológico y a 4ºC por períodos de tiempos largos. Sin embargo se recomienda añadir una sustancia antimicrobiana, tal como azida de sodio para prevenir crecimiento microbiano. Para adsorbentes muy lábiles, algunas veces, la liofilización puede ser usada para incrementar el tiempo de almacenamiento. Para estar seguro que las perlas se rehincharán apropiadamente en la reconstitución con agua o buffer, es necesario prevenir que estas perlas o partículas de gel se colapsen irreversiblemente como resultado de la liofilización y después de la reconstitución se lava en un filtro de vidrio. 15. Algunas aplicaciones de la cromatografía de afinidad. 15.1. Inmunoadsorbentes. Ampliamente usados para el aislamiento de anticuerpos y antígenos puros. Ej. Protein A-Sepharose CL-4B. La proteína A se enlaza especificamente con anticuerpos de tipo IgG y en la forma inmovilizada es un adsorbente extremadamente útil, fácil de usar y alta capacidad para muchos procesos de rutina como: Aislamiento y fraccionamiento de anticuerpos tipo IgG. Purificación de subclases de IgG. Aislamiento de antígenos. Eliminación selectiva de IgG como contaminante. 15.2. Acidos Nucleicos. La similitud físico-química de los ácidos nucleicos y los bajos niveles de enzimas en su metabolismo hace a la cromatografía de afinidad, debido a su selectividad y efecto concentrador, una técnica de separación indispensable en las investigaciones con ácidos nucleicos. Ej. CNBr - activated Sepharose 4B. Usado para inmovilizar DNA en una forma 15
adecuada tanto para hibridización de ácidos nucleicos como para purificación de enzima. Lysine-Sepharose 4B. Usado para separar y fraccionar el RNAr y también para purificar DNA de doble cadena. 15.3. Proteínas del plasma. La complejidad del plasma hace que esta cromatografía sea el método más conveniente para separar muchos componentes. Ej. Blue Sepharose CL-6B. Adsorbente eficiente para eliminar la albúmina de otros componentes parcialmente purificados. Inmovilized Cibacrom Blue. Usado también para separar α 2 -macroglobulina y para separar lipoproteínas de otras proteínas del plasma. http://www.loseskakeados.com 16