INMOVILIZACIÓN D NZIMAS Prof. J.M.Sánchez-Montero Grupo de Biotransformaciones Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia
INMOVILIZACIÓN D NZIMAS DFINICIÓN: CONFINAMINTO FÍSICO D UNA NZIMA O CÉLULA N UNA DTRMINADA RGIÓN DL SPACIO, D MANRA QU SU ACTIVIDAD CATALITICA S RTNGA, Y PUDA SR RUTILIZADA. 1971, 1 er nzyme ngineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA. POSTRIOR SIMPLIFICACIÓN DL TÉRMINO: BIOCATALIZADORS INMOVILIZADOS NZIMAS, CÉLULAS NTRAS U ORGÁNULOS CLULARS (O BIN COMBINACIONS D LLOS) QU S NCUNTRAN N UN STADO TAL QU S PRMIT SU RUTILIZACIÓN Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
PARA UNIFICAR CRITRIOS A LA HORA D CARACTRIZAR UN CATALIZADOR INMOVILIZADO, L WORKING PARTY ON APPLID BIOCATALYSIS, NCUADRADO DNTRO D LA FDRACIÓN UROPA D BIOTCNOLOGÍA DFINIÓ UNAS LÍNAS MASTRAS (GUIDLINS) CON OBJTO D RSPONDR A PRGUNTAS TIPO: QUÉ CANTIDAD D NZIMA LIBR S NCSITA PARA PRPARAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO ACTIVO? QUÉ PARÁMTROS GOBIRNAN UNA RACCIÓN BIOCATA LIZA DA? QU RNDIMINTO COMPARADO PRSNTA UNA RACCION BIOCATALIZADA POR NZIMAS O CÉLULAS LIBRS FRNT A SISTMAS INMOVILIZADOS? Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
RQUISITOS MÍNIMOS PARA PODR CARACTRIZAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO 0.- DSCRIPCIÓN GNRAL. 0.1.- SQUMA D RACCIÓN 0.2.- NZIMA Y MICROORGANISMO 0.3.- TIPO D SOPORT 0.4.- MÉTODO MPLADO PARA LA INMOVILIZACIÓN 1.- PRPARACIÓN DL CATALIZADOR INMOVILIZADO. 1.1.- MÉTODO D INMOVILIZACIÓN, CONDICIONS D RACCIÓN. 1.2.- RNDIMINTO POR PSO SCO, ACTIVIDAD DL SOBRNADANT. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
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2.- CARACTRIZACION FISICO- QUIMICA. 2.1.-FORMA DL BIOCATALIZADOR 2.2.-DIÁMTRO MDIO D PARTÍCULA HÚMDA 2.3.-CAPACIDAD D HINCHAMINTO 2.4.-COMPORTAMINTO N COLUMNAS (COMPRSIBILIDAD) 2.5.-ABRASIÓN N RACTORS AGITADOS 2.5.-ABRASIÓN N RACTORS D LCHO FLUIDIZADO. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
3.-CINTICA DL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO. 3. 1.-STUDIO D LA VARIACIÓN D LA VLOCIDAD INICIAL D RACCIÓN FRNT A LA VARIACIÓN D LAS CONCNTRACIONS D NZIMA Y D SUSTRATO. 3.2.- FCTO DL TIPO D BUFFR Y DL ph. 3.3.- LIMITACIONS DIFUSIONALS N L SISTMA (FCTO DL TAMAÑO D PARTÍCULA Y LA CARGA NZIMÁTICA) 3.4.- GRADO D CONVRSIÓN FRNT A TIMPO D RSIDNCIA. 3.5.- STABILIDAD DL BIOCATALIZADOR N L ALMACNAMINTO (VLOCIDAD INICIAL RSIDUAL TRAS L ALMACNAMINTO A DIFRNTS TIMPOS N DIFRNTS CONDICIONS.) 3.6.- STABILIDAD OPRACIONAL (VLOCIDAD INICIAL RSIDUAL DSPUÉS D DIFRNTS CICLOS CATALÍTICOS).. OBJTIVO: MAYOR RPRODUCIBILIDAD Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
VNTAJAS INCONVNINTS D LA INMOVILIZACIÓN PUNTO D VISTA BIOQUÍMICO VNTAJAS: 1.- Disminución de problemas de autolisis (proteasas) o de agregación, al estar limitados los movimientos rotacionales y translacionales. 2.- Se ralentizan los cambios conformacionales, por lo que se pueden estudiar las relaciones estructura-función. 3.- Se pueden simular reacciones in vivo. 4.- Se pueden simular sistemas estructuralmente asimétricos (ej. estudios de membranas). 5.- n sistemas entrecruzados, se pueden fijar interacciones con fosfolípidos, polisacáridos... para simular orgánulos celulares. 6.- La unión multipuntual a soportes deformables permite estudiar la deformación de proteínas globulares. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
VNTAJAS INCONVNINTS D LA INMOVILIZACIÓN PUNTO D VISTA BIOQUÍMICO DSVNTAJAS: 1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática al inmovilizar. 2.- Si la preparación enzimática no es homogénea, se dificulta la interpretación de los datos. 3.- A veces, se pueden originar contactos proteína-proteína indeseados. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
VNTAJAS INCONVNINTS D LA INMOVILIZACIÓN PUNTO D VISTA APLICADO VNTAJAS: 1.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o célula inmovilizada. 2.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimática por la capacidad de reutilización. 3.- Se aumenta la facilidad de recuperación y purificación de los productos. 4.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseños ingenieriles 5.- Se aumenta la facilidad de operación y control del proceso, al trabajar en condiciones más suaves. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
VNTAJAS INCONVNINTS D LA INMOVILIZACIÓN PUNTO D VISTA APLICADO DSVNTAJAS: 1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática. 2.- Se aumentan los problemas difusionales. 3.- Se aumenta el costo del proceso. 4.- l intervalo de ph de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador nativo. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
MÉTODOS D INMOVILIZACIÓN: xisten varias metodologías. 1.- RTNCIÓN QUÍMICA 1.1.- nlaces covalentes 1.2.- nlaces no covalentes. Adsorción. 1.3.- Reticulado (cross-linking) 2.- RTNCIÓN FÍSICA = ATRAPAMINTO 2.1.- Atrapamiento en matrices. 2.1.1.- n geles o polímeros. 2.1.2.- Micelas reversas. 2.2.- Atrapamiento en membranas. 2.2.1.- n fibras huecas. 2.2.2.- n reactores de membrana. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
1.- RTNCIÓN QUÍMICA 1.1.- nlaces covalentes 1.2.- nlaces no covalentes. Adsorción. 1.3.- Reticulado (cross-linking) Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
2.- RTNCIÓN FÍSICA = ATRAPAMINTO 2.1.- Atrapamiento en matrices. 2.1.1.- n geles o polímeros. 2.1.2.- Micelas reversas. 2.2.- Atrapamiento en membranas. 2.2.1.- n fibras huecas. 2.2.2.- n reactores de membrana. Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
Métodos químicos Métodos físicos nlace covalente ntrecruzamiento Intramolecular Atrapamiento en gel polimérico Adsorción (no covalente) Atrapamiento en fibras ntrecruzamiento Intramolecular Copolimerización de la enzima modificada con un monómero insaturado en un gel 3D Microencapsulación Atrapamiento en láminas de un polímero semipermeable - + + - - - Adsorción iónica Atrapamiento en fibras huecas Atrapamiento en liposomas Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
LCCIÓN DL MÉTODO D INMOVILIZACIÓN: COMPARACIÓN D LOS MÉTODOS MÉTODO INCLUSIÓN MMBRANAS ATRAPAMINTO RTICULADO ADSORCIÓN UNIÓN COVALNT PRPARACIÓN INTRMDIA DIFÍCIL INTRMDIA SNCILLA DIFÍCIL FURZA D LA UNIÓN DÉBIL MDIA DBIL-MDIA MDIA FURT ACTIVIDAD NZIMÁTICA MDIA-ALTA BAJA BAJA MDIA-ALTA ALTA RGNRACIÓN DL SOPORT POSIBL IMPOSIBL IMPOSIBL POSIBL DIFÍCIL COST MDIO-ALTO MDIO MDIO BAJO ALTO STABILIDAD MDIA ALTA ALTA BAJA ALTA VALIDZ GNRAL GNRAL LIMITADA GNRAL LIMITADA RSISTNCIA CONTAMINACIÓN A SI SI SI NO NO Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña
RQUISITOS LÓGICOS MÍNIMOS La enzima o célula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas. Si se emplean agentes entrecruzantes, éstos no deben afectar al centro activo. Si pudieran interferir con éste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo más grande posible. Si es posible, se debería proteger el centro activo: si existen grupos -SH, éstos deben hacerse reaccionar con cisteína o glutation, para reactivarse posteriormente tras la inmovilización. se puede realizar la inmovilización en presencia de concentraciones saturantes de sustrato. l proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima. Coherencia con la posterior biotransformación. si soporte = polianión, la conversión de un sustrato aniónico será muy difícil (repulsión) enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el resultado será malo. Gran importancia de las propiedades mecánicas (estabilidad del soporte, forma física del mismo) l soporte debe presentar una alta superficie específica, para minimizar los problemas de transferencia de materia. l soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminación microbiana. l soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading"). l soporte debe ser comercialmente accesible: bajo precio buena disponibilidad Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, spaña