SUSCEPTIBILIDAD ANTIFÚNGICA DE AISLAMIENTOS DE ESPECIES DEL GÉNERO MALASSEZIA. Lic. Yadileiny Portilla Tundidor 1, Dr. C. Carlos M. Fernández Andreu 2, Dra. C. María Teresa Illnait Zaragozí 2 1. Universidad de Matanzas Camilo Cienfuegos, Vía Blanca Km.3, Matanzas, Cuba. 2. Departamento de Micología del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí (IPK), Habana, Cuba. Resumen. Las especies del género Malassezia son organismos levaduriformes que adquieren una importancia considerable por su asociación a procesos patológicos como agentes de micosis superficiales o de infecciones sistémicas, siendo hoy consideradas entre los patógenos oportunistas emergentes de gran importancia. Los estrictos requerimientos de estas levaduras complican el estudio de la sensibilidad antifúngica in vitro por lo que nuestra investigación tiene como objetivo evaluar la susceptibilidad antifúngica de aislamientos de Malassezia. Los resultados obtenidos arrojan que todas las especies de Malassezia fueron inhibidas en mayor o menor grado, se observaron diferencias ante la susceptibilidad de los antifúngicos evaluados para los distintos aislamientos, el antifúngico con mayor halo de inhibición fue el ketoconazol. Estos resultados pueden ser empleados en el tratamiento de las enfermedades en las que estas levaduras están implicadas. Palabras claves: Malassezia; dermatomicosis; susceptibilidad; antifúngicos; ketoconazol. VI Convención Internacional de la Universidad de Matanzas CIUM' 2013
Introducción. Las especies del género Malassezia son organismos levaduriformes lipodependientes que adquieren una importancia considerable por su asociación a procesos patológicos como agentes de micosis superficiales o de infecciones sistémicas, siendo hoy consideradas entre los patógenos oportunistas emergentes de gran importancia (Celis y Cepero 2005). El género Malassezia comprende levaduras que tienen su hábitat natural en la piel humana y de otros mamíferos (Crespo et al., 2008), ya sea de individuos enfermos o sanos, (Torres et al., 2008). Se comportan como oportunistas si encuentran alteraciones de la piel así como un microclima adecuado para su desarrollo, son varios los factores exógenos y endógenos que influyen en su desarrollo (Tango y Vargas 2009). Las especies de Malassezia se relacionan con dos grupos de enfermedades: como agente causal en pitiriasis versicolor, foliculitis y fungemia, y como factor asociado a dermatitis seborreica, psoriasis, dermatitis atópica, papilomatosis reticulada y confluente de Gougerot y Cartaud, onicomicosis y pustulosis neonatal (Ashbee 2007). En algunos de estos casos el aislamiento de Malassezia fue considerado como el causante de la enfermedad, pero esto puede no ser correcto debido a que es comensal en la piel. Esta levadura también esta implicada en infecciones más profundas que las anteriores como: mastitis, sinusitis, artritis séptica y otitis externa maligna (Crespo et al., 1999 y Aspiroz et al., 2001). Aunque el diagnóstico clínico resulta relativamente sencillo, es imprescindible la realización de exámenes microbiológicos que confirmen el diagnóstico. Estos exámenes comienzan a partir de la toma de muestra y comprenden la observación microscópica de las escamas obtenidas de las lesiones, su cultivo en medios adecuados para el aislamiento del agente causal y su posterior identificación. Los estrictos requerimientos de estas levaduras complican el estudio de la sensibilidad antifúngica in vitro. Se ensayan diferentes metodologías, pero aún no existe un método estandarizado ni el criterio para determinar las concentraciones mínimas inhibitorias o fungicidas. Establecer criterios de la acción de antifúngicos y su actividad in vitro es complicado hasta nuestros días (Giusiano 2006). Malassezia es sensible in vitro a los compuestos azólicos a bajas concentraciones, siendo el ketoconazol el más potente inhibidor, seguido por el itraconazol. Además presenta susceptibilidad aunque con una mayor variabilidad entre las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI), frente a antifúngicos como: fluconazol, bifonazol, econazol, miconazol, clotrimazol y nuevos azólicos como el albaconazol y voriconazol (Mellen et al., 2004 y Ashbee 2007). En el año 2003 en estudios realizados por Garau se logró determinar la CMI de ocho antifúngicos (5-fluorocitosina, fluconazol, ketoconazol, itraconazol, voriconazol, albaconazol, anfotericina B y terbinafina) frente a las diferentes especies de Malassezia, mediante una técnica de microdilución colorimétrica en el medio líquido de Leeming-
Notman, donde se constató que la droga menos activa in vitro fue la 5-fluorocitosina, seguida por el fluconazol, anfotericina B, terbinafina, voriconazol, albaconazol, itraconazol y ketoconazol. Gupta et al. (2004), relataron la variación de la susceptibilidad in vitro entre las especies frente agentes antifúngicos tales como ketoconazol, itraconazol, voriconazol y terbinafina, reafirmando que es el ketoconazol el más efectivo ante las especies del género Malassezia (Ade et al., 2008). Se conoce de las variaciones en la sensibilidad a los compuestos azólicos entre algunas de las especies del género, aunque es importante aclarar que estos estudios no incluyen muchas de las especies descritas en los últimos años de investigación. Las especies más sensibles son: M. sympodialis, M. slooffiae y M. obtusa, mientras que M. globosa, M. restricta, M. pachydermatis y M. furfur son las menos sensibles. Dentro de ellas, la especie que demostró mayor sensibilidad fue M. sympodialis y las menos sensibles fueron M. pachydermatis y M. furfur (Nakamura et al., 2000 y Giusiano 2006). Desarrollo. Se tomaron 20 aislamientos previamente identificados hasta especie del género Malassezia para la evaluación de los siguientes fármacos: fluconazol (100 µg), ketoconazol (10 µg) e itraconazol (50 µg) (Liofilchem, Italia). Se siguió la metodología descrita en el documento del CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute) M44A-2008 para levaduras modificado. Para el ensayo de susceptibilidad se inoculó en el medio agar Mueller Hilton modificado al cual se le adicionaron suplementos lipídicos (glicerol- 1µL, ácido oleico- 1µL y Tween 40-5 µl para 1L) con una suspensión fúngica de 3x10 6 células/ ml (turbidez similar al patrón #10 de la escala de MacFarland), aplicando con un hisopo estéril en una placa de Petri y por último se colocaron los discos correspondientes a los antifúngicos antes mencionados. Se incubaron las placas a 32 C por 7 días y posteriormente se midieron los halos de inhibición y de crecimiento para cada aislamiento (Giusiano 2006 y Ashbee 2007). Resultados. De los 20 aislamientos a los que se le determinó la susceptibilidad antifúngica se constató que la mayor actividad la presentó el ketoconazol, seguido por itraconazol y por último fluconazol (Tabla. I). La especie que presentó un mayor halo de inhibición fue M. obtusa y la menos inhibida por los azoles empleados fue M. globosa. Tabla I. Diámetro de los halos de inhibición de los aislamientos de Malassezia ante los discos de azoles ensayados.
En la Figura 1 se observa el halo de inhibición del ketoconazol como antifúngico más efectivo. Figura 1. Halo de inhibición de un aislamiento de M. furfur empleando como antifúngico el ketoconazol. Discusión. Aunque se han ensayado diversas metodologías en la actualidad no existe un método estandarizado para determinar la susceptibilidad antifúngica en especies de Malassezia por lo que resulta difícil llegar a conclusiones acerca de la actividad de los antifúngicos evaluados en el presente estudio. Nuestros resultados aunque preliminares, demostraron que el ketoconazol es el más potente inhibidor seguido de itraconazol, lo que coincide con lo reportando por Garau et al. (2003) y Giussiano (2006). Se encontraron también variaciones en la sensibilidad a los compuestos azólicos evaluados en algunas de las especies lo que pudiera tener implicaciones importantes a tener en cuenta en la terapéutica (Nakamura et al., 2000).
Conclusiones. El estudio realizado de suceptibilidad antifúngica de aislamientos de especies del género de Malassezia demostró que no todas las especies fueron inhibidas en mayor o menor grado, se observaron diferencias ante la susceptibilidad de los antifúngicos evaluados para los distintos aislamientos de Malassezia. Se reconoce al ketoconnazol como el antifúngico más efectivo frente a especies de Malassezia. Bibliografía. ADE, K., K. BRAMONO Y I. M. WISNU. Identification of Malassezia species from pityriasis versicolor in Indonesia and its relationship with clinical characteristics. Mycoses, 2008, 52: p. 257-262. ASHBEE, H. Update on the genus Malassezia. Medical Mycology, 2007, 45: p. 287-303. ASPIROZ, C., M. ARA, M. VAREA, A. REZUSTA Y C. RUBIO. Isolation of Malasseziaglobosa and M. sympodialis from patients with pityriasis versicolor in Spain. Mycopathologia, 2001, 154, p. 111-117. CELIS, A. Y M. CEPERO. Polimorfismos genéticos de aislamientos del género Malassezia obtenidos en Colombia de pacientes con lesión dermatológica y sin ella. Biomédica, 2005, 25, p. 481-487. CRESPO, V., A. OJEDA, A. VERA, A. CRESPO Y F. SÁNCHEZ. Aislamiento e identificación de Malassezia spp. en pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica y piel sana. Rev Iberoam Micol., 1999, 16, p. 16-21. CRESPO, V., E. GÓMEZ Y M. CRESPO. La pitiriasis versicolor y las levaduras del género Malassezia. Actas Dermosifiliogr., 2008, 99, p. 764-771. GARAU, M., M. PEREIRO Y A. DEL PALACIO. In Vitro Susceptibilities of Malassezia Species to a New Triazole, Albaconazole (UR-9825), and Other Antifungal Compounds. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2003, 47(7): p. 2342-2344. GIUSIANO, G. Malassezia, Estado del conocimiento y perspectivas en su estudio. Revista Argentina de Microbiología, 2006, 38, p. 41-48. GUPTA, A.K., R. BATRA, R. BLUHM, T. BOEKHOUT Y T. DAWSON. Skin diseases associated with Malassezia species. J Am Acad Dermatol., 2004, 51: p. 785-798. MELLEN, L.A., J. VALLEE, S.R. FELDMANAND Y A.B. FLEISCHER. Treatment of pityriasis versicolor in the United State. Journal of Dermatological Treatment, 2004, 15: p. 189-192.
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