REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet -http://revista.veterinaria.org Vol. 11, Nº 03, Marzo/2010 http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n030310.html Hallazgo de Ehrlichiosis canina causada por E. canis en una Comunidad del Municipio de Find of canine Ehrlichiosis caused for E. canis in a Community of León's Municipality, Nicaragua) Vanessa Rivas Lara; Daniel Morales Arancibia; Milton Saenz; José Luis Bonilla. Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI), Dpto. Sanidad Animal, Escuela de Veterinaria, Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua, León (UNAN - LEÓN) Tutor principal: MSc. José Luis Bonilla, DMV. Microbiología e Inmunología Veterinaria Director CEVEDI Dpto. Sanidad Animal Escuela de Veterinaria UNAN-LEON e-mail: jlbovibonilla81@yahoo.es, jlbones81@gmail.com Resumen La ehrlichiosis es una enfermad producida por bacterias intracelulares obligadas del género Ehrlichia que en los canes (Canis familiaris) se caracteriza por pancitopenia. El objetivo del presente trabajo es dar a conocer la situación de la Ehrlichiosis canina en una comunidad del municipio de León, mediante una evaluación sanguínea, tinción y detección serológica a través de un test inmunocromatográfico. Materiales y Método: Tamaño y toma de muestra; El estudio se realizó en 27 caninos (Canis familiaris) tomados al azar pertenecientes a la Comunidad Rubén Darío, Municipio de León. Se realizó la toma de muestra de sangre entera mediante venopunción cefálica y se depositó en tubos con y sin EDTA. Las muestras fueron remitidas al Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI) de la Escuela de Veterinaria UNAN-LEON. Análisis de las muestras; A todas las muestras se les realizó Biometría Hemática Completa (BHC), extendido periférico y una prueba rápida para la detección de Ehrlichia canis. Resultados: De un total de 27 muestras se encontró un 70% de los animales con valores bajos de hematocrito, un 77,7% tenía los niveles de hemoglobina por debajo del parámetro fisiológico y el 85% de los casos presentó un conteo eritrocitario bajo de lo normal. En el extendido periférico no se identificaron cuerpos de inclusión intracitoplasmático en eritrocitos o leucocitos compatibles con 1
Ehrlichia. A las 27 muestras se les realizó también un ensayo inmunocromatográfico (SNAP) donde se detectó E. canis en un 63% de los casos. Conclusiones: La mayoría de los animales presentó valores de hematocrito, hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los parámetros fisiológicos. No se observaron cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos compatibles con erhlichia en trombocitos y monocitos con la tinción de Giemsa. Se detectaron anticuerpos frente a Ehrlichia canis, mediante el test inmunocromatográfico. Palabras claves: Ehrlichia canis, perros (Canis familiaris), inmunocromatografía, biometría hemática completa. Abstract The ehrlichiosis is a disease produced by intracellular bacteria forced of the kind Ehrlichia that in the dogs (Canis familiaris) is characterized for pancytopenia. The aim of the present work is to announce the situation of the canine Ehrlichiosis in a community of León's municipality, by means of a blood evaluation, tint and serologic detection across an immunochromatographic test. Materials and Method: Size and capture of sample; the study were carried out in 27 dogs (Canis familiaris) taken at random belonging to the Community Ruben Dario, León's Municipality. There was realized the capture of sample of entire blood by means of cephalic venopuntion and settled in pipes with and without EDTA. The samples were sent to the Veterinary Center of Diagnosis and Research of the School of Veterinary, UNAN-LEON. Analysis of the samples; To all the samples they there was realized Complete Biometry Blood, extended peripheral and a rapid test for the detection of Ehrlichia canis. Results: Of 27 samples be found 70 % of the animals with low values of hematocrite, 77,7 % had the levels of hemoglobin below the physiological parameter and 85 % of the cases presented a count red blood low of the normal thing. In the widespread peripheral bodies of inclusion were not identified intracitoplasmic in red blood or leukocytes compatible with Ehrlichia. To 27 samples (SNAP) realized also an immunochromatographic test where it was detected E. canis in 63 % of the cases. Conclusions: The majority of the animals presented values of hematocrite, hemoglobin and count red blood below the physiological parameters. Bodies of inclusion were not observed intracitoplasmatics compatible with Erhlichia in trombocites and monocites with Giemsa's tint. Antibodies were detected opposite to Ehrlichia canis, by means of the immunochromatographic test. 2
Keys Words: Ehrlichia canis, dogs (Canis familiaris), immunochromatographic test, complete biometry blood. Introducción La Ehrlichiosis es una enfermedad causada por una bacteria intracelular obligada, Gram positiva, que requiere de un mamífero como reservorio y de un artrópodo como vector. Presenta tropismo por células sanguíneas (leucocitos y plaquetas) de animales y humanos, e invade su citoplasma, alojándose dentro de vacuolas, donde se multiplica por fisión binaria, dando origen a un agregado de la bacteria o microcolonia, que por su apariencia se ha denominado "mórula" (Pérez et al., 2006). Actualmente este género comprende cinco especies, de las cuales Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis y Ehrlichia ewingii tienen la capacidad de causar enfermedad en caninos y humanos (Buller et al., 1999; Pérez et al., 2006). Ehrlichia canis es la especie representante del género y es el agente clásico causante de la ehrlichiosis monocítica canina o pancitopenia tropical canina, importante no sólo por su amplia distribución en el trópico y subtrópico de todo el mundo, sino también, por el hallazgo de afectación de humanos (Pérez et al., 2006). E chaffeensis fue inicialmente reportada en infecciones en humanos y posteriormente en caninos, mientras que E. ewingii se encontró en granulocitos de perros enfermos y más tarde de forma inesperada en muestras de humanos, existiendo hasta el momento evidencia molecular de estos últimos dos agentes únicamente en Estados Unidos, además de un reporte de E. ewingii en perros de Camerún. Para el diagnóstico de la ehrlichiosis se emplean diversas técnicas laboratoriales como la identificación de cuerpos de inclusión en frotis sanguíneos, el aislamiento primario mediante cultivo celular, la detección de anticuerpos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación. La evaluación microscópica de cuerpos de inclusión en frotis sanguíneos resulta una técnica rápida, sencilla y económica, sin embargo, aproximadamente sólo en un 4% de los casos agudos es posible demostrar la mórula intracitoplasmática de E. canis (Waner y Harrus, 2000), mientras que para las demás especies no se reporta la eficacia de la prueba. 3
En el caso del aislamiento in vitro de Ehrlichia, E. canis y E. chaffeensis han logrado cultivarse en la línea celular macrófago-monocítica canina DH82, derivada de un caso de histiocitosis maligna canina (Dawson et al., 1991); sin embargo, E. ewingii no ha sido posible de aislar hasta la fecha (Dawson et al., 1996; Dumler et al., 2001). Desventajas importantes del aislamiento en cultivo celular, son la necesidad de experiencia técnica y períodos prolongados de hasta 34 días para la obtención de resultados (Waner & Harrus, 2000; Standaert et al., 2000; Iqbal et al., 1994), lo que convierte a esta técnica en un proceso costoso, laborioso e impráctico para el diagnóstico oportuno de la enfermedad. El aislamiento en cultivo celular es considerado, sin embargo, como la prueba de oro para el diagnóstico de ehrlichiosis. Las técnicas serológicas han sido ampliamente utilizadas en el diagnóstico de ehrlichiosis debido a que son pruebas altamente sensibles; sin embargo, presentan la desventaja de que únicamente evidencian un contacto con el agente sin determinar la existencia de la enfermedad o incluso la presencia o ausencia actual del agente en el animal (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al., 1998). Otra desventaja importante en el diagnóstico serológico, es el alto grado de reacción cruzada existente entre E. canis, E. chaffeensis y E. ewingii (Liddell et al., 2003); que dificulta la diferenciación entre especies (Waner et al., 2001) y para el caso de E. ewingii, no existen pruebas específicas disponibles, por no haberse logrado aún ningún aislamiento del agente en cultivo celular. En relación a las técnicas moleculares, diversos estudios han mostrado a la técnica de PCR como un método efectivo y extremadamente sensible para la detección de especies de Ehrlichia, incluyendo a E. ewingii (Ndip et al., 2005). La técnica de PCR convencional basado en la amplificación de regiones del gen 16S ARNr de Ehrlichia ha demostrado efectividad en muestras de sangre de humanos y perros, con un límite de detección de 20pg para ADN de E. canis extraído de células DH82 infectadas (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996), y se han obtenido aún mejores resultados, utilizando una técnica de PCR tipo anidado, que ha incrementado la sensibilidad de la prueba hasta 0.2 pg de ADN (Wen et al., 1997). Además, la técnica de PCR tipo anidado ofrece la ventaja de poder determinar las especies E. canis, E. chaffeensis y E. ewingii utilizando el mismo producto de la primera reacción. Esta técnica de PCR anidado, ha demostrado ser útil para el diagnóstico de ehrlichiosis en distintas partes del mundo como Israel, España, Estados Unidos y México (Aguirre et al., 2004; Hori-Oshima et al., 2006), ya sea para diagnosticar los agentes en muestras de humanos, venados, perros, garrapatas y coyotes (Kocan et al., 2000). 4
Otra ventaja es, la capacidad de la prueba para detectar a los agentes aún en la fase temprana de la enfermedad y en la fase subclínica, permitiendo determinar animales portadores, incluso cuando no se ha logrado establecer aún una respuesta inmune (Standaert et al., 2000), permitiendo iniciar el tratamiento incluso antes de la manifestación de signos clínicos. Estudios sobre ehrlichiosis en caninos de Nicaragua son bastante escasos. Aspectos epidemiológicos de relevancia, tales como prevalencia, y especies involucradas son aún poco comprendidos. Igualmente, se desconoce si la misma especie de ehrlichia que afecta a los caninos podría estar asociada a procesos febriles en humanos que han sido negativos por diagnóstico laboratorial a malaria, dengue, leptospirosis, entre otras. Por lo que el objetivo del presente trabajo es dar a conocer el hallazgo de Ehrlichia canis en perros de la comunidad Rubén Darío del municipio de León, mediante una evaluación sanguínea, tinción y detección serológica a través de un test inmunocromatográfico. Material y Método Tamaño y toma de muestra. Un total de 27 muestras sanguíneas fueron tomadas aleatoriamente por venopunción cefálica y periférica (oreja) en caninos (Canis familiaris). Los perros tenían aptitud de compañía con un estado nutricional regular (desperdicios de cocina) en su mayoría, casi todos los canes tenían presencia de ectoparásitos (garrapatas); pero aparentemente no presentaban ningún estado patológico, ya que tenían un buen estado de alerta. Es importante mencionar que se tuvo el consentimiento de los propietarios para realizar dicho trabajo, tomando en cuenta las buenas prácticas de asepsia y antisepsia a la hora de la toma de muestra por venopunción, el cualse realizó en casa de habitación de cada uno de los animales. Las muestras se depositaron en tubos con y sin EDTA y fueron remitidas al Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI), laboratorio de Biopatología de la Escuela de Veterinaria, UNAN-LEON. Análisis de las muestras. A todas las muestras se les realizó Biometría Hemática Completa (BHC) tomando en cuenta principalmente los valores de Hematocrito, Hemoglobina y niveles de eritrocitos; en el extendido periférico se valoró la presencia de cuerpos de inclusión compatibles con ehrlichia y finalmente a todas las muestras se les realizó una prueba rápida para la detección de Ehrlichia canis. 5
La BHC se realizó según el Manual Práctico de Análisis Clínico en Veterinaria (Marca A., 1992). El frotis de sangre periférica se tiñó con Giemsa. Primeramente el extendido es fijado con metanol (100%) dejándose 5 minutos a temperatura ambiente, luego se tiñó con solución Giemsa a razón de 3 ml de solución Giemsa diluido en 8 ml de agua destilada y se dejó 15 minutos secándose a temperatura ambiente, finalmente se lavó con agua de grifo y se dejó secar para posteriormente ser observado al microscopio con un lente de 100X con aceite de inmersión (Marca A., 1992). Para la prueba serológica se utilizó un kit inmuncromatográfico canino para la detección de anticuerpos contra E. canis de IDEXX Laboratories, se les realizó a las 27 muestras, utilizándose sangre total con anticoagulante o suero y el procedimiento se llevó a cabo según las indicaciones del kit comercial. Resultados y Discusión De un total de 27 muestras de sangre completa con y sin EDTA recolectadas, se encontró un 70% de los animales con valores bajos de hematocrito, un 77,7% tenía los niveles de hemoglobina por debajo del parámetro fisiológico y el 85% de los casos presentó un conteo eritrocitario bajo de lo normal, tal como se muestra en la tabla 1. En base a los resultados obtenidos en la BHC se muestra una disminución marcada de los valores hematológicos (Hematocrito, hemoglobina y Glóbulos Rojos) lo que significa que los pacientes caninos en su mayoría presentaban síntomas de anemia. Tabla 1. Valores Hematológicos (Hematocrito, Hemoglobina y Glóbulos Rojos) y serología encontrados en caninos (Canis familiaris) muestreados en la comunidad Rubén Darío, Municipio de León. Tabla 2. Cantidad y Porcentaje de caninos (Canis familiaris) positivos al test Inmunocromatográfico. Técnica positivos Porcentaje Microscopía 0/ 27 0% Serología 17/ 27 63% Nº Caso Hematocrito Hemoglobina Glóbulos Rojos Inmunocromatografía Rango fisiológico 37-55 (%) 12-18,0 (g/ dl) 5,5-8,5 (10 12 /l) 1 30 10 2,62 + 2 44 14,6 0,31-3 32 10,6 2,54 + 4 36 12 3,12 + 5 37 12,3 3,61 + 6 34 11,3 0,91-7 30 10 3,25-8 36 12 3,28 + 9 26 8,6 1,21 + 10 38 12,6 5,7 + 11 35 11,6 3,54-12 31 10,3 5,08 + 13 39 13 3,15 + 14 40 13,3 4,86 + 15 32 10,6 2,19-16 30 10 5,77-17 28 9,3 2,19-18 28 9,3 6,33-19 22 7,3 3,19 + 20 34 11,3 3,58 + 21 45 15 3,51 + 22 29 9,6 1,01-23 22 7,3 3,9 + 24 30 10 1,02 + 25 26 8,6 1,75 + 26 20 6,6 1,48-27 41 13,6 3,07 + 6
De las 27 muestras que se les realizó el frotis del extendido periférico teñidos con Giemsa, ninguno presentó cuerpos de inclusión dentro de plaquetas ni monocitos compatibles con Ehrlichia; según trabajos realizados en otras localidades hacen referencia a la sensibilidad baja de la técnica de tinción, lo que difulta evidenciar hemoparásitos por métodos convencionales de parasitología o biopatología, necesitándose para esto una alta parasitemia en el individuo; así lo confirma también estudios realizados en Costa Rica donde han utilizado por mucho tiempo técnicas microscópicas y que a pesar de ser muy útiles presentan baja sensibilidad (Rímolo, 2006). Cabe mencionar que la muestra de los caninos fueron tomados aleatoriamente sin tomar en cuenta la edad, el sexo y la raza; Sin embargo todos presentaban ectoparásitos (garrapatas) unos en cantidades moderadas y otros en abundancia, esto pudo ser debido a las condiciones de la localidad, ya que es una comunidad donde las calles son de tierra, existen muchos árboles y no hay un buen sistema de alcantarillado (aguas residuales). Finalmente a las 27 muestras que se les realizó el ensayo inmunocromatográfico un total de 17 (63%) muestras resultaron positivas a la prueba. Esto demuestra que el ensayo serológico es mucho más sensible. Es muy importante tomar en cuenta que ésta prueba (inmunocromatografica) es de tipo serológica y por ende puede presentar ciertas limitantes, como la imposibilidad de discernir entre una infección inicial, aguda, latente, crónica o pasada, ya que detecta anticuerpos (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al., 1998). Estudios similares han demostrado la presencia de E. canis en perros, como el de Costa Rica, donde se identificó a 8 de 30 perros seropositivos mediante serología SNAP 3X IDEXX (Luis Romero, 2007). Conclusiones La mayoría de los animales presentó valores de hematocrito, hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los parámetros fisiológicos. No se observaron cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos compatibles con erhlichia en trombocitos y monocitos con la tinción de Giemsa. Se detectaron anticuerpos frente a Ehrlichia canis, mediante el test inmunocromatográfico. Es importante valorar en estudios posteriores la relación que pueda tener E. canis detectada en el hombre, ya que por ser animales de 7
compañía se mantienen en estrecha relación, así como la presencia de garrapatas, así lo demuestra un estudio realizado en Venezuela donde se detectó la presencia en sangre humana del ADN del microorganismo, diagnosticado morfológicamente como Ehrlichia trombocítica, utilizando la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), observándose una migración electroforética igual a la de Ehrlichia platys, conocido agente de Ehrlichiosis trombocítica canina en el campo veterinario (Tamí I, Jordán L, 2002). Bibliografía Anderson BE, Dawson JE, Jones DC, Wilson KH. 1991. Ehrlichia chaffeensis, a new species associated with human ehrlichiosis. J. Clin. Microbiol. 29:2838-2842. Aguirre E; Sainz A; Dunner S; Amusategui I; López L; Rodrígues- Franco F; Luaces I; Cortés O; Tesouro MA. 2004. First isolation and molecular characterization of Ehrlichia canis in Spain. Vet. Parasitol. 125:365-372. Buller RS, Arens M, Hmiel P, Paddock CD, Sumner JW, Rikihisa Y, Unver A, Gaudreault-Keener M, Manian FA, Liddell AM, Schmulewitz N, Storch GA. 1999. Ehrlichia ewingii, a new recognized agent of human ehrlichiosis. N. Engl. J. Med. 341:148-155. Dawson JE, Anderson BE, Fishbein DB, Sanchez JL, Goldsmith CS, Wilson KH, Duntley W. 1991. Isolation and characterization of an Ehrlichia sp. from a patient diagnosed with human ehrlichiosis. J. Clin. Mirobiol. 29:2741-2745. Dawson JE, Biggie KL, Warner CK, Cookson K, Jenkins S, Levine JF, Olson JG. 1996. Polymerase chain reaction evidence of Ehrlichia chaffeensis, an etiologic agent of human ehrlichiosis, in dogs from southeast Virginia. Am. J. Vet. Res. 57:1175-1179. Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, Rikihisa Y, Rurangirwa FR. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and HE agent as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:2145-2165. Hori-Oshima S, Tinoco GL, Barreras SA, Moro M, Viñasco J. 2006. Detección de Ehrlichia canis mediante ELISA y PCR en perros de Mexicali, Baja California. In VII Congreso Nacional de Parasitología Veterinaria. Set. 28-30. Asociación Mexicana de Parasitólogos Veterinarios, A.C., México. 8
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