PRACTICA Nº 14 DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS. Determinación cuantitativa de azúcares reductores y totales (Método de Lane y Eynon) y Fibra Cruda. I. INTRODUCCIÓN. Entre los distintos componentes de los alimentos, después del agua, los carbohidratos son las sustancias más abundantes y más ampliamente distribuidas en la naturaleza; siendo la celulosa la biomolécula que se encuentra en mayor cantidad en la biosfera, y el almidón, la fuente energética alimentaria más empleada en el mundo. En todos los seres vivos se encuentran presentes los carbohidratos ya que la ribosa y la desoxirribosa son parte de su material genético. De la misma forma, en las frutas y hortalizas los carbohidratos cumplen funciones estructurales y energéticas, constituyendo algunos la estructura rígida o mecánica de los tejidos vegetales; en tanto que en las semillas, raíces y tubérculos funcionan básicamente como reservas energéticas. Por otro lado, en algunos animales estos compuestos son parte de sus reservas energéticas (glucógeno) o constituyen un componente esencial de su estructura externa (quitina). Además de ser componentes naturales de muchos alimentos, la industria alimentaria emplea los carbohidratos en función de sus propiedades funcionales, usándolos como ingredientes para mejorar la aceptabilidad, palatabilidad y vida útil de diversos alimentos. Desde el punto de vista químico, los carbohidratos pueden definirse como polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas y sus derivados. Según la anterior definición, la denominación de carbohidrato agrupa a una gran cantidad de compuestos. En la naturaleza se encuentran carbohidratos de diferente número de carbonos y distintos grupos funcionales o susbstituyentes. Esto da origen a distintos tipos de azúcares, tales como las aldosas, cetosas, azúcares acetilados, benzoesterificados y metilados, azúcares ácidos, glicósidos y 96
anhidroazúcares. De la misma forma, las moléculas de carbohidrato pueden incluir desde un solo monosacárido hasta varios miles de estos. Debido a lo expuesto anteriormente, la diversidad de sus orígenes y la gran variabilidad en su composición química, han surgido una variedad enorme de métodos de análisis de carbohidratos; ya sean dichos métodos: físicos, químicos o bioquímicos. Entre los métodos cualitativos basados en las propiedades físicas de los carbohidratos están las cromatografías en papel y capa fina, la cromatografía gas-líquido, la de intercambio iónico, la electroforesis, la refractometría, la hidrometría, la polarimetría y la espectroscopia de rayos infrarrojos. Por otro lado, entre los métodos químicos están los basados en reacciones que dan origen a compuestos coloreados, tales como las que se dan después de tratar los monosacáridos con ácido mineral fuerte y hacer reaccionar el furfural o hidroxifurfural formado, con compuestos orgánicos tales como fenoles, aminas aromáticas, urea y antrona. De la misma forma, también se hace uso de su capacidad reductora, haciéndolos reaccionar con sales de metales como el cobre, hierro, yodo, plata y cerio. Por último, también es posible su análisis basándose en la capacidad de formar complejos coloreados con el yodo, tal como sucede con el almidón. En relación con los métodos bioquímicos de análisis de carbohidratos, estos pueden ser microbiológicos o emzimáticos. Los primeros se basan en la capacidad de ciertas cepas de lavaduras de fermentar específicamente algunos grupos de azúcares; dichas levaduras son especialmente útiles a la hora de diferenciar entre pentosas y hexosas, incluyendo los polímeros de ambas. Con respecto a los métodos enzimáticos, estos incluyen los análisis de monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. En el caso de los dos últimos, el análisis incluye la hidrólisis enzimática de los enlaces glicosídicos. 97
II. Determinación cuantitativa de azúcares reductores y totales (método de Lane y Eynon). Existen diversos métodos de cuantificación de carbohidratos basados en la capacidad reductora de los azúcares que tienen libre el grupo carbonilo. Estos carbohidratos son capaces de reducir elementos como el cobre (Cu +2 ), el hierro (Fe +3 ) o el yodo (I 0 ). En el caso específico del cobre, este es reducido desde Cu +2 a Cu +1. En este sentido, en el método de Lane y Eynon (1923) se hace reaccionar sulfato cúprico con azúcar reductor en medio alcalino, formándose oxido cuproso, el cual forma un precipitado rojo ladrillo. Este método utiliza azul de metileno como indicador, el cual es decolorado una vez que todo el cobre ha sido reducido, lo que indica el fin de la titulación. A. Reactivos: 1. Solución de Fehling A (34,639 g de CuSO 4 5H 2 O en 500 ml de agua) 2. Solución de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y NaOH en 500 ml de agua) 3. Azul de metileno (1%) 4. Solución patrón de glucosa al 1% 5. Solución diluida de glucosa (50 mg/ml), preparada a partir de la solución patrón de glucosa (1%) 6. Solución de acetato básico de plomo al 30% 7. Oxalato de sodio o potasio en polvo 8. Solución de HCl 1:1 9. Solución de NaOH 6 N. B. Procedimiento: A.- Estandarización de la solución de Fehling: Colocar la solución diluida de glucosa en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solución de Fehling A y 5 ml de solución de Fehling B. Añadir 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullición la solución de Fehling y agregar lentamente la 98
solución de glucosa sin dejar de calentar, hasta que desaparezca la coloración azul. En el momento en que desaparece el color del indicador, en los bordes del fondo de la fiola se puede observar cierto tono rojizo. Nota: durante todo el tiempo en que se añade la solución de glucosa, la solución de Fehling debe mantenerse en ebullición. B.- Preparación de la solución clarificada de azúcares: Pesar una cantidad de muestra tal que en la solución final clarificada, la concentración de azúcares reductores sea de 2 a 5 mg/ml (para gastar entre 10 y 25 ml de dicha solución por cada 10 ml de solución de Fehling). Homogeneizar la muestra con 50 ml de etanol al 80% (v/v) y traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml; aforar con etanol (80%), mezclar bien y filtrar. Tomar una alícuota de 25 ml de la solución filtrada y colocarla en una matraz aforado de 250 ml. Diluir con 50 ml de agua destilada y añadir unos pocos mililitros de solución de acetato de plomo (30%), hasta lograr la precipitación completa (en el caso de jugos, pulpas y mermeladas de frutas es suficiente añadir 1 o 2 gotas de la solución de acetato de plomo al 30%). Mezclar bien y filtrar. Agregar al filtrado oxalato en polvo en pequeñas porciones (una cantidad muy pequeña tomada con la punta de una espátula para evitar el profusión de oxalato) hasta eliminar el exceso de acetato de plomo. Mezclar y filtrar descartando los primeros mililitros. El filtrado debe quedar perfectamente transparente. C.- Determinación de azúcares reductores (originalmente presentes): Tomar una alícuota de 25 ml, colocarla en un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua, mezclar bien y colocar la solución en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solución de Fehling A y 5 ml de solución de Fehling B. Añadir 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullición la solución de Fehling y proceder igual a como se hizo durante la estandarización de la solución 99
de Fehling. D.- Determinación de azúcares totales: En un vaso de precipitados de 100 ml, colocar una alícuota de 25 ml de solución clarificada. Agregar 5 ml de solución de HCl (1:1) y calentar a 70 C durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y con ayuda de un potenciómetro llevar a ph 8,2 utilizando una solución 6N de NaOH (en caso de no disponer de un potenciómetro, añadir 2 o 3 gotas de fenolftaleína y titular lentamente con la solución de hidróxido de sodio hasta el cambio de viraje del indicador, luego añadir lentamente, gota a gota HCl (1:1) hasta la desaparición del color rosado). Una vez alcanzado el ph indicado, pasar la solución cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua, mezclar bien y colocar la solución en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solución de Fehling A y 5 ml de solución de Fehling B. Añadir 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullición la solución de Fehling y proceder igual a como se hizo durante la estandarización de la solución de Fehling. Nota: los azúcares no reductores son calculados restando al contenido de azúcares totales, el contenido de azúcares reductores. Para convertir este valor en contenido de sacarosa, se debe considerar la suma de los pesos moleculares de la glucosa y la fructosa (360 g/mol) y el de la sacarosa (342 g/mol). 2.- Determinación de fibra cruda. La fibra cruda está constituida por los carbohidratos presentes en los alimentos que no son digeridos por las enzimas de los animales. Metodológicamente, ésta es el residuo orgánico insoluble resistente a la hidrólisis ácida (H 2 SO 4 al 1,25%) y básica (NaOH al 1,25%) (Norma COVENIN 1194-79). El residuo obtenido de esta forma contiene minerales y una mezcla de materiales componentes de la pared celular de los vegetales que no corresponde a ningún compuesto específico; correspondiendo aproximadamente el 97% de tales compuestos a celulosa y lignina. 100
ESQUEMA DE DETERMINACIÓN DE AZUCARES EN MERMELADA. 101
A pesar de que con el análisis de fibra cruda se pretende cuantificar carbohidratos componentes de la pared celular de los vegetales, según el alimento analizado, durante la determinación se pierde entre el 20 y el 60% de la celulosa original presente y entre el 33 y el 96% de la lignina. Reactivos: 1.- Solución de ácido sulfúrico al 1,25% 2.- Solución de hidróxido de sodio al 1,25% 3.- Etanol al 95% Procedimiento: Pesar aproximadamente 2 g de muestra (en el caso de muestras que no estén secas utilizar un vidrio de reloj para pesar la muestra). Transferir cuantitativamente la muestra al vaso de precipitados especial del equipo de extracción y añadir algunas perlas de vidrio. Agregar 200 ml de la solución de H 2 SO 4 (1,25%) hirviente, conectar el vaso de precipitados al condensador de reflujos y mantener la muestra en ebullición durante 30 minutos exactamente. Durante la ebullición, el contenido del vaso de precipitados debe mantenerse perfectamente mezclado. Transcurridos los 30 minutos, retirar el vaso de precipitados del condensador y filtrar la solución a través de un embudo de porcelana con lana de vidrio como material filtrante. Una vez filtrada la solución, lavar el residuo del embudo con agua hirviente, haciendo pasar el agua a través del vaso de precipitados. Se debe lavar el contenido del filtro hasta que el agua salga a ph neutro. Transferir cuantitativamente el residuo del embudo al vaso de precipitados (incluyendo la lana de vidrio) y agregar 200 ml de la solución de NaOH (1,25%) hirviente. Luego conectar el vaso de precipitados al condensador de reflujos y proceder de igual manera a como se hizo durante la digestión ácida. Después de los 30 minutos de digestión alcalina, retirar el vaso de precipitados del condensador y filtrar de igual forma que en la digestión ácida, lavando con agua hirviente hasta que el agua salga a ph neutro. 102
Lavar el residuo con etanol (95%) y transferir totalmente su contenido a una cápsula de porcelana. Colocar la cápsula de porcelana en una estufa a 100 C hasta llegar a peso constante. Una vez esto, pasar la cápsula a un desecador y pesarla cuando se encuentre a temperatura ambiente. Poner la cápsula de porcelana en una mufla y mantener a 600 C hasta la destrucción total de toda la materia orgánica. Una vez destruida la materia orgánica, colocar la cápsula en un desecador y pesar al alcanzar la temperatura ambiente. Nota: el contenido de fibra cruda en el peso de muestra corresponde a la pérdida de peso después de la incineración. 103