Expresión Génica GENOMA Transcripción Acceso al genoma Ensamblado del complejo de iniciación de la transcripción Síntesis de ARN Procesamiento del ARN Estabilidad del ARN (degradación, localización) TRANSCRIPTOMA Colección de moléculas de ARN cuya información genética es requerida por la célula en un determinado momento Traducción Ensamblado del complejo de iniciación Síntesis de proteínas Plegamiento y Procesamiento de proteínas Degradación del Proteínas PROTEOMA Repertorio de proteínas celulares 1
Transcripción 1) Reconocimiento del Promotor 2) Iniciación: Ensamblado del complejo de iniciación Unión de RNA pol sola o con proteínas accesorias a su promotor Conversión de Complejo de iniciación cerrado Complejo de iniciación abierto (ruptura de la unión H entre algunas bases en el sitio de iniciación) Síntesis de los primeros nt clearance del promotor 3) Elongación: Complejo estable de transcripción 4) Terminación: Involucra desestabilización de apareamiento RNA- molde de DNA Unidad de Transcripción: desde Promotor hasta Terminador 2
Eventos en la iniciación de la transcripción Elongación: 40nt/seg (bacteria) 3
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RNA polimerasa 5
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RNA polimerasas Bacteriófagos T3 y T7: Un único polipéptido. Reconoce solo unos pocos promotores del fago Bacteria: E.coli 5 subunidades Core catalítico Eucariotas: Múltiples subunidades : 8-12 3 RNA polimerasas: RNA polimerasa I : rrna (28s, 18s y 5,8s) RNA polimerasa II : mrna y RNA peq (snurna) RNA polimerasa III : RNA peq (5s rrna, trna, etc) 7
Transcripción en Procariotas Reconocimiento de la secuencia Promotora Promotor : Sitio de unión de la RNA pol E.Coli - 2 secuencias de 6pb (ADN doble cadena) - Distancia entre las 2 secuencias - Startpoint (purina) UP TTGACA TATAAT -35-10 +1 CAT 8
Secuencia -35 Separación entre secuencias Secuencia -10 (Pribnow Box) 9
Iniciación en E.coli Contacto directo RNA pol-promotor Core catalítico Contactos inespecíficos débiles Subunidad Especificidad de secuencias Sec. -35 capacidad de unión de RNA pol Sec. -10 Conversión de complejo cerrado en complejo abierto (apertura de cadenas) 10
Transcripción en bacterias Factor : requerido para unión de RNA pol al Promotor Liberación de luego de iniciación de transcripción 11
Elongación: Complejo de transcripción (core catalítico de la RNA pol) RNA polimerasa cubre 30pb Burbuja de transcripción 12-14nt Apareamiento RNA- DNA 8 pb 12
Terminación en Bacterias Determinada por la estructura secundaria del ARN transcripto Terminadores Intrínsecos Palíndrome invertida seguida de corrida de U en el RNA transcripto Modos de acción Formación de estructura de hairpin estable en el RNA desfavorece la unión RNA al molde de DNA Debilitamiento mayor en la región transcripta con corrida de U (A-U unión débil) Interacción del hairpin de RNA con subunidad 13
Terminadores intrínsecos 14
Terminación Rho dependiente RNA polimerasa pausa en la señal de terminación Señal con hairpin menos estable No hay corrida de U Requiere actividad de proteína Rho Rho: actividad helicasa rompe activamente la unión entre RNA y DNA molde 15
Transcripción en Eucariotas Reconocimiento de la secuencia Promotora RNA pol eucariotas no reconocen directamente su secuencia promotora Factores Generales de Transcripción Core del Promotor Sitio de ensamblado del Complejo de iniciación de la transcripción (Responsable de la Transcripción basal) Elementos upstream del promotor Unión de proteínas activadoras de la transcripción 16
RNA polimerasas Nucleares: Grandes proteínas (<500kD), típicamente 12 subunidades. Algunas subunidades comunes a las distintas RNA pol RNA polimerasa I : Transcripción de genes que codifican para ARNr Residencia en nucleolo Actividad de síntesis de ARN más abundante RNA polimerasa II : Síntesis de precursores de ARNm Residencia en nucleoplasma RNA polimerasa III: Síntesis de ARNt y otros pequeños ARN Residencia en nucleoplasma Actividad de síntesis de ARN menos abundante RNA polimerasa mitocondrias y cloroplastos: Pequeñas. Similares a RNA polimerasas bacterianas 17
Cada RNA polimerasa reconoce secuencias promotoras distintas asistida por distintos factores de transcripción 18
RNA pol III Promotor dentro del gen 3 tipos de promotores Usualmente 2 secuencias (50-100pb ) RNA pol I core -45 y +20 (rico en GC + corta sec rica AT +1) Elementos control upstream (UCE) RNA pol II core -25 TATA Box Inr (secuencia iniciadora) YYCARR Elementos upstream 19
RNA pol I: Holoenzima contiene factores requeridos para iniciación Promotor : core + UPE Core: - rico en GC + reg conservada rica en AT en Inr - Unión de factor SL1 (TBP + 3 Prot.) - Posicionamiento RNA pol I UPE: - Unión de factor UBF - Aumento de frecuencia de iniciación 20
RNA pol III Factor TFIIIB: Se une al sitio de iniciciación y recluta y posiciona RNA pol IIII Factores TFIIIA y TFIIIC: Factores de ensamblaje 21
RNA polimerasa II Subunidades mayores homólogas a y de RNA pol bacteriana Algunas subunidades comunes a RNA pol I y III Subunidad mayor: Dominio carboxilo terminal (CTD) con repeticiones múltiples de secuencia de 7 aminoácidos (26 en levaduras y 50 en mamíferos). CTD puede ser altamente fosforilado en Ser y Thr. 22
Iniciación RNA pol II TATA Box Inr: iniciador DPE Core Promotor: Mínima región continua de DNA suficiente para dirigir la iniciación precisa de la transcripción Reconocimiento del Promotor: Factores general de transcripción (GTF) Además del core hay otras secuencias que actúan en cis: promotor proximal, enhancers, silenciadores y elementos aislantes ( insulators ) 23
Ensamblado del complejo de pre-iniciación TFIID TBP: Unión a DNA secuencia específica (TATA Box) Factores asociados a TBP (TAF): ayudan en la unión de TBP a TATA Box 24
TBP participa del inicio de la transcripción de las 3 RNA pol eucariotas 25
Eventos en la iniciación: 1) Unión de TBP torción del DNA en la región de TATA Box 2) Torción estructura de reconocimiento para TFIIB que asegura posicionamiento correcto de RNA pol II 3) Ruptura de uniones H PIC cerrado PIC abierto (TFII H) Etapa Final de iniciación: Fosforilación de CTD de la subunidad mayor de RNA pol II (TFIIH) liberación del promotor y establecimiento de complejo de transcripción estable (Elongación) CTD: repeticiones de 7 aa (mamíferos 52 repeticiones) ricas en Ser 26
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Transcripción y Reparación Procariotas: reclutamiento de Mfd por frenado de RNA pol. Liberación de RNA pol Reclutamiento de sistema UvrABC Eucariotas: reclutamiento de TFIIH por frenado de RNA pol. Degradación de RNA pol TFIIH + Complejo de reparación 29
Síntesis y procesamiento del RNA en eucariotas Diferencia con Bacterias: Traducción diferida de transcripción Procesamiento del RNA durante la transcripción CAP Corte y empalme de exones: Splicing Poly A 30
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Enzimas unidas al CTD componentes de RNA pol II 32
Capping Escape exitoso (30 nt sintetizados) Capping Adición de G al extremo 5 del RNA Unión 5-5 (Guanidil Transferasa) Unión de un grupo metilo 7 metil Guanosina (Metil Transferasa) 33
Elongación Transcriptos eucariotas más largos que bacterias (distrofina 2400kb) Importancia en estabilidad del complejo de transcripción RNA pol sola: velocidad de síntesis baja pausa frecuente Factores de elongación Proteínas asociadas con la RNA pol II después del escape del promotor 34
TERMINACIÓN RNA polimerasa I Involucra el reconocimiento de una secuencia de 18pb por un factor auxiliar Extremo 3 ARN maduro difiere del 3 generado por terminación procesamiento del ARNr RNA polimerasa III Señal: Corrida de U dentro de una región rica en GC Terminación dentro de una corrida de U RNA polimerasa II Clivaje y poliadenilación del ARN. Señal en el ARN transcripto Terminación de la transcripción downstream del sitio de clivaje (sitio no definido). El clivaje dispara la terminación. 35
Terminación y poliadenilación CPSF y CstF : Componente de especificidad y factor estimulatorio. Reconocimiento de secuencias. Endonucleasa : CFI y CFII Clivaje para generar nuevo 3 Poly A polimerasa (PAP) : RNA polimerasa independiente de molde Cola de polya (~250 A) Actúa en un sitio interno del transcripto Señal de poliadenilación 5 AAUAAA 3 10-30 nt upstream del sitio de poliadenilación (CPSF) Sitio de poliadenilación posterior a CA Región rica en GU 10-20nt downstream (CstF) 36
Contacto de CPSF y CstF con secuencias de poliadenilación cambia las propiedades del complejo de elongación Terminación de transcripción CPSF y CstF reclutadas por RNA pol II (CTD) 37
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PROCESAMIENTO DEL ARN : SPLICING GENES INTERRUMPIDOS marn continuo Requiere procesamiento del ARN transcripto primario: SPLICING El mecanismo de splicing involucra: - Reacciones de transesterificación - Reconocimiento de señales en el ARN: sitios de splicing 39
Splicing nuclear Distintos tipos de Intrones: 7 tipos en eucariotas Otros distintos en archaea En mrna 2 tipos de intrones con distinto tipo de señales: GU-AG mayoritarios (>98%) AU-AC 40
GU-AG sitio 5 : AG GUAAGU (dador) sitio 3 : PyPyPyPyPyPyPNCAG (aceptor) A: punto de ramificación 41
Aparato de splicing: Spliceosoma Spliceosoma SnRNP Sn RNA : U1, U2, U4, U5 y U6 Proteínas (Sm) Proteínas asociadas (Factores de splicing) Importante por: - Distancia entre sitios de splicing - Selección de sitios de splicing - Actividad catalítica 42
Splicing: reacciones de trans-esterificación 1) Clivaje en el sitio 5 promovido por -OH 2 de nt A localizado dentro de la secuencia del intrón (punto de ramificación) Ataque del sitio 5 clivaje de la unión fosfodiester Formación de nueva unión 5-2 (lariat) 2) Clivaje del sitio 3 y unión de exones promovido por OH 3 del extremo del exón Clivaje en el sitio 3 Liberación del intrón (lariat) Unión de exones 43
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Splicing Alternativo: Mecanismo para generar múltiples isoformas de proteínas Procesamiento diferencial del ARN de algunos genes: de modo tejido específico, en distintas etapas del desarrollo o como respuesta a alguna señal. Mecanismo adicional de regulación de la expresión. 51
Variación de concentración relativa de factores generales de splicing y ribonucleoproteínas de unión al ARN (hnrnp) Ej: - ASF/SF2 en bajas cantidades: selección de sitio de splicing 5 más fuerte. En altas cantidades: sitio 5 más cercano al 3. - hnrnpa1: selección del sitio 5 más distante. Unión a ESS: bloquea utilización de sitio 3 adyacente Represión o activación de sitios de splicing por factores de splicing específicos de tejidos o etapas del desarrollo 52
Selección de sitios de splicing correctos Factores reguladores de splicing Proteínas SR : Dominio RS + RRM Interacción entre U1-snRNP y U2-snRNP Interacción con ESE (enhancer en exon) y ISE Interacción con ESS (silenciadores en exon) y ISS SCAF (SR like factores asociados a CTD): conexión física entre spliceosoma y CTD de RNA pol II 53
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INTRONES GRUPO 1 58
INTRONES GRUPO 2 59