TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS PROYECTO FIN DECARRERA Evaluación del cultivo "in vitro" de variedades de vid cultivadas en la DOCA Rioja Ana Ruiz Lorente Tutores: María Elena Martínez Villar y Cristina Menéndez Menéndez Curso 2011-2012

Evaluación del cultivo "in vitro" de variedades de vid cultivadas en la DOCA Rioja, trabajo fin de estudios de Ana Ruiz Lorente, dirigido por María Elena Martínez Villar y Cristina Menéndez Menéndez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los titulares del copyright. El autor Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012 publicaciones.unirioja.es E-mail: publicaciones@unirioja.es

RESUMEN La vid es el cultivo más extendido en el mundo y el más importante en términos económicos. España es el país con mayor superficie dedicada al cultivo de la vid, extendiéndose por todas las provincias españolas. En La Rioja, se registra una superficie de cultivo de 44.230 ha. por lo que el cultivo de Vitis vinífera en la Comunidad Autónoma de La Rioja (C.A.R) adquiere gran importancia, siendo numerosos los estudios realizados respecto a diferentes ámbitos de las variedades admitidas en dicha comunidad. Si hay estudios de tipo económico, fisiológico, fenológico, etc., sin embargo son escasos los estudios relacionados con la respuesta que las diferentes variedades tienen ante su manejo en condiciones propias del cultivo in vitro. Por su parte, el cultivo in vitro ofrece una serie de ventajas que no están presentes en el cultivo tradicional, citando, entre otras, la obtención de material libre de virus o permitir la rápida propagación del material vegetal, aspecto este último muy importante en los procesos de obtención de nuevos genotipos. En este trabajo evalúa la respuesta de las variedades Graciano, Tempranillo Blanco, Tempranillo y Mazuelo cultivadas en condiciones in vitro. Los resultados obtenidos podrán utilizarse posteriormente en alguno de los objetivos concretos, reseñados anteriormente. Para el estudio se han utilizado explantos de yema, segmentos nodales, hojas y pecíolos de las diferentes variedades utilizando como base el medio MS variando el procedimiento seguido para su preparación según el tipo de explanto. Para explantos de yema y segmentos nodales se utilizó el medio MS sin reguladores de crecimiento. Para el caso de explantos de hoja y pecíolo al medio MS se le añadieron concentraciones de 0; 0,5; 1; 2; 4 mg/l de BA y 0,5 mg/l de IBA. Solo los datos obtenidos a partir de explantos de pecíolos se sometieron a trato estadístico. Para este estudio se comparan los datos obtenidos entre variedades y entre los protocolos de cultivo seguidos, encontrando los mejores resultados en la adicción al medio de 1 mg/l de BA y para la variedad Tempranillo Blanco. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 1

ÍNDICE ABREVIACIONES Y EQUIVALENCIAS... 3 1. INTRODUCCIÓN... 4 1.1. EL CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES... 4 1.2. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DEL CULTIVO IN VITRO... 9 1.3. EL CULTIVO DE VID EN LA RIOJA. CARACTERÍSTICAS DE LAS VARIEDADES DE ESTUDIO... 11 1.4. CULTIVO IN VITRO APLICADO A Vitis vinifera L... 14 1.5. INTERÉS DEL TEMA... 16 2. OBJETIVOS... 17 3. MATERIALES Y MÉTODOS... 18 3.1. MATERIAL VEGETAL... 18 3.2. MEDIOS DE CULTIVO... 19 3.3. DESINFECCIÓN... 24 3.4. MANEJO IN VITRO... 25 3.5. CONTROL DE LA EVOLUCIÓN DE LOS EXPLANTOS... 27 3.6. ESTUDIO ESTADÍSTICO... 27 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN... 28 4.1. ASEPSIA DEL EXPLANTO INICIAL... 28 4.2. EVOLUCIÓN Y CRECIMIENTO DEL EXPLANTO INICIAL... 33 5. CONCLUSIONES... 51 6. BIBLIOGRAFÍA... 53 7. AGRADECIMIENTOS... 57 ANEJO I: EQUIPO UTILIZADO... 58 ANEJO II: IMÁGENES DE EXPLANTOS DE YEMA... 60 ANEJO III-. IMÁGENES DE EXPLANTOS DE HOJA... 61 ANEJO VI-. IMÁGENES DE EXPLANTOS DE PECIOLO... 65 ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 2

ABREVIACIONES Y EQUIVALENCIAS BA-Benciladenina = Bencilaminopurina IAA- Ácido indolacético IBA- Ácido indolbutírico MS- Murashige and Skoog NAA- Ácido naftalenacético TDZ-Thidiazuron 1mg/l BA = 1 ppm BA = 4,48 µmol BA 1 mg/l IBA = 1 ppm IBA = 50 µmol IBA ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 3

1. INTRODUCCIÓN Los avances desarrollados en el campo de la biología experimental en los últimos años han permitido el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular; y han traído consigo que actualmente sea posible reproducir todos los factores que pueden incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas, en condiciones de laboratorio. 1.1. EL CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES La expresión cultivo in vitro de plantas significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio (inicialmente se usó este material, en la actualidad es frecuente utilizar recipientes de diversos tipos de plásticos) en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes) y el control de los factores que afectan al crecimiento. La técnica del cultivo in vitro es una técnica extremadamente útil para una rápida introducción de nuevos clones, propagación y mantenimiento de plantas libres de virus, para la conservación de germoplasma, obtención de nuevas variedades y la realización de estudios fisiológicos. El fundamento del cultivo in vitro es la capacidad que poseen las células vegetales de volver a un estado indiferenciado, a la etapa de célula meristemática proliferante, es decir, devuelven la célula adulta a la etapa juvenil siendo ésta capaz de orientarse a la formación de casi cualquier órgano. Tejidos compactos, normales o tumorales, meristemos, yemas, raíces y células aisladas se han convertido, gracias a las técnicas de cultivo in vitro, en el material de elección para llevar a cabo el cultivo de tejidos vegetales. Hay varios tipos de cultivo in vitro, de la misma forma que se encuentran materiales diferentes en la constitución de las plantas (figura 1). El origen del explanto inicial varía en función del objetivo perseguido durante el cultivo: propagación de yemas axilares u obtención de brotes adventicios. Para la propagación de yemas axilares hay dos vías posibles: 1- A partir de yemas apicales o meristemos para la proliferación de brotes axilares de los cuales se obtendrán nuevos individuos. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 4

2- A partir de porciones de uno o más nudos que desarrollarán nuevos nudos de los cuales se harán nuevas porciones para obtener nuevos individuos. Para la obtención de brotes y/o embriones adventicios se pueden seleccionar los explantos de varios tejidos (hojas, raíces, flores, etc.) con los que se pueden seguir dos vías: 1- La morfogénesis directa, de la que se pueden obtener brotes adventicios que darán lugar a nuevas plantas, o también se pueden obtener embriones somáticos para la obtención de individuos. 2- La morfogénesis indirecta, en la que se produce en el explanto la proliferación de un callo, es decir, un tejido tumoral más o menos organizado, que generalmente surge sobre heridas de órganos y tejidos diferenciados (Pierik 1990). Posteriormente los callos se cultivan en un medio diferente con el propósito de obtener subcultivos de callo de los que se pueden obtener brotes adventicios, que darán lugar a nuevos individuos, o se obtienen embriones somáticos de forma directa o mediante suspensiones celulares dando lugar igualmente a individuos completos. El tipo de callo producido condiciona en gran medida su capacidad organógena, así, callos de consistencia friables (desmenuzables) tienen tendencia a producir embriones somáticos mientras que los no friables (duros) son mas inestables y tienen un peor comportamiento para el subcultivo. Son varios los autores que citan estas tendencias, se mencionan como ejemplos: i. En el cultivo de Arachis sp. al adicionar al medio BA proliferó el crecimiento de estos callos, produciendo así mismo caulogénesis y embriogéneis en distintas proporciones (Pacheco et al. 2007). ii. Los callos de consistencia friable producen embriogénesis (Taylor et al. 1996). iii. Los callos friables tienen la capacidad para producir embriones, tallos y para regenerar plantas (Luciani et al. 2006). iv. La pérdida de viabilidad e inhibición del crecimiento de los callos no friables puede ser debida a la pérdida de etileno producido por el propio callo durante su cultivo, siendo este la causa del color marrón característico de este tipo de callos (Mao et al. 2006). v. En el cultivo de Solanum virginianum L. el callo friable es precursor de organogenésis (Borgato et al. 2007). ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 5

Figura 1. Principales métodos de micropropagación. Se destacan las vías seguidas en este ensayo. El crecimiento y desarrollo del explanto inicial esta determinado por diversos factores genéticos, físicos, ambientales (luz, temperatura, ph), el medio de cultivo y la presencia de algunas sustancias orgánicas (reguladores, vitaminas etc.). La constitución genética determina factores decisivos como, qué temperatura es la óptima para el crecimiento y la floración, la forma de las hojas, etc. Los factores físicos ambientales influyen prácticamente en todo tipo de procesos: absorción de agua, evaporación, fotosíntesis, etc. Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Lo conveniente sería seleccionar una composición en función del conocimiento de la fisiología de la especie con respecto a la nutrición mineral. En la tabla 1 se recoge la composición recopilada por Margara (1987) de los medios de cultivo más empleados. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 6

Evaluación del cultivo in vitro de variedades de vid cultivadas en la D.O.Ca. Rioja Tabla 1. Composición mineral de algunos medios de cultivo (Marga 1987) ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 7

Dentro de las sustancias orgánicas, el grupo de los reguladores es otro factor importante. Los reguladores, que se necesitan en mínimas concentraciones, controlan, por ejemplo, la distribución de todo tipo de sustancias en el interior de la planta y, por consiguiente, son responsables de la división celular, el crecimiento de las células, etc. Los reguladores de los grupos de las auxinas y las citoquininas parecen complementarse en la división celular, las auxinas favorecen la duplicación de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y la citoquinina hacen posible la separación de los cromosomas. En forma esquemática se puede admitir, según Augé et al. (1984), que el comportamiento fisiológico previsible de un inoculo en un cultivo es el siguiente (figura 2): Si la proporción auxina/citoquinina es alta, habrá actividad de tipo rizógena. Si la proporción auxina/ citoquinina es débil, el inoculo evolucionará hacia un actividad de tipo caulógeno. Si la relación es equilibrada, se tendrá un comportamiento callógeno. Figura 2. Evolución del callo en función de la relación auxina/citoquinina. Sin embargo, las relaciones indicadas anteriormente deben tomarse con ciertas precauciones, ya que la influencia genética puede modificar de forma significativa la respuesta obtenida. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 8

1.2. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DEL CULTIVO IN VITRO Son numerosos los tratados donde se indican, de modo cronológico, los acontecimientos más relevantes relacionados con el cultivo in vitro, a continuación se indican los más relevantes, que han marcado hitos en la aplicación de la técnica, extraídos a partir de Augé et al. (1984) y Pierik (1990). Los primeros intentos de mantener con vida órganos aislados en animales datan de hace más de 130 años, siendo el objetivo conservar con vida fragmentos de cola de renacuajo. Los primeros pasos del cultivo in vitro se deben al alemán Haberlandt, a principios del siglo pasado (1902). Este investigador logró que en un medio de Knop (tabla 1) mejorado sobrevivieran durante varios meses pequeñas masas celulares (pelos estamíneos o glandulosos, u otros fragmentos de epidermis) aunque sin multiplicación celular. Fue necesario esperar hasta 1922 para que surgieran nuevas esperanzas para el cultivo de tejidos vegetales. En la década de los 20, Roblins, en los Estados Unidos, y Kott, en Alemania, enfocaron su atención en las puntas de las raíces logrando mantenerlas con vida durante casi seis meses y consiguiendo que crecieran hasta los 5 ó 6 cm de largo. Desafortunadamente al cesar su crecimiento estos cultivos se perdieron. En 1932 White logró por primera vez un cultivo indefinido de raíz usando extremidades de raíz de tomate mantenidas en un medio líquido que contenía sales minerales, extracto de levadura y azúcar. Este éxito dio lugar a esfuerzos renovados para cultivar tejidos vegetales. En 1934 Gautheret obtuvo a partir de la extracción de tejidos meristemáticos de árbol (tejidos cambiales) proliferaciones de tejidos que lamentablemente no vivieron más de ocho meses. Cinco años más tarde este investigador publicó sus primeros resultados sobre el cultivo indefinido de tejidos de zanahoria. Ese mismo año, 1939, Nobecourt, y White, en relación con tejidos de tabaco tumoral, publicaron resultados análogos sobre tejidos cambiales y tejidos de tabaco tumoral, respectivamente. Es a partir de este momento cuando tiene su origen el cultivo in vitro de tejidos vegetales. Se necesitarían una gran cantidad de páginas para citar todas las etapas importantes que derivan del éxito de Gautheret, Nobecourt y White. Se citan varios ejemplos: En 1949 Limaste y Cornuet publican sus observaciones sobre la ausencia de virus en meristemos de tabaco virosado. A partir de estas observaciones Morel y Martin se dedicaron a ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 9

cultivar meristemos de dalia y patata afectados por enfermedades virales consiguiendo obtener plantas completas y sanas. El cultivo in vitro ha permitido avances considerables en el estudio de tumores, que en parte, han hecho posible la realización de las primeras pruebas de manipulación genética en nuestros días. Después de la Segunda Guerra Mundial (1945) el desarrollo en este campo ha sido especialmente rápido y se han publicado numerosos resultados interesantes para la agricultura, silvicultura y horticultura (Pierik, 1979: Bhojwani et al., 1986). El descubrimiento de los reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) ofreció grandes oportunidades para el cultivo in vitro de tejidos vegetales. El primer regulador descubierto fue la auxina IAA (ácido 3-indolacético), pero los grandes avances vinieron con el descubrimiento en 1955 de la sustancia reguladora kinetina (una citoquinina). Una revisión histórica detallada, esta recogida en los libros y artículos de Gautheret (1959, 1964, 1983), Street (1973, 1974) y Gamborg y Wetter (1975). Se mencionan a continuación algunas fechas y hechos importantes: - 1948 Primer trabajo de cultivo in vitro en vid (Morel). - 1952 Obtención de dalias libres de virus por cultivo de meristemos (Morel y Martin). - 1952 Primera aplicación de microinjerto (Morel). - 1954 Obtención de la primera planta a partir de una célula aislada (Muir et al.). - 1955 Descubrimiento de la kinetina, una hormona de la división celular (Miller et al.). - 1957 Descubrimiento de la regulación de la formación de órganos (raíces y vástagos), variando la proporción citokinina/auxina (Skoog y Miller). - 1959 Publicación del primer manual extensivo de cultivo de tejidos vegetales(gautheret). - 1962 Desarrollo por Murashige y Skoog del medio de cultivo más utilizado. - 1974 Inducción de ramificación axilar, por citoquinina, en ápices de vástagos de Gerbera (Murashige et al.). -1974 Descubrimiento del plásmido-ti, principal inductor de tumores de Agrobacterium y primer paso hacia ingeniería genética (Zaenen et al.; Larebeke et al.). ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 10

1.3. EL CULTIVO DE VID EN LA RIOJA. CARACTERÍSTICAS DE LAS VARIEDADES DE ESTUDIO La vid es el cultivo más extendido en el mundo y el más importante en términos económicos. En el año 2008, se registró en España una superficie de viñedo 1.109.049 ha, de las cuales 1.088.334 ha de viñedo son para vinificación y el resto para uva de mesa, pasificación y viveros. Es el país con mayor superficie dedicada al cultivo de la vid, extendiéndose ésto por todas las provincias españolas. En La Rioja, se registra una superficie de cultivo de 44.230 ha (Anuario de estadística 2009; MARM). La vid llega a La Rioja a través de los romanos, los fenicios y los primitivos celtíberos. El documento conservado más antiguo que hace referencia a la existencia de vid en La Rioja data del año 873, procede del Cartulario de San Millán. Las variedades tradicionales autorizadas por el Consejo Regulador de la D.O.Ca. Rioja desde su creación en 1925 han sido cuatro tintas y tres blancas: Variedades tintas: Tempranillo, Garnacha tinta, Mazuelo (también conocida como Cariñena) y Graciano. Variedades blancas: Viura (también conocida como Macabeo), Malvasía y Garnacha blanca. Desde el punto de vista del material vegetal, en el año 2007 se autorizan nueve variedades de uva que se añaden a las siete que ya estaban permitidas desde 1926 y que incluyen cinco variedades autóctonas recuperadas, una obtenida por mutación somática y tres variedades foráneas. En este sentido es importante poner de manifiesto la necesidad de preservar las variedades autóctonas de cada región ya que son, por lo general, las mejor adaptadas a las condiciones naturales de cultivo al ser portadoras de caracteres genéticos que pueden ser necesarios en el futuro, para mejorar las variedades o hacerlas mas resistentes a determinados ataques (Martínez de Toda, 1990). Las variedades de nueva introducción en 2007 han sido: Variedades tintas: Maturana tinta, Maturana parda o Maturano y Monastel Variedades blancas: o Variedades autóctonas: Maturana blanca, Tempranillo Blanco y Turruntés. o Variedades foráneas: Chardonnay, Sauvignon blanc y Verdejo. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 11

Para este estudio se utilizaron las variedades Graciano, Tempranillo Blanco, Mazuelo y Tempranillo. El Tempranillo Blanco tiene su origen en La Rioja en 1988, cuando Jesús Galilea Esteban encontró un racimo de uvas blancas en una de las vides Tempranillo de su viñedo, de Murillo de Río Leza, La Rioja (Salical 2005; Gobierno de la Rioja). Tempranillo Blanco es una variedad blanca originada por mutación espontánea de yema a partir de la variedad tinta. Galilea contactó con la agencia gubernamental de La Rioja CIDA (Centro de Investigación y Desarrollo Agrario), que se encargó de injertar los brotes en su centro de investigación en febrero de 1989, donde se realizan las pruebas anatómicas, fisiológicas, etc. pertinentes que ponen de manifiesto el interés de la variedad par su cultivo en la D.O. Ca. Rioja. El racimo es de tamaño mediano y suelto con la baya también mediana y de forma ligeramente aplastada. La brotación es tardía, y el envero y la maduración precoces. Haz Envés Sumidad Racimo Graciano, una variedad autóctona muy poco extendida en otras zonas, cuya demostrada complementariedad con el Tempranillo para el envejecimiento le ha convertido en una variedad de futuro para Rioja, donde la superficie de cultivo ha aumentado considerablemente en los últimos años, aunque sin alcanzar el protagonismo que tuvo antes de la filoxera. Requiere suelos arcillo-calizos de cierta frescura y presenta una cierta resistencia a enfermedades como mildiu y oidio, siendo de baja fertilidad y de maduración tardía. Ofrece vinos con importante acidez y contenido polifenólico, ideales para crianza, cuyo aroma es muy peculiar, superior en intensidad al resto de las variedades de Rioja. Actualmente ocupa casi 1000 ha en la D.O.Ca. Rioja. (http://riojawine.com). ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 12

Hay constancia del cultivo de la variedad Mazuelo en Rioja desde hace varios siglos, pero hoy ocupa apenas un 3% de la superficie de la Denominación. Es más productiva que las otras variedades tintas, especialmente sensible al oidio y necesita mayor integral térmica para madurar. Aunque corta en aromas, produce vinos con abundantes taninos, acidez elevada y color estable, todo lo cual le convierte en un buen complemento del Tempranillo para vinos de largo envejecimiento. La variedad Tempranillo está considerada autóctona de Rioja, es la más característica de esta Denominación, fundamento de la identidad de sus vinos tintos y una de las grandes variedades nobles del mundo. Ocupa más del 75% de la superficie de cultivo y es enológicamente muy versátil, capaz de producir vinos con largo envejecimiento, muy equilibrados en grado alcohólico, color y acidez, y con un paladar franco, suave y afrutado, que evoluciona a aterciopelado cuando envejece. Respecto a su comportamiento agronómico, es muy segura en el cuajado, muy sensible a plagas y enfermedades, poco resistente a la sequía y a temperaturas altas y, como su propio nombre indica, es "uva temprana" con ciclo corto de maduración. Actualmente el Tempranillo se encuentra muy difundido en España por su calidad reconocida, estando autorizado en 28 denominaciones de origen, 12 de las cuales lo consideran una de las variedades principales o preferentes. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 13

1.4. CULTIVO IN VITRO APLICADO A Vitis vinifera L. A continuación se expone la revisión bibliográfica de lo investigado hasta el momento en el ámbito del cultivo in vitro de la vid. De los artículos se destaca lo relacionado con el ensayo de cultivo in vitro de vid en cuanto al medio de cultivo utilizado, el tejido de partida, la composición y la concentración de los distintos reguladores utilizados. Explantos de hoja En el año 1990 Clog et al. cultivan in vitro porciones de hoja de la variedad Maturana en medio MS con 0,5 mg/l de BA. Llegan a la conclusión de que el uso de BA es esencial para la formación de callo. También en 1990 Stamp et al. para su ensayo utilizan explantos de hoja de las variedades de Vitis vinifera Cabernet Sauvignon, French Colombard y Garnacha cultivadas en medio MS suplementado con 0, 1, 2 o 4 mg/l de BA. Concluyen que la organogénesis se produce con mayor frecuencia con una concentración de BA de 2 mg/l. Unos años mas tarde, Torregrosa y Bouquet (1996) utilizando explantos de hojas jóvenes procedentes de híbridos de Vitis x Muscadinia obtuvieron los mejores resultados de cultivo en medio MS suplementado con 2 mg/l de BA y 0,5 mg/l de NAA. Años más tarde Skiada et al. (2010) a partir de hojas de los cultivares Malagouzia y Xinomavro afirman que el uso de 0,01 mg/l de IBA proporciona un mayor porcentaje de enraizamiento en los dos cultivares estudiados aunque señala que la formación de raíces sucede a diferentes temperaturas para estos cultivares ( Malagouzia a 26ºC y Xinomavro a 21ºC). Explantos de yema Gray y Benton (1991) cultivando yemas de vides muscadineas observan que lo más adecuado es usar porciones de 1 cm por su baja infección y mayor supervivencia que comparadas con materiales de longitudes inferiores o superiores. Estos autores utilizando el medio MS suplementado con 1,2 mg/l de BA y 1,2 mg/l de TDZ obtuvieron la mayor efectividad para la proliferación del cultivo de ápices. En 1995 Tomás Las Heras et al. presentan los resultados del uso de diferentes sistemas de micropropagación in vitro sobre las variedades Garnacha, Tempranillo, Viura, Moscatel, Calagraño y Miguel de Arco. Los mejores resultados para todas las variedades se obtuvieron con medio sólido MS suplementado con 2 mg/l de BA. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 14

Segmentos nodales Por otro lado, en el año 2004 Singh et al. indican que para el inicio del cultivo de las variedades Pusa Urvashi y Pusa Navrang el uso de segmentos nodales cultivados en medio MS suplementado con 2 mg/l de BA y 0,2 mg/l de NAA presenta los mejores resultados. Couselo et al. (2006) también obtienen los mejores resultados de elongación con el medio MS suplementado con 2 mg/l de BA utilizando como explanto inicial segmentos de nudo de la variedad Albariño. Cadavid-Labrada et al. (2009) analizan las capacidades regenerativas de los segmentos nodales de Cabernet Sauvignon, Melisa y Thompson Seedless cultivados en medio MS suplementado con BA. Obtienen los mejores resultados con una concentración de 3 mg/l. Sin embargo para Laslo et al. (2010) el mayor porcentaje de regeneración se consigue utilizando segmentos nodales cultivados en medio MS suplementado con 5 mg/l de BA y 825 mg/l de NH4NO3. Además demuestran que el uso de IBA incrementa el número y el vigor de las raíces. Para este ensayo utilizan las variedades de vid Cabernet Sauvignon y Riesling Italiano. Con fines del estudio genético del fenotipo de Chardonay 96, Bertsh et al. (2005) para la iniciación de callo embriogenico a partir de explantos nodales utilizan el medio MS suplementado con 1 mg/l de BA y en estado de oscuridad. En el año 2008 Jaskani et al. utilizan explantos de yema y discos de hoja procedentes de la variedad Perlette cultivados en medio MS suplementado con BA obteniendo la mayor inducción a callo con una concentración de 1mg/l de este regulador. Aazami (2010) a partir de los cultivares de Vitis vinifera `Soltain` y `Sahebi` utilizando los brotes apicales obtienen los mejores resultados en medio MS suplementado con 1,5 mg/l de BA y también con el medio MS suplementado con 1,5 mg/l de BA mas 1 mg/l de IBA. Mukherjee et al. en el estudio de la Vitis champinii Planch encuentran que el medio óptimo para el establecimiento del cultivo es el medio MS con la concentración de nitratos reducida a la mitad y suplementado con 2 mg/l de BA. Orden y Karaaslan en su artículo publicado en el año 2010, indican que la combinación de 0,1 mg/l de BA con NAA pueden jugar un papel directo en la reducción del nivel de radicales libres y la producción fenólica asociadas con la capacidad de proliferación de las células de vid sometidas a cultivo in vitro. Por ultimo, Gago et al. en el año 2010 concluyen que para el éxito de la rizogénesis y aclimatación del cultivo in vitro de vid influyen tres factores: el tipo de cultivar, la concentración y el tiempo de exposición al IBA. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 15

1.5. INTERÉS DEL TEMA El cultivo in vitro ofrece una serie de posibilidades que no presenta el cultivo tradicional (ex vitro), pudiendo citar, entre otras, la obtención de material libre de virus, la rápida propagación del material vegetal (situación especialmente interesante en la multiplicación de nuevos genotipos), la conservación de forma económica y a largo plazo (mediante crioconservación) de material vegetal seleccionado y mantenimiento del cultivo en condiciones estériles para el protección frente a las poblaciones de patógenos. Por otra parte, ya se ha indicado la importancia que tiene el cultivo de Vitis vinífera en la C.A. de La Rioja, siendo numerosos los estudios realizados respecto a diferentes ámbitos de las variedades permitidas para su cultivo en dicha comunidad, de tipo económico, fisiológico, fenológico, etc. Sin embargo son escasos los estudios relacionados con la respuesta que las diferentes variedades tienen ante su manejo in vitro. El interés de este trabajo se centra en la evaluación del comportamiento de cuatro variedades de vid cultivadas en la D.O. Ca. Rioja bajo diversas condiciones de cultivo in vitro. El conocimiento generado será fundamental para el empleo de las técnicas propias del cultivo in vitro en futuros trabajos de investigación aplicada. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 16

2. OBJETIVOS Como objetivo general se puede indicar evaluar la respuesta de cuatro variedades de Vitis vinifera cultivadas en condiciones in vitro. En concreto, este estudio tiene como objetivos particulares: - Identificar la naturaleza del explanto inicial más adecuado respecto a sus posibilidades de desinfección. - Estudiar la respuesta de las variedades Tempranillo, Tempranillo Blanco, Mazuelo y Graciano a diversas técnicas de cultivo in vitro. - Observar y monitorizar la evolución del cultivo de cada parte de la planta seleccionada. - Identificar el medio de cultivo que ofrece mejores respuestas al cultivo. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 17

3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. MATERIAL VEGETAL Las variedades sometidas a estudio son tres tintas: Mazuelo, Graciano (clon 103) y Tempranillo (clon RJ-26), y una blanca: Tempranillo Blanco. La elección de los clones ha sido al azar, en el caso del Tempranillo Blanco y el Mazuelo no existen clones comerciales seleccionados. El material de partida se obtuvo de la finca Experimental que la Comunidad Autónoma de La Rioja tiene en La Grajera (Logroño), que proporcionó gavillas de sarmientos de todas las variedades a estudio con las yemas en estado de dormición. Tras la recepción, se procedió a cortar porciones de tres yemas (estacas) con cada sarmiento y parafinar sus extremos para evitar la deshidratación. Para ello se calentó parafina al baño María en un recipiente hasta los 50ºC y se fueron introduciendo los extremos de las estacas extrayéndolos seguidamente. Se conservaron en frío (4ºC) hasta su utilización. Para el forzado de yemas se sumergieron las estacas parafinadas de tres yemas en el baño termoestático a 30ºC durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, las estacas con las yemas que ya han salido de dormición fueron colocadas de tres en tres en macetas con un sustrato a base de turba y vermiculita, en una proporción de 3:1 (turba:vermiculita). A continuación se colocaron en una cámara de crecimiento con fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad y termofotoperiodo de 24ºC/18ºC, a la espera de producirse la brotación de las yemas, que se produjo en un tiempo variable de 3 a 4 semanas. Para el estudio se usaron tres tipos de explantos iniciales: - De yema con una porción de tallo de 0,5-1 cm. - Porciones de hoja de 1,5x1,5 cm. - Pecíolos de hoja de 1-2 cm. También se realizó un ensayo en que se utilizaron como explantos segmentos nodales obtenidos directamente de las estaquillas proporcionadas por la Grajera tras ser mantenidas durante 2 meses a 4 ºC, pero sin pasar por el proceso de forzado descrito anteriormente, por tanto con las yemas sin brotar. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 18

3.2. MEDIOS DE CULTIVO Para el cultivo in vitro se utilizó el medio de cultivo MS (Murashige and Skoog, 1962). El procedimiento seguido para su preparación varió según el tipo de explanto. Se utilizó un preparado comercial que incluía las sales minerales y los componentes orgánicos (salvo sacarosa) de dicho medio (Murashige & Skoog basal mediumw/vitamina Phyto Technology Laboratory) cuya composición se describe en la tabla 2. Para la preparación de 1 l de medio se añadieron en un vaso de precipitado 4,43g del preparado comercial, 20g de sacarosa y 600-700ml de agua destilada. La mezcla se colocó en el agitador magnético hasta la disolución de la sacarosa. Una vez disuelta el procedimiento a seguir se determinó en función del explanto a cultivar. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 19

Tabla 2. Composición del medio MS. (Murashige & Skoog 1962) ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 20

3.2.1. PREPARACIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO Se utilizó la citoquinina bencilaminopurina (BA) (Sigma, 0214583) y la auxina ácido indolbutírico (IBA) de la marca (Panreac síntesis, 0210414). Para la preparación de 50 ml se procedió de la siguiente forma: - Para BA: se pesaron 0,05 g del comercial al que se le añadieron 5 ml de ClH 0,2 N y se enrasó con agua destilada hasta los 50 ml. - Para IBA: se pesaron 0,05 g del preparado comercial al que se le añadieron 5 ml de NaOH 0,05 N y se enrasó con agua destilada hasta los 50 ml. En ambos casos se obtuvo una concentración de 1mg /ml. 3.2.2 MEDIO DE CULTIVO PARA EXPLANTOS DE YEMA Se utilizó el medio MS descrito en el apartado 3.2. al que, una vez disuelta la sacarosa se enrasaba a 1l con la ayuda de una probeta y se ajustaba el ph a 5,7. En este caso no se añadieron reguladores de crecimiento. A continuación se introdujo en un matraz Erlenmeyer al que previamente se habían incorporado 6g de agar, para que proporcionara la consistencia adecuada, disolviendo y homogeneizando el medio en una placa caliente con agitación magnética hasta quedar translúcido. Tras este paso el medio MS se repartía en botes de vidrio de 200 ml y de 5 cm de diámetro en una medida aproximada de 45 ml por bote, se tapaban y se introducían en el autoclave para esterilizar a 120ºC, 1Kg cm -2 s -1 durante 20 minutos. Transcurrido el tiempo de esterilización se dejaban los botes en la cabina de flujo laminar con luz ultravioleta hasta que el medio solidificara y pudiera ser utilizado. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 21

3.2.3. MEDIO DE CULTIVO PARA EXPLANTOS DE HOJA Y PECIOLOS Para este ensayo, al medio de cultivo MS descrito en el apartado 3.2. se le añadieron concentraciones de 0; 0,5; 1; 2 y 4 mg/l de bencilaminopurina (BA) y de 0,5 mg/l de acido indolbutírico (IBA) respectivamente (protocolos 0; 0,5; 1; 2; 4) (Clog et al, 1990). Una vez disueltos los reguladores de crecimiento se añadieron al vaso de precipitado, con la sacarosa disuelta, en las diferentes concentraciones y todo ello se enrasaba a 1l con la ayuda de una probeta y ajustándose el ph a 5,7. A continuación se introdujo la solución en un matraz Erlenmeyer al que previamente se habían incorporado 6g de agar, para que proporcionara la consistencia adecuada. Se tapó con papel de aluminio y se procedió a esterilizarlo en el autoclave a 120ºC, 1Kg cm -2 s -1 durante 20 minutos. Para el cultivo de explantos de hoja se utilizaron placas Petri estériles de 9 cm. de diámetro. El medio MS se distribuía en las placas Petri dentro de la cabina de flujo laminar y se dejaban allí en su bolsa correspondiente y con luz ultravioleta hasta que el medio solidificara y pudiera ser utilizado. Para el cultivo de explantos de pecíolos se utilizaron tubos estériles de 30 ml y de 3 cm. de diámetro. El medio MS se distribuía en los tubos dentro de la cabina de flujo laminar, y se dejaban cerrados en la cabina de flujo laminar con la luz ultravioleta hasta que el medio solidificara y pudiera ser utilizado. Tabla 3. Reguladores de crecimiento empleados en los cultivos. Protocolo 0 Protocolo 0,5 Protocolo 1 Protocolo 2 Protocolo 4 BA (mg/l) 0,0 0,5 1 2 4 IBA (mg/l) 0,0 0,5 0,5 0,5 0,5 ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 22

3.2.4. CONSERVACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO En el caso de que los medios no se usaran de forma inmediata y que fuera necesaria la conservación del medio para su posterior utilización se procedió de la siguiente forma: Conservación de botes: Para su uso 24h después de la preparación del medio se mantuvieron en la cabina de flujo laminar con luz ultravioleta y el flujo de aire conectado. Para utilizaciones posteriores, se cerraron con parafilm en la cabina de flujo laminar con el fin de evitar infecciones y se guardaron en frigorífico a 4ºC hasta dos/tres semanas, transcurrido ese tiempo el medio era eliminado. Conservación tubos: Para su uso 24h después de la preparación del medio se mantuvieron en la cabina de flujo laminar con luz ultravioleta y el flujo de aire conectado. Para utilizaciones posteriores se guardaron en frigorífico a 4ºC durante dos/tres semanas, transcurrido ese tiempo el medio era eliminado. Conservación de placas Petri: Tras distribuir el medio se cubrieron las torres con su bolsa correspondiente y se rociaron con etanol 75%, con el fin eliminar cualquier posible infección, dejándose en la cámara de flujo laminar con luz ultravioleta y el flujo de aire conectado hasta que el medio se solidificara y pudiera ser usado. Parar usos posteriores, se cerraron las torres con sus bolsas y se conservaron en frigorífico a 4 ºC no más de 5 ó 6 días, transcurrido ese tiempo el medio era eliminado. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 23

3.3. DESINFECCIÓN Para garantizar la asepsia de los explantos es necesario someterlos a un proceso de desinfección antes de proceder a su cultivo. Explantos de yema Los explantos de yema con una porción de tallo se sometieron primero a desinfección en etanol al 70% durante 30 s, introduciéndose a continuación los explantos en una disolución de hipoclorito sódico (lejía comercial al 20%) y unas gotas de Tween 20. Se sumergieron los explantos en un bote con tapa y se mantuvieron en agitación durante 20 min. Explantos de segmentos nodales Se llevó a cabo un ensayo de desinfección de segmentos nodales sometiendo las porciones de sarmiento de un nudo a un baño fungicida con Rovral aquaflo de la marca (BASF) durante 5 min para posteriormente mantenerlos en agitación en hipoclorito sódico (lejía comercial al 20%) y unas gotas de Tween 20. Los tiempos a los que se sometieron los explantos en los distintos tratamientos fueron: 1-15 min. 2-15 min + 5 min 24 h después. 3-20 min. 4-20 min con un baño previo en etanol al 70% durante 30 s. 5-25 min. 6-30 min + 5 min 24 h después. Explantos de hoja y pecíolo En un ensayo preliminar se utilizó únicamente la variedad Tempranillo, procedente de una planta ajena a nuestro estudio mantenida en cámara de cultivo, para establecer el tratamiento menos dañino y/o más efectivo para este tipo de explantos. Se sometieron a diferentes tiempos de desinfección utilizándose siempre hipoclorito sódico (lejía comercial al 20%) y unas gotas de Tween 20. La desinfección se realizó de la hoja con su pecíolo y una vez transcurrido el proceso de desinfección se separaron los distintos explantos en la cabina de flujo laminar. Los tiempos a los que se sometieron los explantos en los distintos tratamientos fueron: ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 24

1-10 min. 2-15 min y un baño previo en etanol al 70% durante 30 s. 3-15 min. 4-20 min. Para las variedades objeto de estudio se utilizó el protocolo 1, es decir someter las hojas a una desinfección con hipoclorito sódico durante 10 min. 3.3.1. ELIMINACION DEL DESINFECTANTE Para eliminar el desinfectante de los explantos se decantó con cuidado la mayor parte en un vaso de precipitado, se añadió agua estéril al tarro hasta la mitad, se tapó, se agitó brevemente y se volvió a decantar, repitiendo este paso tantas veces como fuese necesario. Una vez eliminado todo el desinfectante se mantenía el explanto dentro del tarro tapado hasta su uso. Todo este proceso se llevó a cabo en la cabina de flujo laminar previamente limpiada con etanol al 75%. 3.4. MANEJO IN VITRO La manipulación de los explantos se realizó en cabina de flujo laminar estéril. Con los explantos desinfectados y la ayuda de pinzas, bisturí y placas Petri de cristal de 11 mm de diámetro previamente esterilizadas en el autoclave, se procedió como se explica a continuación: - Explantos de yema y segmentos nodales Con la ayuda de unas pinzas se depositaron en la placa Petri y se eliminaron las partes dañadas por el desinfectante obteniendo porciones de aproximadamente 1cm de lado. Se colocaron en los botes con el medio de cultivo (3 explantos por tarro) se sellaron con parafilm y se etiquetaron marcando la fecha de cultivo y la variedad. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 25

- Explantos de hoja Con la ayuda de unas pinzas se depositaron en la placa Petri. Cada hoja se cortó en porciones de aproximadamente 1,5 x 1,5 cm de lado colocándolas en las placas Petri (3 explantos por placa), se sellaron con parafilm y se etiquetaron marcando la fecha de cultivo, la variedad y el medio empleado. - Explantos de pecíolo Una vez separados los pecíolos de las hojas se depositaron en la placa Petri y se cortaran en porciones de aproximadamente 2 cm de longitud. Las porciones se colocaron en los tubos (1 explanto por tubo) y se etiquetaron marcando la fecha de cultivo, la variedad y el medio empleado. Todo los explantos obtenidos fueron conservados en cámara con termofotoperiodo con 16 horas de luz a 24 ºC y 8 horas de oscuridad a 18 ºC con una intensidad de luz de 2000 ± 200 lux. 3.5. CONTROL DE LA EVOLUCIÓN DE LOS EXPLANTOS A pesar de los procesos de desinfección realizados una parte de los explantos cultivados se infectaban. Tras el cultivo se realizaron observaciones cada 3 días para eliminar lo antes posible los recipientes contaminados. Para el seguimiento del crecimiento de los cultivos de hoja y peciolo se realizaron observaciones transcurridos 21 días desde la fecha de cultivo y cada 21 días sucesivamente desde la última fecha de observación. Se realizaron dos observaciones en los cultivos de yema, a los 30 y a los 60 días. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 26

3.6. ESTUDIO ESTADÍSTICO Para el estudio estadístico se utilizó el programa informático Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 10.0 (spss Inc., 1999). El estudio estadístico solo fue posible realizarlo para los explantos de pecíolo ya que fue el material vegetal del que se pudieron obtener suficientes individuos para realizar un mayor número de repeticiones. Para el análisis de los resultados se realizó una comparación entre medias por medio de pruebas paramétricas. Para determinar entre que medias existían diferencias significativas se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) mediante la prueba de comparaciones múltiples Duncan. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 27

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. ASEPSIA DEL EXPLANTO INICIAL Explantos de yema En todas las variedades la desinfección empleada fue de etanol 30s seguido de hipoclorito sódico 20 min. La tasa de infección para explantos de yema tras 30 días de cultivo fue superior al 50%. Como se muestra en el figura 3 la variedad Tempranillo Blanco obtuvo el menor porcentaje de infección y la variedad Mazuelo fue la que mayor porcentaje de infección presentó para este tipo de explanto y tiempo de desinfección. Figura 3. Contaminación en explantos de yema (%) a los 30 días de cultivo. Tabla 4. Contaminación en explantos de yema. Explantos observados Días de cultivo Explantos contaminados Graciano 84 30 65% 29 60 100% Tempranillo 52 30 50% Blanco 26 60 100% Mazuelo 92 30 73% 68 60 100% Tempranillo 40 30 61% 25 60 100% ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 28

A los dos meses de cultivo se produjo la contaminación del 100% de los explantos cultivados impidiendo la obtención de material para posteriores estudios (tabla 4). El hecho de que en el laboratorio de cultivo in vitro se realicen prácticas de microbiología y estén presentes materiales como tierras y plantas vivas, puede haber influido en el aumento de esporas de hongos (Vargas y Abdelnour, 2010). Por otra parte, el uso de aplicaciones fungicidas y bactericidas en el material vegetal de partida puede ayudar a la obtención de explantos más limpios (Debergh, 1999). La contaminación apreciada a los 60 días de cultivo aparentemente no procedía de la zona superficial del explanto, por lo que se puede presumir que estaba localizada en los tejidos internos donde la desinfección superficial no es efectiva. Es posible que el cultivo de meristemos pudiera permitir disponer de porciones suficientemente pequeñas y libres de patógenos. Algunos autores indican que el empleo de antibióticos como estreptomicina (Vargas y Abdelnour, 2010) facilitan el establecimiento del cultivo estéril, otros como Kyte y Kleyn en 1996 por el contrario, manifiestan la ineficacia de su empleo pudiendo llegar a ser tóxicos para el material vegetal. Explantos de segmentos nodales En todos los ensayos de desinfección realizados con este explanto inicial se produjo una tasa de infección del 100%, motivo por el cual se desechó el uso de explantos de segmentos nodales para el ensayo de cultivo in vitro. El material vegetal de partida provenía de pasar el reposo invernal en campo y conservaba todas sus cubiertas protectoras haciendo más difícil la desinfección que si hubiese brotado en cámara de crecimiento. Las consideraciones realizadas en el apartado anterior respecto a la contaminación en los explantos de yema pueden aplicarse igualmente a los explantos de segmentos nodales. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 29

Explantos de hoja En la tabla 5 se observan los resultados de la desinfección a los 5 días de la asepsia obtenida en los ensayos preliminares realizados con hojas de Tempranillo para determinar el procedimiento mas adecuado y menos lesivo. En los ensayos en los que el tiempo de desinfección superaba los 15 min el material vegetal quedaba excesivamente dañado. Con 10 min de desinfección el material quedaba en mejor estado y se alcanzaba la asepsia dentro de los límites tolerables (tabla 5). A partir de estos resultados se optó por realizar las desinfecciones de las distintas variedades siguiendo este protocolo. Tabla 5. Resultados del tiempo de desinfección en explantos de hoja a los 5 días de cultivo. Desinfección % % % muerte Etanol 70% NaClO 20% contaminación supervivencia 1 10min 30 0 70 2 30s 15min 0 100 0 3 15min 0 100 0 4 20min 0 100 0 En la figura 4 y en la tabla 6 se reflejan los porcentajes de infección obtenidos en las distintas variedades, siguiendo el protocolo 1 de la tabla 5. En esta prueba la variedad Tempranillo presentó la mayor tasa de asepsia mientras que la variedad Tempranillo Blanco fue la que menor porcentaje de asepsia mostró, no obstante las diferencias encontradas no fueron importantes. Figura 4. Contaminación en explantos de hoja (%) a los 63 días de cultivo. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 30

Tabla 6. Contaminación en explantos de hoja. Explantos observados Días de cultivo Explantos contaminados Graciano 150 63 39,5% Tempranillo Blanco 186 63 43,3% Mazuelo 294 63 39,8% Tempranillo 291 63 38,1% Explantos de pecíolo En la tabla 7 se observan los resultados de la desinfección a los 5 días de la asepsia obtenida en los ensayos preliminares realizados con pecíolos de Tempranillo para determinar el procedimiento mas adecuado y menos lesivo. Como se observa en la tabla 7, los resultados obtenidos en cuanto a contaminación son muy parecidos a los descritos para los explantos de hoja en el apartado anterior, variando el porcentaje de contaminación del protocolo 1 (10 min de desinfección con Hipoclorito sódico), que con este tipo de explanto disminuye hasta el 10 %. A partir de estos resultados se optó por realizar las desinfecciones de las distintas variedades siguiendo este protocolo. Tabla 7. Resultados del tiempo de desinfección en explantos de pecíolo a los 5 días de cultivo. Desinfección Etanol 70% NaClO 20% % contaminación % muerte % supervivencia 1 10min 10 0 90 2 30s 15min 0 100 0 3 15min 0 100 0 4 20min 0 100 0 ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 31

En la figura 5 y la tabla 8 se muestran los porcentajes de infección obtenidos para las distintas variedades, siguiendo el protocolo 1 de la tabla 7. En esta prueba la variedad Tempranillo Blanco presentó la mayor tasa de asepsia mientras que las variedades Tempranillo y Graciano fueron las que menor porcentaje de asepsia mostraron. Es interesante destacar como el nivel de asepsia alcanzado con explantos de pecíolo (en torno al 90%) es muy superior al alcanzado con las hojas (en torno al 60%), debido posiblemente a que la pubescencia de las hojas impide que el desinfectante actué de forma tan eficaz. Figura 5. Contaminación en explantos de pecíolo (%) a los 63 días de cultivo. Tabla 8. Contaminación en explantos de pecíolo. Explantos observados Días de cultivo Explantos contaminados Graciano 60 63 9,7% Tempranillo Blanco 58 63 4,8% Mazuelo 61 63 8,1% Tempranillo 57 63 9,7% ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 32

4.2. EVOLUCIÓN Y CRECIMIENTO DEL EXPLANTO INICIAL Explantos de yema en: Los aspectos elegidos para el control de la evolución de explantos de yema se basaron - Número de hojas presentes en el explanto. - Crecimiento del explanto medido por el número de nudos presentes. - Presencia o no de raíces. En este ensayo, el crecimiento de los explantos se produjo de forma lenta y sin avances en la evolución de los parámetros fijados para la toma de datos, como se aprecia en Tabla 9 y se comenta a continuación. En la primera observación a los 30 días de cultivo y para la mayoría de los explantos de todas las variedades no se obtuvieron individuos con más de 3 entrenudos, con más de 2 hojas y/o con la presencia de raíces. En la segunda observación a los 60 días de cultivo los resultados decayeron aún más produciéndose la infección de la totalidad de los explantos. Posiblemente el escaso desarrollo y crecimiento apreciado haya sido debido a la presencia de agentes contaminantes en los inóculos se manifiestan trascurridos dos meses de cultivo. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 33

Tabla 9. Cultivo de explantos de yema (%). Graciano T. Blanco Mazuelo Tempranillo % de individuos con Nº de hojas Nº entrenudos Raíces Explantos observados 15 0 16 0 20 0 17 0 Días de cultivo 30 60 30 60 30 60 30 60 0 58,3 25,0 65,2 62,5 1 8,3 12,5 8,7 20,8 2 33,3 43,8 21,7 16,7 3 0 18,7 4,4 0 0 58,3 25,0 30,4 37,5 1 8,3 6,3 4,4 20,8 2 25,0 25,0 34,8 33,3 3 8,4 37,5 17,4 4,2 4 0 6,2 4,4 4,2 Presentes 8,4 0,0 4,4 8,3 Ausentes 91,7 100,0 95,7 91,7 A pesar de la contaminación, destaca la variedad Tempranillo Blanco por presentar en mas del 50 % de los explantos, dos o mas hojas y/o dos o mas entrenudos y por ser la única de las cuatro variedades en la que no proliferó el crecimiento de raíces. En la anejo II se muestran imágenes de las variedades Mazuelo y Tempranillo de las que se obtuvieron individuos que presentaban un número de entrenudos mayor a 3, hojas de 2-3 cm. y presencia de numerosas raíces de longitudes entre 7-10 cm. Explantos de segmentos nodales Con este tipo de explanto no se realizó ensayo de crecimiento y evolución debido a que no fue posible alcanzar la asepsia del cultivo. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 34

. Explantos de hoja La evolución de los resultados de este ensayo se realizo mediante dos tipos de comparaciones: 1º- Cada variedad según su evolución en los diferentes medios. 2º- Cada medio según los resultados obtenidos en todas las variedades. Los aspectos de control de explantos de hoja se basaron en un rango de números del 1 al 10 atendiendo a la aparición, crecimiento, color y posición de algún tipo de callo. La composición de cada medio esta recogida en la tabla 3 del apartado de materiales y métodos. Los diferentes tipos de crecimiento establecidos para las observaciones fueron: Tipo 1: Necrosis total del explanto. Tipo 2: Necrosis parcial con partes en crecimiento activo. Tipo 3: Crecimiento activo representado como un cierto abultamiento del explanto. Tipo 4: Fuerte engrosamiento de los nervios del envés de la hoja apareciendo en algunos casos algún tipo de callo solo visible con la ayuda de la lupa binocular. Tipo 5: Callo visible en el envés con la ayuda de la lupa binocular. Tipo 6: Callo claramente visible en el envés y algo apreciable en el haz con la ayuda de la lupa binocular. Tipo 7: Callo claramente visible en el envés y abundante abultamiento del explanto en el haz. Tipo 8: Callo visible en el envés sin la ayuda de la lupa binocular y aparición de callo en el haz. Tipo 9: Abundante callo visible en el envés y en el haz visibles sin la ayuda de la lupa binocular. Tipo 10: Abundante callo visible en el envés y en el haz sin la ayuda de la lupa binocular y aparición de raíces. A continuación se muestra una imagen tipo de cada uno de los estados de crecimiento tipo observados. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 35

. ( equivale aproximadamente a 2 cm.) ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 36

. En todas las variedades y para todos los protocolos, si existió algún tipo de crecimiento se producía en el envés de la hoja, es decir, en la zona de contacto del medio con el explanto. En todas las variedades aparecen callos de consistencia friable (fácilmente desmenuzables) y de consistencia no friable (duros). Los callos no friables son de color marrón y los de tipo friable son de color blanquecino, apareciendo no obstante alguno con pigmentos verdes y rojos, este tipo de consistencia del callo es adecuada para realizar suspensiones celulares (Pierik, 1990). Los resultados obtenidos se exponen en la tabla 10. En el anejo III se muestran imágenes de algunos de los callos obtenidos para cada variedad y protocolo. - Según el protocolo usado se observó: Para todas las variedades en el protocolo 0 no hubo crecimiento activo y los explantos terminaron por necrosar. Sin embargo, las variedades muestran diferencias en las primeras semanas de cultivo. En este sentido, el Tempranillo Blanco muestra una menor actividad a los 21 días de cultivo, ya que el 75% de los explantos se encuentraron en ese momento en necrosis total, a diferencia del 50 % que presenta el resto de variedades. Por otra parte, únicamente el Tempranillo mantuvo algún explanto con cierta viabilidad (un 8,3 % con crecimiento tipo 2) a los 42 días de cultivo. Para el protocolo 0,5 todas las variedades la evolución de los explantos a callo se produjo en muy bajos porcentajes. En la primera observación a los 21 días de cultivo ninguno de los explantos supera el crecimiento tipo 4. En este momento muestra una mayor actividad la variedad Graciano que alcanza dicho estado de evolución con un 83 % de explantos viables a diferencia del resto de variedades que no superan el 50 % de explantos viables. En esta misma línea se observa que a los 42 días de cultivo sigue siendo la variedad Graciano la que destaca por su actividad con un 60 % de individuos viables y con un crecimiento tipo 6, nivel que no ha sido alcanzado por ningún individuo del resto de variedades. En esta segunda observación la totalidad de los explantos de Tempranillo Blanco mostraban necrosis total. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 37

. La mortalidad fue muy elevada para todas las variedades pero en las observaciones destaca que el escaso número de explantos viables de Graciano (un 20 %) muestran el crecimiento máximo ( crecimiento tipo 10 ) en que se produce rizogénesis. Este comportamiento se explica por ser el medio donde el nivel de citoquinina es menor. El medio utilizado para el protocolo 1 se mostró más favorable para la variedad Graciano que para el resto de las variedades ya que no muestra individuos necrosados y los explantos viables se observan entre los crecimientos tipo 7 y 8 mientras el resto de variedades presenta una elevada mortalidad, destacando la variedad Tempranillo Blanco que muestra un 100 % de los explantos necrosados. De forma ocasional la variedad Tempranillo muestra rizogénesis en un 10 % de los explantos a los 63 días de cultivo. Para la concentración utilizada en el protocolo 2 se observa a los 63 días de cultivo que la variedad Tempranillo Blanco presenta un 100 % de los explantos necrosados, igualmente se produce la mortalidad del 68,7 % y del 50 % de los explantos de Tempranillo y Mazuelo, a diferencia del 16, 7 % de los explantos necrosados de Graciano. Respecto a la actividad la variedad Graciano alcanza un crecimiento tipo 8 en el 25 % de sus explantos viables y un crecimiento tipo 9 en el 58,3 % de sus explantos viables, mientras que para las variedades Mazuelo y Tempranillo se produjo un crecimiento tipo 8 del 50 % y del 31,3 % de sus explantos respectivamente. Stamp et al (1990) en el estudio realizado con hojas de Vitis spp. Utilizando este mismo medio aprecian una mayor frecuencia de organogénesis, apreciación que en este ensayo no se ha producido apareciendo a diferencia únicamente callogénesis. Por último, en cuanto al protocolo 4, el de mayor proporción de citoquinina, presentó un comportamiento muy variable entre las variedades. Nuevamente es la variedad Graciano la que presenta la mejor repuesta no produciéndose la mortalidad de ninguno de sus individuos, mostrando a los 21 días de cultivo una actividad del 75 % de sus explantos viables con un crecimiento tipo 8 y finalizando a los 63 días de cultivo con ese mismo porcentaje peor alcanzando el crecimiento tipo 9. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 38

. Por el contrario la variedad Tempranillo Blanco muestra un 41,7 % de los explantos con crecimiento tipo 9 a los 21 días de cultivo pero a los 63 días de cultivo muestra una mortalidad del 90 % de sus explantos. Las variedades Mazuelo y Tempranillo tienen un comportamiento intermedio con una mortalidad entre el 50-60 % de los explantos a los 63 días de cultivo y con un 37,5 % de los explantos con un crecimiento tipo 8 en la variedad Mazuelo y un 45,4 % un crecimiento tipo 7 en la variedad Tempranillo. - Según cada variedad con su medio se observó: Graciano: o Presenta el mayor porcentaje de individuos que alcanzaron el mayor crecimiento en todos los protocolos ensayados. o En el protocolo 0,5 destaca la aparición de raíces, coincidiendo con la mayor y mas adecuada relación auxina/citokinina de las ensayadas para conseguir rizogénesis según Augé et al. (1984), aunque esta apreciación solo apareció en el 20% de los individuos. o La semejanza de resultados obtenidos para los protocolos 2 y 4, así como ser los medios que mayor proliferación de callos presentan. o En todos los protocolo s alvo el 0, a medida que avanza el cultivo mejora la respuesta de los explantos. o A medida que aumenta la concentración de citoquinina en el medio mejora la respuesta de los explantos. o Destacar la respuesta del protocolo 4 ya que si bien no se produjo el crecimiento máximo (no hubo emisión de raíces) mostraban un crecimiento tipo 9 el 75 % de los individuos viables. Tempranillo Blanco: o En todos los protocolos seguidos, salvo en el protocolo 4, la totalidad de los explantos observados terminaron necrosándose a los 63 días de cultivo (ver anejo III, imagen 3a), incluso la mortalidad del protocolo 4 fue muy elevada ya que alcanzo el 90 %. o Algunos de los callos aparecidos en el protocolo 4 muestran coloración verde (ver anejo III). ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 39

. Mazuelo: o Los protocolos 2 y 4 presentan un comportamiento similar, aunque con mayor porcentaje (50 %) de explantos del crecimiento tipo 8 en el protocolo 2. o Esta variedad muestra mejor respuesta al incremento de la concentración de citoquinina hasta el nivel 2, disminuyendo la actividad en el protocolo 4 (el de mayor concentración de citoquinina). Tempranillo: o El protocolo 4 es el medio con mejor aptitud para esta variedad con un mayor % de explantos viables aunque el crecimiento tipo alcanzado no supera en ningún caso el de los protocolos 1 y 2. Así en el protocolo 4 el 45 % de los explantos alcanzaron el crecimiento tipo 7 mientras que en el protocolo 2 llegan al crecimiento tipo 8 un 31,3 % de los explantos y el protocolo 1 donde el 10 % alcanza la máxima expresión de crecimiento, es decir el crecimiento tipo 10 que corresponde a la aparición de raíces. La variabilidad manifestada en la respuesta de las diferentes variedades ante el mismo medio de cultivo, pone de manifiesto la importancia del genotipo en la respuesta a los reguladores de crecimiento. Esta observación confirma los síntomas de Mhatre et al. (2000) indican diferencias entre Thompson Seedless, Sonaka y Tas-e- Ganesh, incluso los trabajos de Pinto-Sintra (2007) y Barreto et al. (2008) indican diferencias importantes en el comportamiento no solo entre variedades de vid, sino también entre clones de una misma variedad. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 40

. Tabla 10. Cultivo de explantos de hoja (%). * % de explantos tipo BA (mg/l) % de explantos tipo * * ** GRACIANO 0 0,5 1 2 4 Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 50,0 100,0 100,0 16,7 20,0 80,0 16,7 16,7 16,7 2 50,0 3 4 83,3 20,0 5 50,0 6 60,0 50,0 50,0 7 50,0 60,0 83,3 25,0 25,0 8 40,0 83,3 25,0 75,0 75,0 25,0 9 58,3 75,0 10 20,0 BA (mg/l) ** T. BLANCO 0 0,5 1 2 4 Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 75,0 100,0 100,0 40,0 100,0 100 50,0 100 33,3 87,5 100 33,3 60,0 90,0 2 25,0 20,0 28,6 22,2 3 10,0 14,3 50,0 12,5 4 30,0 57,1 44,5 10,0 5 6 7 20,0 8 25,0 10,0 10,0 9 41,7 10 % de explantos tipo BA (mg/l) % de explantos tipo ** MAZUELO 0 0,5 1 2 4 Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 46,7 100,0 100,0 20,0 78,6 92,3 5,6 31,3 75,0 37,5 50,0 40,0 64,3 2 53,3 26,7 21,4 22,2 3 26,7 7,7 4 26,7 5,6 37,5 26,7 5 50,0 33,4 6 38,9 31,3 25 29,4 7 22,2 62,5 23,5 8 22,2 50,0 47,1 33,3 35,7 9 10 BA (mg/l) ** TEMPRANILLO 0 0,5 1 2 4 Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 53,8 91,7 100,0 45,4 63,6 60,0 60,0 5,3 38,9 68,7 5,9 35,7 54,5 2 46,2 8,3 35,3 38,5 36,8 47,1 3 17,6 54,5 36,4 22,2 4 47,1 23,1 16,7 5 15,3 5,3 6 23,1 40,0 30,0 10,5 22,2 7 26,3 23,5 64,3 45,4 8 15,8 31,3 23,5 9 10 10,0 *La identificación de los explantos tipo se describe en el apartado 3.5.2.2. ** El medio esta compuesto por la cantidad citada de BA y 0,5 mg/l de IBA, excepto en el primera columna que el IBA es de 0mg/l. * ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 41

. Explantos de pecíolo Se han realizado dos estudios con los resultados obtenidos de los explantos de pecíolo. El primer análisis, similar al ya descrito para explantos de hoja, se basa en evaluar el aspecto que mostraban los explantos a lo largo del cultivo; el segundo se realizó mediante un análisis estadístico valorando el peso alcanzado de los explantos al final del cultivo. 1- Valoración atendiendo a los crecimientos tipo Los aspectos de control de explantos de pecíolo se basaron en una escala del 1 al 10 atendiendo a la aparición, crecimiento, color y posición de algún tipo de callo. La escala se estableció en base a la evolución del cultivo de las variedades de estudio considerando relevantes características discordantes entre variedades y entre protocolos. Los diferentes tipos de crecimiento establecidos para las observaciones fueron: Tipo 1: Necrosis total del explanto. Tipo 2: Necrosis con cierto crecimiento en longitud y/o grosor. Tipo 3: Crecimiento activo con cierto crecimiento en longitud y/o grosor. Tipo 4: Fuerte engrosamiento de uno de los extremos del explanto en algunos casos con proliferación de callo. Tipo 5: Callo presente en uno de los extremos del explanto y engrosamiento del otro extremo. Tipo 6: Callo visible en ambos extremos del pecíolo. Tipo 7: Callo visible en ambos extremos del pecíolo y con cierta actividad en el centro del explato en la zona de contacto con el medio Tipo 8: Aparición de callo en los extremos y centro del explanto Tipo 9: Callo en crecimiento activo que cubre casi por totalidad el explanto inicial. Tipo 10: Aparición de raíces en los callos. A continuación se muestra una imagen tipo de cada uno de los estados de crecimiento tipo observados. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 42

. ( equivale aproximadamente a 2 cm.) ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 43

. Para todos los protocolos y variedades el inicio de la actividad de crecimiento empezó el la zona lesionada del explanto (los extremos del pecíolo) y fundamentalmente en la zona de contacto del medio con el explanto. En todas las variedades aparecen callos de consistencia friable (fácilmente desmenuzables) y de consistencia no friable (duros). Los callos no friables son de color marrón y los de tipo friable son de color blanquecino, apareciendo no obstante alguno con pigmentos verdes y rojos, este tipo de consistencia del callo es adecuada para realizar suspensiones celulares (Pierik, 1990). Los resultados obtenidos se exponen en la tabla 11. En el anejo IV se muestran imágenes de algunos de los callos obtenidos para cada variedad y protocolo. - Según protocolo se observó: En el protocolo 0 a los 63 días de cultivo las variedades Mazuelo y Tempranillo presentaban necrosis en el 100 % de los explantos mientras que las variedades Graciano y Tempranillo Blanco tuvieron un mejor comportamiento en este medio donde la mortalidad no supero el 64 %. Sin embargo el crecimiento máximo alcanzado por los explantos viables se limita al crecimiento tipo 2 en el que no hay presencia de callo. Estos resultados coinciden con los resultados obtenidos por Clog et al. (1990) en el que señala que la presencia de reguladores es esencial para la obtención de callo. En lo observado para el protocolo 0,5 las variedades Mazuelo y Tempranillo mostraron una mejor respuesta frente a las otras dos variedades al menos en lo referente al crecimiento tipo máximo alcanzado ( crecimiento tipo 9), si bien la variedad Tempranillo Blanco alcanzó un mayor porcentaje de explantos viables (85 %) aunque de menor nivel de crecimiento ( crecimiento tipo 6). En cuanto a la actividad de los explantos cultivados en el protocolo 1 son de nuevo las variedades Mazuelo y Tempranillo las que mejor respuesta mostraron ya que ninguno de los explantos presento un nivel inferior al crecimiento tipo 4, llegando la variedad Tempranillo a la máxima expresión de crecimiento descrita ( crecimiento tipo 10) con un 27,3 % de los explantos que llegó a alcanzar la rizogénesis. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 44

. No obstante las variedades Graciano y Tempranillo Blanco también mostraron buena respuesta a este medio donde la mortalidad no supero el 40 % de los individuos. De los explantos viables la variedad Mazuelo alcanza un 33 % de individuos con crecimiento tipo 6 y la variedad Tempranillo Blanco un 36,4 % con crecimiento tipo 9. Las variedades Tempranillo Blanco, Tempranillo y Mazuelo presentan para el protocolo 2 una respuesta similar ya que en las dos primeras alcanzaron un crecimiento tipo 9 entorno al 35 % de los explantos y en la otra alcanzaron un crecimiento tipo 8 entorno al 50 % de los explantos. Se aprecia diferencia en la variedad Graciano con el resto de variedades donde si bien no hubo mortalidad, el 70 % de los explantos no supera el crecimiento tipo 2. Respecto a la mortalidad alcanzada para el protocolo 4 se observa para las variedades Mazuelo y Tempranillo una similitud en el comportamiento ya que presentaron una proporción sensiblemente superior a las otras variedades (44,4 % de explantos de Tempranillo; 30,8 % de explantos de Mazuelo; 9,1 % de explantos de Graciano; 0 % de explantos de Tempranillo Blanco). En este protocolo el mayor desarrollo fue alcanzado por la variedad Tempranillo Blanco donde el 7,7 % de los explantos viables alcanzaron el crecimiento tipo 9, mientras que las variedades Tempranillo, Mazuelo, Graciano no superaron el crecimiento tipo 8, 7 y 5 respectivamente. - Según cada variedad se observó: Graciano: o En el protocolo 0 se presentó una mortalidad muy elevada (un 63,3 % de explantos) y no se superó el crecimiento tipo 2. o No se observan diferencias singulares entre el resto de protocolos, si bien se puede mencionar que a los 63 días de cultivo no se produce mortalidad de explantos en el protocolo 2 y que en ninguno de los protocolos se superó el crecimiento tipo 6. o Mencionar también que al inicio del cultivo (a los 21 días) el crecimiento de los explantos en los protocolos 2 y 4 alcanzo el crecimiento tipo 8 con un 20 % y un 25 % de individuos respectivamente. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 45

. Tempranillo Blanco: o En el protocolo 0 se presentó una mortalidad muy elevada (un 63,6 % de explantos) y los explantos viables no superaron el crecimiento tipo 2. o En los medios donde la concentración de citoquinina es superior a 1 ppm se alcanzó el crecimiento tipo 9, siendo en los protocolos 1 y 2 donde esta respuesta alcanza el mayor porcentaje (36 %) de individuos que alcanzan este desarrollo. o Si bien los protocolos 0,5 y 4 no muestran una actividad tan importante cabe mencionar que presentaron un porcentaje de mortalidad nulo. Mazuelo: o En el protocolo 0 se presentó una mortalidad del 100 % de los explantos. También mencionar que en los protocolos 2 y 4 la mortalidad de los individuos supero en ambos casos el 30 %. o La mejor respuesta para esta variedad se observa en los protocolos 0,5 y 1 donde el 50 % de los explantos alcanzan el crecimiento tipo 9 y el 72,7 % de los explantos alcanzan el crecimiento tipo 8 respectivamente. Tempranillo: o Se produce mortalidad de explantos en los protocolos 0, 2 y 4 con un 100 %, un 25 % y un 44,4 % de los explantos ensayados respectivamente. o Los protocolos 0,5 y 1 mostraron una respuesta muy superior al resto de protocolos ya que en al menos el 50 % de los explantos alcanzo un crecimiento tipo 8 o superior, llegando incluso a la máxima expresión de crecimiento en el protocolo 1 donde en un 27,3 % de los individuos se produce rizogénesis. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 46

. Tabla 11. Porcentajes obtenidos para explantos de pecíolo GRACIANO BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4 % de explantos tipo* Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 63,6 66,7 63,3 8,3 16,7 33,3 10,0 8,3 33,3 9,1 2 36,4 33,3 36,4 25,0 41,7 30,0 50,0 70,0 8,3 63,6 3 8,3 16,7 4 33,3 33,3 25,0 8,3 20,0 41,7 33,3 5 33,4 33,3 8,3 33,3 27,3 6 33,3 8,3 50,0 50,0 33,3 10,0 30,0 16,7 7 33,3 50,0 10,0 50,0 8 20,0 25,0 33,3 9 10 T. BLANCO BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4 % de explantos tipo* Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 63,6 20,0 63,6 36,4 18,2 2 36,4 80,0 36,4 18,2 15,4 25,0 9,1 7,7 3 9,1 4 9,1 8,3 14,3 18,2 16,7 23,1 23,1 5 45,4 14,3 8,3 18,2 7,7 15,4 6 18,2 84,6 36,4 23,1 14,3 7,7 7 85,7 58,4 28,8 36,4 33,3 9,1 30,8 14,3 15,4 8 42,8 27,3 50,0 18,2 15,4 71,4 23,1 9 36,4 36,4 7,7 10 MAZUELO BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4 % de explantos tipo* Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 11,1 50,0 100,0 33,3 30,8 2 88,9 50,0 41,7 8,3 25,0 30,0 3 7,7 4 66,7 80,0 36,4 9,1 5 9,1 33,3 18,2 25,0 40,0 16,7 23,1 6 25,0 20,0 18,2 25,0 25,0 7 8,3 8,3 36,4 66,7 41,7 60,0 46,1 60,0 46,1 8 72,7 50,0 9 50,0 10 TEMPRANILLO BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4 % de explantos tipo* Días de 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 cultivo 1 75,0 100,0 100,0 16,7 10,0 25,0 18,2 22,2 44,4 2 25,0 25,0 33,3 9,1 3 20,0 10,0 11,1 4 40,0 40,0 27,3 22,2 36,4 33,3 22,2 5 40,0 37,5 27,3 22,2 33,3 6 62,5 45,4 8,3 30,0 27,3 7 55,6 45,4 33,3 8 30,0 36,4 8,3 33,3 9 20,0 33,3 10 27,3 *La identificación de los explantos tipo se describe en el apartado 3.5.2.2. ** El medio esta compuesto por la cantidad citada de BA y 0,5 mg/l de IBA, excepto en el primera columna que el IBA es de 0mg/l. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 47

. 2- Valoración atendiendo al peso final del explanto. Para determinar el aumento de peso de los explantos se consideró que el peso inicial de las porciones de pecíolo era similar. Esta aproximación incrementa el margen de error pero ayuda a preservar la esterilidad del explanto. En la tabla 12 y la figura 6 se presentan los valores medios del aumento de peso de los explantos junto con el error típico. A partir de estos datos se realizan las valoraciones siguientes: - Según el protocolo se observó: o En el análisis realizado considerando todas las variedades se aprecian cuatro niveles de significación, desde el peso mínimo proporcionado por el protocolo 0 y que difiere significativamente de todos los demás, hasta el mayor alcanzado por el protocolo 1 cuyas diferencias son significativas con todos los medios salvo con el protocolo 2. o En el protocolo 0 no se aprecian diferencias significativas entre variedades. o La variedad Tempranillo Blanco fue la que alcanzo mayor crecimiento en el protocolo 0,5 mostrando diferencias significativas con todas las variedades excepto con la variedad Mazuelo. o La variedad Graciano fue la de menor crecimiento respecto al protocolo 1. Esta variedad muestra diferencias significativas con el resto de variedades cultivadas. o Para el protocolo 2 no existen diferencias significativas entre variedades, a excepción de la variedad Graciano con la que si que existen diferencias, si bien la variedad Tempranillo Blanco muestra mejor respuesta al cultivo que las otras variedades. o También es la variedad Tempranillo Blanco la que destaca en el protocolo 4 donde el peso medio alcanzado por los pecíolos supera de forma importante al resto de variedades. - Según la diferencia entre variedades se observó: o La variedad que mejor respuesta al cultivo de pecíolos fue Tempranillo Blanco, cuyo crecimiento, exceptuando a la variedad Mazuelo, fue significativamente diferente al resto de variedades cultivadas. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 48

. o Graciano: en esta variedad es el protocolo 0 el que proporcionó menor peso en los pecíolos cultivados aunque sin diferencias significativas con el protocolo 4. El resto de protocolos no presentan diferencias significativas entre ellos ni con el protocolo 4 aunque si con el protocolo 0. o Tempranillo Blanco: presento diferencias significativas del protocolo 0 con el resto de protocolos ensayados. Para esta variedad los resultados obtenidos, en todos los protocolos salvo el 0, son muy similares en cuanto a que la diferencia del peso final obtenido no fue muy dispar entre los diferentes medios. o Mazuelo: fue la variedad que presentó el mayor aumento de peso de pecíolo cultivado, concretamente en el protocolo 1, proporcionando diferencias significativas con todos los protocolos salvo el 2. También se presentan diferencias significativas del protocolo 0 con el resto de protocolos. o Tempranillo: se encontraron diferencias significativas del protocolo 1 con todos los protocolos salvo el 2. En cuanto al aumento de peso los pecíolos cultivados, los obtenidos en los protocolos 1 y 2 alcanzaron un valor muy superior al del resto de protocolos. Los resultados obtenidos para este tipo de explanto podrían resumirse especificando todas las diferencias entre ellos en el siguiente cuadro: Comparación entre Variedades con todos los medios Variedades con el protocolo 0 Variedades con el protocolo 0,5 Variedades con el protocolo 1 Variedades con el protocolo 2 Variedades con el protocolo 4 Protocolos con todas las variedades Protocolos con Graciano Protocolos con T. Blanco Protocolos con Mazuelo Protocolos con Tempranillo T. Blanco Mazuelo Tempranillo > Graciano Similar para todas las variedades T. Blanco > Mazuelo; Tempranillo y Graciano Mazuelo; Tempranillo y T. Blanco > Graciano T. Blanco Mazuelo y Tempranillo Graciano T. Blanco Mazuelo; Tempranillo y Graciano 1 2 4 0,5 > 0 1; 0,5 y 2 4 0 4; 1; 2 y 0,5 > 0 1 2 4 y 0,5 > 0 1 2 4 y 0,5 0 A este tipo de explanto podría aplicársele igualmente lo citado en el explanto de hoja respecto a que la variabilidad ante el mismo medio de cultivo, pone de manifiesto la importancia del genotipo en la respuesta a los reguladores de crecimiento. ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 49

. Tabla 12. Efecto de los diferentes medios de cultivo sobre el crecimiento de cuatro variedades de Vitis vinifera (g). Media ± Error típico 1 Protocolo (mg/l BA)* Variedades 0 0,5 1 2 4 Media de variedades GRACIANO T. BLANCO MAZUELO TEMPRANILLO Media de protocolos 0,074±0,019 aa 0,301± 0,092 ab 0,318± 0,081 ab 0,303±0,088 ab 0,177±0,024 aab 0,050±0,013 aa 0,727±0,147 bb 1,026±0,247 bb 1,003±0,274 bb 1,075±0,245 bb 0,079±0,032 aa 0,582±0,116 abb 1,280±0,172 bc 0,926±0,193 abbc 0,551±0,129 ab 0,037±0,005 aa 0,297±0,098 aab 1,096±0,226 bc 0,799±0,231 abbc 0,490±0,117 aab 0,060±0,017 A 0,363±0,113 B 0,930±0,181 D 0,758±0,196 CD 0,573±0,129 BC 0,234±0,061 a 0,776±0,926 c 0,684±0,128 bc 0,544±0,135 b 1 Medias seguidas de una misma letra mayúscula en la línea y minúscula en la columna no difieren entre si en el test de Duncan. (P<0,05). Media de variedades y media de protocolos se analizaran de forma separada. *Todos los protocolos salvo el cero incluyen 0,05 mg/l de IBA. Figura 6. Representación gráfica del efecto de los diferentes medios de cultivo sobre el crecimiento de cuatro variedades de Vitis vinifera (g). Media ± Error típico 1 ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 50