Enzygnost* HBe monoclonal

Enzyme immunoassay for the detection of hepatitis Be antigen and of antibodies to hepatitis Be antigen in serum and plasma Enzymimmunoassay zum Nachweis von Hepatitis Be-Antigen und Antikörpern gegen das Hepatitis Be-Antigen in Serum und Plasma Test immunoenzymatique pour la recherche de l antigène e et de l'anticorps anti-antigène e de l hépatite B dans le sérum ou le plasma Test immunoenzimatico per l'identificazione dell'antigene HBe dell'epatite B e degli anticorpi anti-hbe nel siero e nel plasma Prueba inmunoenzimática para la detección del antígeno de la hepatitis Be y de anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis Be en sueros y plasmas Teste imunoenzimático para determinação do antígeno da hepatite Be e de anticorpos contra o antígeno da hepatite Be no soro e plasma English: Page 2 to 10 Deutsch: Seite 11 bis 19 Français: Pages 20 à 28 Italiano: Pagina 29 fino 37 Español Página 38 hasta 46 Português: Página 47 a 55 Summary of Test Procedure Page 10 Kurzanleitung Testdurchführung Seite 19 La technique en bref Page 28 Istruzioni in breve, esecuzione del Test Pagina 37 Resumen de la técnica Página 46 Resumo da técnica Página 55 Bibliography/Literatur/Littérature/ Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 56 OQDM G11 C0541 (904) CS 1 Edition February 2004

Intended Use Enzyme immunoassay for the detection of hepatitis Be antigen and of antibodies to hepatitis Be antigen in serum and plasma. The enzyme immunoassay is processed using the BEP II, BEP III and BEP 2000 ELISA processors. The test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. The product is for in vitro diagnostic use only. The product is for in vitro diagnostic use only. Summary and Explanation HBe antigen and the corresponding antibody anti-hbe are found exclusively in connection with hepatitis B virus infection. The HBe antigen is frequently indicative of an acute infection but also occurs in chronic hepatitides (1, 2). HBe antigen appears already in the early phase of a hepatitis B infection. Using a sensitive immunoassay, it can be detected shortly after or sometimes almost at the same time as the increase in serum HBsAg (3, 4). The titre of the two antigens, HBsAg and HBeAg, rises rapidly during the phase of virus multiplication. However, unlike HBsAg, the levels of HBe antigen usually drop below the limit of detection of even very sensitive test systems within 6 to 10 weeks after their initial appearance (4, 5). During this period it is also possible to detect other serological parameters of liver disease (e.g. elevated transaminases). In those cases in which HBeAg persists in the serum beyond the normal elimination time - always accompanied by persistence of HBsAg - the patient is likely to develop chronic aggressive hepatitis (6, 7). For this reason, monitoring of the HBeAg levels in acute hepatitis B virus infection has a high importance with regard to the prognosis (8, 9). In hepatitis B patients without complications in the clinical course, HBeAg is no longer detectable once the phase of convalescence has begun. A negative HBeAg result can, however, be obtained not only in this post-infectious phase but also prior to peak virus replication in the early phase of acute infection (1, 2, 10). The appearance of anti-hbe provides a basis for differentiating between these two phases. Seroconversion from "HBeAg positive" to "anti-hbe positive" is a favourable sign indicative of convalescence and an uncomplicated course. Such patients may nevertheless remain HBsAg carriers and can develop chronic persistent hepatitis (7, 11). Positive detection of anti-hbe without concurrent detection of HBsAg and HBeAg points to a past hepatitis B virus infection (5). Principle of the Method Detection of HBeAg The enzyme immunoassay for the detection of HBe antigen in the serum or plasma is based on the sandwich principle. HBe antigen in the sample binds to monoclonal anti-hbe antibodies bound to the surface of the wells in the microtitration plate. Unbound sample constituents are then removed by washing, peroxidase-conjugated monoclonal antibodies to HBeAg are added and bind to the remaining free antigen determinants. The excess conjugate is washed out, hydrogen peroxide substrate with chromogen is added and reacts with the bound peroxidase producing a blue colour. This enzymatic reaction is stopped by the addition of Stopping Solution POD and the resulting yellow colour is measured. The resultant colour intensity is proportional to the concentration of HBeAg in the sample. Detection of Anti-HBe In the test for anti-hbe, anti-hbe antibodies in the sample block the HBeAg pipetted with the HBeAg Reagent, positive. When the resulting mixture is then used in the HBeAg test, no HBeAg or minimal HBeAg is detected if the sample is positive for anti-hbe. The colour intensity of the sample is inversely proportional to the concentration of anti-hbe. Limit of detection of the test With the Paul-Ehrlich-Institut reference preparation, exhibits a limit of detection of 1.5 U/mL for HBeAg and of 1 U/mL for anti-hbe. OQDM G11 C0541 (904) CS 2 Edition February 2004

Reagents Materials provided 1 x 96 (test plate) 1 test plate Anti-HBe/POD Conjugate (monoclonal) 1 x 13 ml HBeAg Reagent, positive 1 x 13 ml Anti-HBe Control, positive 1 x 1.5 ml HBe Control, negative 1 x 2.5 ml Washing Solution POD (Concentrate)**: 1 x 100 ml Buffer/Substrate TMB**: 1 x 30 ml Chromogen TMB**: 1 x 3 ml Stopping Solution POD**: 1 x 100 ml Empty bottle for Working Chromogen Solution 1 pcs. Adhesive foils 6 pcs. PE-bag 1 pcs. Barcode table 1 pcs. Instuctions for use 1 pcs. ** These components are also included in the Supplementary Reagents Kit for Enzygnost* TMB (code No. OUVP). Composition (test plate): Microtitration plate coated with monoclonal antibodies to HBeAg Anti-HBe/POD Conjugate (monoclonal): Monoclonal anti-hbe, conjugated with peroxidase (POD) Preservative: phenol (max. 1 g/l) HBeAg Reagent, positive: Genetically engineered HBe antigen, stabilized with bovine serum albumin and Synperonic, lyophilized Nominal absorbance: see "Validation" section; concentration: 8 ± 5 U HBeAg/mL after reconstitution Preservative: phenol (max. 1 g/l) Anti-HBe Control, positive: Human serum containing monoclonal antibodies to HBe antigen, nominal absorbance: see "Validation" section, concentration: 30 ± 20 U anti-hbe/ml Preservative: phenol (max. 1 g/l) HBe Control, negative: Negative human serum for the HBeAg and anti-hbe tests; nominal absorbances: see "Validation" section Preservative: phenol (max. 1 g/l) Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution (90 mmol/l) containing Tween (18 g/l) Preservative: phenol (max. 1 g/l) Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/l) in acetate buffer solution (25 mmol/l). Preservative: 1-butanol (max. 10 ml/l) Chromogen TMB: Tetramethyl benzidine dihydrochloride (5 g/l) Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera is tested for HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 and anti-hiv2. Only donations with negative findings are used for manufacture. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material(12). 3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure. 4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour at +121 C. All aspirated liquids should be collected in two receptacles connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and times specified by the manufacturer must be observed. Preparation of the Reagents Bring all reagents and samples to +18 to +25 C before the start of the test, without removing the test plate from the container. For each test plate, dilute 20 ml Washing Solution POD to 400 ml with distilled or demineralized water. OQDM G11 C0541 (904) CS 3

Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 ml Chromogen TMB with 10 ml Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit and store closed and protected from light. Rinse the bottle thoroughly with distilled water after use. For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB vial and the full contents of the Buffer/Substrate TMB vial. Working solution of HBeAg reagent, positive: Before the test reconstitute a vial of HBeAg Reagent, positive with 13 ml distilled or demineralized water. Shake gently to mix and ensure that the reagent has completely dissolved before use (approx. 30 min.) Storage and Stability Stored unopened at +2 to +8 C, all components of the test kit may be used up to the dates of expiry given on the labels. For complete stability and storage data see Table 1 in the Appendix. Materials required but not provided Equipment required: BEP II: For automatic dispensing of reagent and washing BEP III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation BEP 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test Pipettes: piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µl. Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 C) or comparable incubation methods All the equipment used in the test must have been validated. Specimens Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma) obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more 3 days at 2-8 C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen. Procedure Procedure for HBeAg test using the BEP II (Detection of HBeAg) 1. Pipetting scheme: Ascertain the number of wells required (number of samples to be investigated plus 6 wells for controls). Remove from the holder any strips which are not required for the test and store for later use (See Table 1 for stability data). 2. Dispense samples: Pipette 100 µl/well HBe Control, negative into 4 wells (A1 to D1), 100 µl of HBeAg Reagent, positive into the next well and then fill the following wells with 100 µl/well of undiluted sample. At the end of the series / plate pipette 100 µl of HBeAg Reagent, positive once more. As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the HBeAg Reagent, positive twice at the start of the series. Pipetting scheme: Pipette 100 µl/well of HBe Control, negative into 4 wells, 100 µl/well HBeAg Reagent, positive, into 2 wells (E1 and F1), and fill the subsequent wells with 100 µl/well of the test samples and cover with foil. 3. Incubate: Incubate at 37 ± 1 C for 60 ± 2 min. 4. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 2x with approx. 0.3 ml/well of diluted washing solution (see Note). Proceed immediately to the "Dispense conjugate" step. 5. Dispense conjugate: Fill each well with 100 µl of Anti-HBe/POD Conjugate, cover with fresh foil and immediately place into the incubator. 6. Incubate: Incubate at 37 ± 1 C for 60 ± 2 minutes, then proceed immediately to the "Wash" step. 7. Wash: Remove the foil and wash 4 times as described in "4. Wash". 8. Dispense substrate: Pipette 100 µl of the Working Chromogen Solution into each well and cover the plate with fresh foil. 9. Incubate: Incubate at +18 to +25 C for 30 ± 2 minutes, protected from light. 10. Stop reaction: Remove the foil and add 100 µl of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as in "8. Dispense substrate". 11. Read: At 450 nm within one hour. The use of a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams) is to be recommended. The absorbances of the control samples and patient samples are to be measured at a wavelength of 450 nm. The wavelength recommended for the reference reading is 650 nm (if necessary between 615 and 690 nm). Procedure for Anti-HBe test using the BEP II (Detection of Anti-HBe) 1. Pipetting scheme: Ascertain the number of wells required (number of samples to be investigated plus 6 wells for controls). Remove from the holder any strips which are not required for the test and store for later use (See Table 1 for stability data). OQDM G11 C0541 (904) CS 4

2. Dispense samples: Pipette 25 µl/well HBe Control, negative into 4 wells (A1 to D1), 25 µl of Anti-HBe Control, positive into the next well and then fill the following wells with 25 µl/well of undiluted sample. At the end of the series / plate pipette 25 µl of Anti-HBe Control, positive once more. As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the HBe Control, positive twice at the start of the series. Pipetting scheme: Pipette 25 µl/well of HBe Control, negative into 4 wells, 25 µl/well Anti-HBe Control, positive, into 2 wells (E1 and F1), and fill the subsequent wells with 25 µl/well of the test samples. 3. Binding of the anti - HBe: Directly after dispensing the samples, add 75 µl of HBeAg Reagent, positive, (working solution) into each well containing the 25 µl of sample or control, then seal with foil. Perform the subsequent steps as described for the HBeAg test, i.e. continue processing starting at "3. Incubate". Test procedure using the BEP III Before using the BEP III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 at "Test procedure with the BEP II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP III instruction manual). The settings for the incubation times in the BEP III software may differ from the times on the BEP II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP III. Test procedure using the BEP 2000 The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically by the analyzer (see BEP 2000 instruction manual). Validation The individual absorbance readings for the control sera are used to calculate the mean absorbance values if: HBeAg test -0.010 A neg. 0.100 A pos. 0.800 If one absorbance value of the negative controls is outside these limits, this value can be neglected. Both absorbance values of the HBeAg Reagent, positive must comply. If these conditions are not fulfilled, the relevant test must be repeated. Anti-HBe test A neg. 0.400-0.010 A pos. 0.150 If one absorbance value of the negative controls is outside these limits, this value can be neglected. If one absorbance value of the Anti-HBe Control, positive is outside these limits, this value can be neglected. Evaluation The evaluations are performed automatically if the BEP 2000 or BEP III is used. Please consult the relevant instruction manuals. The following sections apply if the measurements are carried out without using a software. HBe test Anti-HBe test Calculate the mean absorbance Calculate the mean absorbance value of the negative controls, value of the negative controls, then calculate the cut-off value then calculate the cut-off value by adding 0.050: by multiplication with 0.5: A neg + 0.050 = cut-off A neg x 0.5 = cut-off Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows: Test result for HBeAg Test result for anti-hbe 1. A sample < cut-off - 10% 1. A sample > cut-off + 10% = HBeAg negative = anti-hbe negative 2. cut-off -10% A sample cut-off +10% 2. cut-off -10% A sample cut-off +10% = HBeAg equivocal = anti-hbe equivocal 3. A sample > cut-off + 10% 3. A sample < cut-off -10 % = HBeAg positive = anti-hbe positive Samples with equivocal results must be retested but in double determinations. If in the retest the mean value of the double determination is greater than or equal to the cut-off, or less than the cut-off, the initial equivocal result can be ignored and the sample considered reactive or negative as appropriate. OQDM G11 C0541 (904) CS 5

Limitations of the Procedure 1. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate have no effect on the test result. 2. Samples that are lipaemic, icteric or contain rheumatoid factors do not impair the test results. 3. Haemolytic Samples may exhibit false-high reactivity. 4. Samples containing IgM antibodies to EBV / HAV / measles virus as well as samples containing ANA do not interfere with the test result. 5. Sample from haemophilia patients were not observed to interfere with the test result. 6. Sample from dialysis patients as well as samples positive for autoantibodies may exhibit elevated reactivity. 7. Incompletely coagulated sera and microbially contaminated test samples should not be used. 8. Heat-inactivated samples (1 h, 56 C) cannot be used as the resulting denaturation of the HBe antigen produces lower values in the antigen test. 9. If thawed samples are used, ensure that the material is thoroughly homogenized. 10. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Washing Solution POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a different number). 11. Buffer/Substrate TMB, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts which are in direct contact with the liquid). The substrate reaction steps must not be performed in the vicinity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the aforementioned solutions is to be avoided. 12. During the incubation steps the test plate should be protected from vibration (e.g. placed on a secured flotation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostatted water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with the solutions since such contamination can lead to unspecific reactions. 13. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has no effect on the test result. 14. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these instructions for use. 15. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient s medical history, clinical presentation and other findings. Specific Performance Characteristics Sensitivity and specificity The results of the sensitivity and specificity studies are summarized in Tables 2 + 4 (in the Appendix). In establishing the sensitivity of the test 216 HBeAg pos. samples and 224 anti-hbe pos. samples were investigated in two independent studies. The mean sensitivity results are as follows: Sensitivity initially reactive retest reactive HBeAg version 98.1 % 99.1 % Anti-HBe version 97.8 % 99.1 % In establishing the specificity of the test 2502 HBeAg neg. samples and 2406 anti-hbe neg. samples were investigated in two independent studies. The mean specificity results were as follows: Specificity initially negative retest negative HBeAg version 99.4 % 99.5 % Anti-HBe version 99.6 % 99.8 % Deviations from these values may occur due to differences in sample population, test procedure, etc. OQDM G11 C0541 (904) CS 6

Reproducibility The results on intra/inter-assay reproducibility are summarized in Table 5 (see Appendix). The data shown are typical values. Differences can, however, be expected depending on factors such as procedure, etc. * Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries. BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries. Synperonic is a registered Trademark of ICI. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE 19714 U.S.A. OQDM G11 C0541 (904) CS 7

Tab. 1 Storage and Stability Material/reagent State Storage Stability Enzygnost* Anti-HBe monoclonal once opened +2 to +8 C 4 weeks (Test plate) in the bag with the desiccant Anti-HBe/POD Conjugate mcl. once opened +2 to +8 C 4 weeks +18 to +25 C 2 days HBeAg Reagent, pos. after reconstitution +2 to +8 C 4 weeks -20 C 3 months Anti-HBe Control, pos. once opened +2 to +8 C 4 weeks HBe Control, negative -20 C 3 months Chromogen TMB once opened +2 to +8 C expiry date Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 C expiry date Working Chromogen Solution 1 + 10 +2 to +8 C 5 days +18 to +25 C 8 hours in closed container protected from light Washing Solution POD (concentrate) undiluted once opened +2 to +8 C expiry date 1:20 +2 to +8 C 1 week 1:20 +18 to +25 C 1 day Stopping Solution POD once opened +2 to +8 C expiry date use each component by the expiry date at the latest Tab. 2 Sensitivity The sensitivity studies performed at two independent centres (K, M) yielded the following data: Sample panel Number of samples initially reactive retest reactive (M) HBeAg pos. 109 108 109 (K) HBeAg pos. 107 104 105 (M) anti-hbe pos. 96 93 95 (K) anti-hbe pos. 128 126 127 Tab. 3 Tricky Panel Sample panel Number of samples initially reactive retest reactive HBeAg pos. 65 59 59 anti-hbe pos. 112 105 107 These panels contain mainly samples from the transitional phase for HBeAg/anti-HBe. The diminished sensitivity values may be due to the formation of immune complexes. OQDM G11 C0541 (904) CS 8

Tab. 4 Specificity The specificity studies performed at three independent centres (K, M, L) yielded the following data: Enzygnost* HBe monoclonal Sample panel Number initially retest of samples reactive reactive (M) normal neg. sera 804 3 3 normal neg. plasma samples 396 0 0 HBeAg (K) normal neg. sera 528 0 0 version (L) neg. sera from 584 8 7 non-hbv patients neg. sera from HBV patients 124 5 3 critical sera 66 0 0 (M) normal neg. sera 791 2 1 normal neg. plasma samples 387 1 0 Anti-HBe (K) normal neg. sera 521 1 1 version (L) neg. sera from 572 1 0 non-hbv patients neg. sera from HBV patients 78 4 2 critical sera 57 1 1 Samples containing potential trouble factors, e.g. autoantibodies, haemolytic and icteric samples. Tab. 5 Reproducibility In the studies on reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each of 5 days. The coefficients of variation (CV s) were calculated using the variance component model. HBeAg version Sample Mean Intra-assay Inter-assay absorbance %CV %CV F1 0,036 6,4 11,4 F2 0,102 3,8 9,3 F3 0,282 4,1 8,7 Anti-HBe version Sample Mean Intra-assay Inter-assay absorbance %CV %CV F1 1,421 3,6 6,3 F2 0,808 3,2 3,4 F3 0,458 7,4 4,4 OQDM G11 C0541 (904) CS 9

Tab. 6 Test procedure and programming steps HBeAg/Anti-HBe test Test procedure Menu programming (BEP II, BEP III, BEP 2000) for the HBeAg Prepare reagents MENU NO HBeAg Anti-HBe HBeAg Anti-HBe BEP 2000 OPERATE 1 NO YES DISPENSE 100 µl sample/control 25 µl HBEAG- REAGENT WASHINGS 0 0 BEP II Anti-HBe BEP III ASPIRATE SOAKTIME NO 0 NO 0 DISP VOL 0 075 CHANNEL NO 0 3 PHOT NO NO 75 µl HBeAg-Reagent, positive in the case of partially filled plates: Add "water- 60 min ± 2 min filled strips" to (37 ± 1 C) half fill the plates Wash 2x: BEP II 100 µl conjugate 60 min ± 2 min (37 ± 1 C) Wash 4x: BEP II 100 µl Working Chromogen Solution 30 min ± 2 min (+18 to +25 C protected from light) 100 µl Stopping Solution after maxi. 1 h Read at 450 nm (Referene wavelength: 650 nm) Test result Fully automatic processing BEP II OPERATE 2 YES WASH AND DISPENSE CONJUGATE WASHINGS 2 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL NO 1 PHOT NO OPERATE 3 YES WASH AND DISPENSE CHROMOGEN WASHINGS 4 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL NO 4 PHOT NO OPERATE 4 YES DISPENSE STOPPING SOLUTION WASHINGS 0 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL NO 5 PHOT YES YES MEAS WL 450 450 REF WL 650 650 BLK COR NO NO EVAL MODE 1 4 GEN CUT NO NO NEG CONT 4 4 MAX NEG 0,100 --- MIN NEG 0,400 FACT NEG 0,5 MAX POS 0,150 THRESH 0,050 --- CUT OFF --- OQDM G11 C0541 (904) CS 10

Anwendungsbereich Enzymimmunoassay zum Nachweis von Hepatitis Be-Antigen und Antikörpern gegen das Hepatitis Be-Antigen in Serum und Plasma Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP II, BEP III und BEP 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden. Diagnostische Bedeutung HBe-Antigen und der entsprechende Antikörper Anti-HBe werden ausschließlich im Zusammenhang mit einer Hepatitis B-Virus-Infektion gefunden. Das HBe-Antigen kann häufig eine akute Infektion anzeigen, ist aber auch bei chronischen Hepatitiden vorhanden (1, 2). HBe-Antigen erscheint bereits in der Frühphase einer Hepatitis-B-Infektion. Es ist kurz nach oder manchmal nahezu gleichzeitig mit dem Anstieg des HBsAg im Serum mittels eines empfindlichen Immunoassays nachweisbar (3, 4). Der Titer der beiden Antigene, HBsAg und HBeAg, steigt während der Phase der Virusvermehrung schnell an. Die Konzentration des HBe-Antigens fällt jedoch früher als die des HBs-Antigens - in der Regel 6 bis 10 Wochen nach seinem Auftreten - unter die Nachweisgrenze selbst sehr empfindlicher Testsysteme ab (4, 5). Solange HBeAg im Serum zirkuliert, sind auch andere serologische Parameter einer Lebererkrankung (z. B. erhöhte Transaminasen) nachweisbar. In den Fällen, in denen HBeAg über die normale Eliminationszeit im Serum persistiert - stets mit einer HBsAg- Persistenz verbunden - ist mit dem Auftreten einer chronischen aggressiven Hepatitis zu rechnen (6, 7). Aus diesem Grund ist die Verlaufskontrolle des HBeAg bei einer akuten Hepatitis-B-Virus-Infektion von wichtiger prognostischer Bedeutung (8, 9). Nach dem Beginn der Heilungsphase einer komplikationsfrei verlaufenden Hepatitis-B-Virus-Infektion ist HBeAg nicht mehr nachweisbar. Ein negativer HBeAg-Befund kann allerdings nicht nur in dieser postinfektiösen Phase, sondern auch in der Frühphase einer akuten Infektion vor der maximalen Virusreplikation erhalten werden (1, 2, 10). Anhand des Auftretens von Anti-HBe können diese beiden Phasen unterschieden werden. Die Serokonversion von HBeAg-positiv zu Anti-HBe-positiv ist ein prognostisch günstiges Zeichen bezüglich Rekonvaleszenz bzw. unkompliziertem Verlauf. Ein solcher Patient kann dennoch weiterhin HBsAg-Träger bleiben und eine chronisch-persistierende Hepatitis entwickeln (7, 11). Der positive Nachweis von Anti-HBe ohne den gleichzeitigen Nachweis von HBsAg und HBeAg weist auf eine länger zurückliegende Hepatitis-B-Virus-Infektion hin (5). Prinzip der Methode Nachweis von HBeAg Der Enzym-Immuno-Assay zum Nachweis von HBe-Antigen im Serum oder Plasma ist nach dem Sandwich-Prinzip aufgebaut. Das in der Probe vorhandene HBe-Antigen bindet sich an monoklonale Anti-HBe-Antikörper, die an der Oberfläche der Vertiefungen der Mikrotitrationsplatten fixiert sind. Nach Auswaschen werden in einer zweiten Reaktion Peroxidase-konjugierte monoklonale Anti-HBe-Antikörper an die noch freien Antigendeterminanten gebunden. Nach Entfernung von überschüssigem Konjugat durch Waschen wird die gebundene Enzymaktivität des Konjugates bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von Substrat und Chromogen (blaue Farbreaktion) wird durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen HBeAg-Konzentration proportional. Nachweis von Anti-HBe Beim Anti-HBe-Nachweis blockieren in der Probe vorhandene Anti-HBe-Antikörper das mit dem HBeAg-Reagenz, positiv zugefügte HBeAg. Im anschließend durchgeführten HBeAg-Nachweis ist bei Anti-HBe-positiven Proben kein oder wenig HBeAg nachweisbar. Die Farbintensität der Probe ist der vorhandenen Anti-HBe- Konzentration umgekehrt proportional. Nachweisgrenze des Tests Bei Verwendung des Referenz-Präparats des Paul-Ehrlich-Instituts liegt die Nachweisgrenze von Enzygnost* HBe monoclonal für HBeAg bei 1,5 U/ml und für Anti-HBe bei 1 U/ml. OQDM G11 C0541 (904) CS 11 Ausgabe Februar 2004

Reagenzien Inhalt der Handelspackung 1 x 96 (Testplatte): 1 Testplatte Anti-HBe/POD-Konjugat (monoclonal): 1 x 13 ml HBeAg-Reagenz, positiv: 1 x 13 ml Anti-HBe-Kontrolle, positiv: 1 x 1,5 ml HBe-Kontrolle, negativ: 1 x 2,5 ml Waschlösung POD (Konzentrat)**: 1 x 100 ml Puffer/Substrat TMB**: 1 x 30 ml Chromogen TMB**: 1 x 3 ml Stopplösung POD**: 1 x 100 ml Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung 1 Stück Abklebefolien 6 Stück PE-Beutel 1 Stück Barcodewertetabelle 1 Stück Packungsbeilage 1 Stück ** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell.-Nr. OUVP). Zusammensetzung (Testplatte): Mit monoklonalen Antikörpern gegen HBeAg beschichtete Mikrotitrationsplatte Anti-HBe/POD-Konjugat (monoclonal): Monoklonales Anti-HBe, Peroxidase (POD)-konjugiert Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l) HBeAg-Reagenz, positiv: gentechnologisch hergestelltes HBe-Antigen, stabilisiert mit Rinderserumalbumin und Synperonic, lyophilisiert, Extinktionsrichtwert: siehe Validierung, Konzentration: 8 ± 5 U HBeAg/ml nach Rekonstitution Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Anti-HBe-Kontrolle, positiv: Humanserum mit monoklonalen Antikörpern gegen HBe-Antigen, Extinktionsrichtwert: siehe Validierung, Konzentration: 30 ± 20 U Anti-HBe/ml Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) HBe-Kontrolle, negativ: Negatives Humanserum für den HBeAg- und Anti-HBe-Nachweis, Extinktionsrichtwerte: siehe Validierung Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige (18 g/l) Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l) Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung (25 mmol/l) Konservierungsmittel: 1-Butanol (max. 10 ml/l) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid (5 g/l) Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung 2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontroll-Sera vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden (12). 3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten. 4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden. Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen. Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen. Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen. Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Überführen des gesamten Flascheninhalts von Chromogen TMB in die Abfüllung Puffer/Substrat TMB nicht zulässig. HBeAg-Reagenz, positiv-gebrauchslösung: Vor Testbeginn eine Abfüllung HBeAg-Reagenz, positiv mit 13 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser rekonstituieren. Dabei leicht schütteln und auf vollständiges Lösen achten (ca. 30 min). OQDM G11 C0541 (904) CS 12

Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Ungeöffnet sind alle Bestandteile des -Testkits bei einer Lagertemperatur von +2 bis +8 C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar. Die Haltbarkeiten und Lagerungsbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsfertig verdünnten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen. Zusätzlich benötigte Materialien Erforderliche Geräte BEP II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte BEP III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung BEP 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung Pipetten: Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µl. Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden. Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein. Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollen maximal 3 Tage bei 2-8 C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren. Testdurchführung Testdurchführung mit BEP II (HBeAg-Nachweis) 1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1). 2. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 100 µl HBe-Kontrolle, negativ (A1 bis D1), in eine Vertiefung 100 µl HBeAg-Reagenz, positiv, in die folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 100 µl HBeAg-Reagenz, positiv dosieren. Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, das HBeAg-Reagenz, positiv zweimal zu Beginn der Testreihe aufzutragen. Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 100 µl HBe-Kontrolle, negativ, in 2 Vertiefungen je 100 µl HBeAg- Reagenz, positiv (E1 und F1), nachfolgend dann je 100 µl der zu untersuchenden Proben dosieren und mit Folie abkleben. 3. Proben-Inkubation: 60 ± 2 min bei 37 ± 1 C inkubieren. 4. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml verdünnter Waschlösung 2mal waschen (siehe Hinweis). Konjugat-Dosierung unmittelbar anschließen. 5. Konjugat-Dosierung: Je Vertiefung 100 µl Anti-HBe/POD-Konjugat einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen. 6. Konjugat-Inkubation: 60 ± 2 min bei 37 ± 1 C inkubieren, danach den Waschvorgang unmittelbar anschließen. 7. Waschen: Folie abziehen und wie unter 4. beschrieben, 4mal waschen. 8. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben. 9. Substrat-Inkubation: 30 ± 2 min bei + 18 bis +25 C lichtgeschützt inkubieren. 10.Stoppreaktion: Folie entfernen, je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 8 einhalten. 11. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert. Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen. Testdurchführung mit BEP II (Anti-HBe-Nachweis) 1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1). 2. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 25 µl HBe-Kontrolle, negativ (A1 bis D1), in eine Vertiefung 25 µl Anti-HBe-Kontrolle, positiv, in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 25 µl Anti-HBe-Kontrolle, positiv dosieren. Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die Anti-HBe-Kontrolle, positiv zweimal zu Beginn der Testreihe aufzutragen. Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 25 µl HBe-Kontrolle, negativ, in 2 Vertiefungen je 25 µl Anti-HBe- Kontrolle, positiv (E1 und F1) und anschließend je 25 µl der zu untersuchenden Proben vorlegen. OQDM G11 C0541 (904) CS 13

3. Bindung des Anti-HBe: Unmittelbar nach der Probendosierung in jede Vertiefung, in der 25 µl Probe bzw. Kontrolle vorgelegt sind, 75 µl HBeAg-Reagenz, positiv-gebrauchslösung zudosieren und mit Folie abkleben. Die nachfolgenden Arbeitsschritte analog der Testdurchführung für den HBeAg-Nachweis durchführen, d. h. die Abarbeitung mit Punkt 3. Proben-Inkubation fortsetzen. Testdurchführung mit BEP III Bei der Abarbeitung mit BEP III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 und 2 der Testduchführung BEP II ) vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit Wasserriegeln auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP III-Bedienungsanleitung). Die in der BEP III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination BEP III/Enzygnost* validiert worden. Testdurchführung mit BEP 2000 Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP 2000- Bedienungsanleitung). Testvalidierung Die Einzelmeßwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte eingesetzt, wenn gilt: HBeAg-Nachweis Anti-HBe-Nachweis -0,010 E neg 0,100 E neg 0,400 E pos 0,800-0,010 E pos 0,150 Von den Extinktionswerten der negativen Kontrollen kann ein außerhalb der Spezifikationen liegender Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte des HBeAg-Reagenz, positiv müssen beide die Spezifikation erfüllen. Von den Extinktionswerten der negativen Kontrollen kann ein außerhalb der Spezifikationen liegender Wert vernachlässigt werden. Von den Extinktionswerten der Anti-HBe-Kontrolle, positiv kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden. Werden diese Spezifikationen nicht erfüllt, ist der jeweilige Test zu wiederholen. Testauswertung Die Auswertungen erfolgen mit BEP 2000 und BEP III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten. HBe-Nachweis Anti-HBe-Nachweis Zum Extinktionsmittelwert Der Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen der negativen Kontrollen wird zur Berechnung des wird zur Berechnung des Grenzwertes ein Wert von Grenzwertes mit dem Faktor 0,050 addiert: 0,5 multipliziert: E neg + 0,050 = Grenzwert (cut off) E neg x 0,5 = Grenzwert (cut off) Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert: Testergebnis für HBeAg Testergebnis für Anti-HBe 1. E Probe < cut off - 10 % 1. E Probe > cut off + 10 % = HBeAg-negativ = Anti-HBe-negativ 2. cut off - 10 % E Probe cut off + 10 % 2. cut off - 10 % E Probe cut off + 10 % = HBeAg-grenzwertig = Anti-HBe-grenzwertig 3. E Probe > cut off + 10 % 3. E Probe < cut off - 10 % = HBeAg-positiv = Anti-HBe-positiv Zur Abklärung eines grenzwertigen Ergebnisses muß die Probe erneut, diesmal jedoch in Doppelbestimmung, getestet werden. Ist in der Wiederholungstestung der Mittelwert der Doppelbestimmung größer oder gleich dem Grenzwert bzw. kleiner als der Grenzwert, so kann das initial grenzwertige Ergebnis vernachlässigt und die Probe als reaktiv bzw. negativ betrachtet werden. OQDM G11 C0541 (904) CS 14

Einschränkungen der Testdurchführung 1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 2. Lipämische, rheumafaktorhaltige oder ikterische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung. 3. Bei hämolytischen Proben kann nicht ausgeschlossen werden, dass sie zu erhöhter Reaktivität führen. 4. Proben mit IgM-Antikörpern gegen EBV, HAV, Masern-Virus sowie ANA-haltige Proben beeinflussen das Testergebnis nicht. 5. Mit Proben von Hämophilie-Patienten wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 6. Proben von Dialyse-Patienten sowie Auto-Antikörper positive Proben können erhöhte Reaktivität zeigen. 7. Ungenügend geronnene Seren und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. 8. Hitzeinaktivierte Proben (1 h, 56 C) führen durch Denaturierung des HBe-Antigens bei der Antigen-Bestimmung zu erniedrigten Werten und können deshalb nicht verwendet werden. 9. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten. 10. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen (Ch.-B.), die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind. 11. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Ein spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden. 12. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z. B. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten. 13. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen. 14. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren. 15. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Leistungsmerkmale des Tests Sensitivität und Spezifität Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 + 4 (im Anhang) zusammengefaßt. Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden 216 HBeAg pos. Proben und 224 Anti-HBe pos. Proben in 2 unabhängigen Studien untersucht. Die mittleren Sensitivitäten stellen sich wie folgt dar: Sensitivität initial reaktiv retest reaktiv HBeAg-Version 98,1 % 99,1 % Anti-HBe-Version 97,8 % 99,1 % Bei der Ermittlung der Spezifität wurden 2502 HBeAg neg. Proben und 2406 Anti-HBe neg. Proben in 2 unabhängigen Studien untersucht. Die mittleren Spezifitäten stellen sich wie folgt dar: Spezifität initial negativ retest negativ HBeAg-Version 99,4 % 99,5 % Anti-HBe-Version 99,6 % 99,8 % Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich. OQDM G11 C0541 (904) CS 15

Reproduzierbarkeit Die Ergebnisse zur Intra-Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 5 (im Anhang) zusammengefaßt. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u. a. sind abweichende Werte möglich. * Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen Ländern. BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern. Synperonic ist eine eingetragenee Marke von ICI. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com OQDM G11 C0541 (904) CS 16

Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Material/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität Enzygnost Anti-HBe monoclonal nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen (Testplatte) im Beutel mit Trockenkapseln Anti-HBe/POD-Konjugat mcl. nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen +18 bis +25 C 2 Tage HBeAg-Reagenz, pos. n. Rekonstitut. +2 bis +8 C 4 Wochen -20 C 3 Monate Anti-HBe-Kontrolle, pos. nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen HBe-Kontrolle, negativ -20 C 3 Monate Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Chromogen-Gebrauchslösung 1 + 10 +2 bis +8 C 5 Tage +18 bis +25 C 8 Stunden geschlossenes Gefäß, lichtgeschützt Waschlösung POD(Konzentrat) unverdünnt nach Öffnen +2 bis + 8 C bis Verfallsdatum 1 : 20 +2 bis + 8 C 1 Woche 1 : 20 +18 bis +25 C 1 Tag Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum Tab. 2 Sensitivität Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden an zwei unabhängigen Zentren (K, M) folgende Daten ermittelt: Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv (M) HBeAg pos. 109 108 109 (K) HBeAg pos. 107 104 105 (M) anti-hbe pos. 96 93 95 (K) anti-hbe pos. 128 126 127 Tab. 3 Tricky Panel Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv HBeAg pos. 65 59 59 anti-hbe pos. 112 105 107 Diese Kollektive setzen sich mehrheitlich aus Proben aus dem HBeAg/Anti-HBe-Übergangsbereich zusammen. Die verringerten Werte für die Sensitivität können auf die Bildung von Immunkomplexen zurückgeführt werden. OQDM G11 C0541 (904) CS 17

Tab. 4 Spezifität Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an drei unabhängigen Zentren (K, M, L) folgende Daten ermittelt: Enzygnost* HBe monoclonal Probenkollektiv Proben- initial retest anzahl reaktiv reaktiv (M) normal neg. Seren 804 3 3 normal neg. Plasmen 396 0 0 HBeAg- (K) normal neg. Seren 528 0 0 Version (L) neg. Seren von 584 8 7 Nicht-HBV-Patienten neg. Seren von HBV-Patienten 124 5 3 kritische Seren 66 0 0 (M) normal neg. Seren 791 2 1 normal neg. Plasmen 387 1 0 Anti-HBe- (K) normal neg. Seren 521 1 1 Version (L) neg. Seren von 572 1 0 Nicht-HBV-Patienten neg. Seren von HBV-Patienten 78 4 2 kritische Seren 57 1 1 Proben mit potentiellen Störfaktoren, z. B. Autoantikörper, hämolytische und ikterische Proben. Tab. 5 Reproduzierbarkeit Bei der Untersuchung zur Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die Berechnung der Variationskoeffizienten (VK) erfolgt nach dem Varianzkomponentenmodell. HBeAg-Version Probe Extinktions- Intra-assay Inter-assay mittelwert %VK %VK F1 0,036 6,4 11,4 F2 0,102 3,8 9,3 F3 0,282 4,1 8,7 Anti-HBe-Version Probe Extinktions- Intra-assay Inter-assay mittelwert %VK %VK F1 1,421 3,6 6,3 F2 0,808 3,2 3,4 F3 0,458 7,4 4,4 OQDM G11 C0541 (904) CS 18

Tab. 6 Testdurchführung und -programmierung HBeAg-/Anti-HBe-Nachweis Testdurchführung Menüprogrammierung (BEP II, BEP III, BEP 2000) für den BEP II HBeAg Vorbereitung der Reagenzien MENU NO HBeAg Anti-HBe BEP 2000 100 µl Probe bzw. Kontrolle 25 µl BEP II 75 µl HBeAg-Reagenz, positiv BEP III teilbestückte Platten mit Wasserriegeln auf halbe 60 min ± 2 min Platten ergänzen (37 ± 1 C) 2 x Waschen: BEP II 100 µl Konjugat 60 min ± 2 min (37 ± 1 C) 4 x Waschen: BEP II automatische Testabarbeitung 100 µl Chromogen- Gebrauchslösung 30 min ± 2 min (+18 bis +25 C lichtgeschützt) Anti-HBe 100 µl Stopplösung nach maximal 1 h Auswertung 450 nm (Referenzwellenlänge: 650 nm) Testergebnis HBeAg Anti-HBe OPERATE 1 NO YES DOSIERUNG HBEAG- REAGENZ WASHINGS 0 0 ASPIRATE NO NO SOAKTIME 0 0 DISP VOL 0 075 CHANNEL NO 0 3 PHOT NO NO OPERATE 2 YES WASCHEN UND DOSIERUNG KONJUGAT WASHINGS 2 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL NO 1 PHOT NO OPERATE 3 YES WASCHEN UND DOSIERUNG CHROMOGEN WASHINGS 4 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL NO 4 PHOT NO OPERATE 4 YES DOSIERUNG STOPPLÖSUNG WASHINGS 0 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL NO 5 PHOT YES YES MEAS WL 450 450 REF WL 650 650 BLK COR NO NO EVAL MODE 1 4 GEN CUT NO NO NEG CONT 4 4 MAX NEG 0,100 --- MIN NEG 0,400 FACT NEG 0,5 MAX POS 0,150 THRESH 0,050 --- CUT OFF --- OQDM G11 C0541 (904) CS 19

Domaine d'utilisation Test immunoenzymatique pour la recherche de l antigène e et de l'anticorps anti-antigène e de l hépatite B dans le sérum ou le plasma Le test immunoenzymatique s effectue à l aide des ELISA Processors BEP II, BEP III et BEP 2000. Il a été mis au point pour l analyse d échantillons individuels et non pas d échantillons poolés. Les réactifs ne peuvent être utilisés qu à des fins de diagnostic in vitro. Intérêt diagnostique L antigène HBe et les anticorps anti-hbe correspondants sont exclusivement trouvés lors d'infections par le virus de l hépatite B. L antigène HBe indique souvent une infection aiguë, mais est également trouvé dans les hépatites chroniques (1, 2). L antigène HBe apparaît dès la phase précoce de l hépatite B. Il peut être mis en évidence juste avant ou parfois simultanément à l apparition de l AgHBs dans le sérum, révélé par un test immunoenzymatique sensible (3, 4). Le titre des deux antigènes AgHBs et AgHBe augmente rapidement pendant la phase de la multiplication virale. La concentration de l AgHBe chute cependant plus rapidement que celle de l antigène HBs -en règle générale 6 à 10 semaines après son apparition-, et se trouve alors en-dessous du seuil de mise en évidence des tests même les plus sensibles (4, 5). Tant que l AgHBe circule dans le sérum, d autres paramètres sérologiques des maladies hépatiques (par ex. les transaminases augmentées) peuvent être mis en évidence. Dans les cas où l AgHBe persiste dans le sérum au-delà du temps d élimination normal -toujours accompagné d un AgHBs persistant-, il faut s attendre à l apparition d une hépatite agressive chronique (6, 7). Ceci explique que le contrôle d évolution de l AgHBe dans une hépatite B aiguë soit important pour le pronostic (8, 9). En phase de guérison d une hépatite B d'évolution favorable, l AgHBe ne peut plus être mis en évidence. Un résultat négatif en AgHBe peut d ailleurs être trouvé non seulement dans cette phase post-infectieuse, mais également à la phase précoce d une infection aiguë avant la réplication maximale du virus (1, 2, 10). L apparition d anti-hbe permet de différencier ces deux phases. Une séroconversion d «AgHBe-positif» en «anti-hbe-positif» est de pronostic favorable pour l'évolution vers la guérison. Un tel patient peut cependant rester porteur d AgHBs et développer une hépatite chronique persistante (7, 11). La mise en évidence d anti-hbe non accompagnée d AgHBs ni d AgHBe indique une hépatite B ancienne (5). Principe de la méthode Recherche d AgHBe Le test immunoenzymatique pour la recherche de l'antigène HBe dans le sérum ou le plasma est basé sur le principe sandwich. L antigène HBe contenu dans l échantillon à tester se lie aux anticorps monoclonaux anti-hbe fixés à la surface des cupules de la plaque de microtitration. Après lavage et dans une deuxième réaction, les anticorps anti-hbe monoclonaux conjugués à la peroxydase se fixent aux déterminants antigéniques encore libres. L excès de conjugué est éliminé par lavage, puis l'activité enzymatique du conjugué fixé est mesurée. La transformation enzymatique du substrat (réaction colorée bleue) est stoppée par l addition d acide sulfurique dilué (réaction colorée jaune). L intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d antigène HBe de l échantillon. Recherche d anti-hbe Dans la recherche d anti-hbe, les anticorps anti-hbe présents dans l échantillon bloquent l AgHBe ajouté contenu dans le Réactif HBeAg positif. Dans les échantillons trouvés anti-hbe-positifs et testés ultérieurement pour une recherche d AgHBe, on ne révèle pas ou peu d AgHBe. L intensité de la coloration est inversement proportionnelle à la concentration d anti-hbe de l échantillon. Seuils de mise en évidence du test La préparation de référence de l Institut Paul-Ehrlich a donné pour le test les seuils de mise en évidence suivants : 1,5 U/ml pour l AgHBe et 1 U/ml pour l anti-hbe. OQDM G11 C0541 (904) CS 20 Edition Février 2004