ESTUDIOS DE POBLACIONES Y SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS POR CMF Dra. Mónica Saracco Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (ex CNRS)
Aplicaciones Clínicas Analisis de subpoblaciones Linfocitarias Inmunodeficiencias congénitas Inmunodeficiencias Adquiridas (HIV,farmacológica) Oncohematología: Fenotipos de leucemias y linfomas, EMR. Transplantes: Cross Match, reconstitución, inmunosupresión, Recuento de celulas progenitoras Análisis de Ciclo Celular y ploidías en tumores. Recuento de reticulocitos. Activaciones plaquetarias. Apoptosis Sorting: Separaciónes célulares
Morfología y Citometría
LINFOCITOS T CÉLULAS NK LINFOCITOS B CITOQUINAS
Ciclo de multiplicación El virus utiliza la molécula CD4 para entrar a la célula. Inserta su información genética y utiliza la maquinaria genética celular para multiplicarse y diseminar a otras células. LAS CÉLULAS SUSCEPTIBLES PERTENECEN AL SISTEMA INMUNOLÓGICO
Desrregulación Inmune Alteraciones funcionales de células CD4 Cambios en el Inmunofenotipo de células HIV infectadas. Disminución progresiva de Linfocitos T CD4+
Pruebas de laboratorio Diagnóstico: Detección de anticuerpos ELISA Y WESTERN BLOT (WB) Cuando un ELISA es positivo debe confirmarse por WB Anticuerpos CD4 2 A 6 SEMANAS Virus
Pruebas de laboratorio Paciente HIV positivo: Carga viral en sangre Recuento de linfocitos TCD4 (ambos sirven para decisiones terapéuticas) Estudios de resistencia al tratamiento CD4 Virus
Requerimientos en Laboratorios Bioseguridad para el procesamiento de muestras Contador hematológico Citómetro de flujo Equipos para lisis automática (no indispensable)
FACS Count
PIMA
FACSCanto II
FACSCalibur
BD FACSAria TM Cell Sorter : Nuevo Concepto
Recolección de las Muestras Tubos Vacutainer, con K3EDTA, 5ml de sangre Temperatura Ambiente Procesamiento dentro de las 48hs de la extracción Marcación 50 ul de sangre con 5ul MoAb, incubación 15 minutos Lisado de Glóbulos Rojos
CONCEPTO DE CUANTIFICACIÓN Medición de células presentes en el organismo normalmente, cuyo valor relativo y/o absoluto tendrá suma importancia para la toma de decisiones diagnósticas y/o terapéuticas
Metodologías Plataforma Única Puede utilizar uno o dos tubos de marcación Gate en Linfocitos o CD45 vs. SSC Utiliza Beads (10000) permite realizar el cálculo matemático de valor absoluto Plataforma Doble Puede utilizar uno o dos tubos de marcación Gate en Linfocitos o CD45 vs. SSC Siempre debe realizarse el Hemograma para poder informar los valores absolutos
Subpoblaciones Linfocitarias CMF Selección de eventos R1
LINFOCITOS T (CD3+) vs. LINFOCITOS B (CD19+)
LINFOCITOS T (CD3+) vs. CELULAS NK
Análisis de 3 colores R1
Density Dot Plot Contour Plot Los colores informan la Identificación de las frecuencia de los eventos poblaciones mediante líneas de contorno
Recomendaciones de la CDC Plataforma Única Doble Plataforma con gate en CD45 Repetición de por lo menos un MoAb Controles Internos de Calidad Controles Externos de Calidad Coherencia interna de los resultados
Porcentaje y Variabilidad en los Resultados Gate de Linfocitos Recuperación 95%, Pureza >90% (mínima 85%) La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8 variabilidad +/- 5% máximo <10% Las muestras con aumento de Linfocitos (Τγδ) presentan la mayor variabilidad La sumatoria de poblaciones B, T, NK deberá estar entre el 95%-105% (mínimo 90%-110%)
OBTENCIÓN DE BUENOS RESULTADOS CD3 menor de 50% CD3/CD4 + CD3/CD8 menor o mayor a valores de CD3 Evaluar estado de la muestra Evaluar metodología de marcación y de lisis Evaluar presencia de dobles positivas o dobles negativas Continuar estudio con CD19/ CD56+/16+
VALORES DE REFERENCIA VALORES EN ADULTOS SEXO, EDAD VALORES PEDIATRICOS desde el nacimiento a los12 años
Control de Calidad I Empleo de ensayos validados y estandarizados para obtener resultados reproducibles intra e inter-ensayo Manuales de procedimientos (GLP): procedimientos escritos para uso universal en los distintos laboratorios integrantes de la Red
CONTROLES DE CALIDAD II INTERNOS Flow-check CMF 4CL para Contador Hematológico Frecuencia: 3 veces por semana EXTERNOS Q-ASI Program (Canadiense) NE-QAS (Reino Unido) CAP (USA) GRCF (Argentina- Uruguay) Frecuencia: 4 anuales
PLATAFORMA ÚNICA Menos Tubos Encarece el estudio Mayor objetividad en la medición Menor reproducibilidad Utilización de un solo equipo
DOBLE PLATAFORMA Requiere Hemograma Mas Económico Requiere CMF Controles para ambos equipos Mayor reproducibilidad N de Tubos depende del protocolo utilizado
PROTOCOLOS DE ANÁLISIS Región Morfológica FSC vs. SSC TRI-Test CD8/CD4/CD3 Región en base a MoAb (CD45) vs, SSC CD3/CD4/CD45 CD3/CD8/CD45 Multi-Chek CD3/CD8/CD45/CD4
COMPARACIÓN DE CMF Y SOFTWARE CMF SOFT CD3 CD4 CD8 CD19 CD56 BD SP 1361 (1038-1717) 898 (662-1042) 437 (298-670) 234 (175-323) 187 (148-299) BD DP 1375 (1057-1724) 883 (654-1122) 408 (315-601) 229 (157-341) 195 (143-302) CL45 1367 (1080-1691) 894 (677-1076) 413 (307-623) 236 (164-330) 182 (154-280) CLTT 1327 (1058-1658) 837 (650-1076) 420 (312-625)
TEST ESTADÍSTICO Los valores de correlación (Rho de Spearman) entre los distintos métodos para todos los tipos celulares oscilaron entre 0.902 y 0.987
Muchas Gracias