RATAS UChA Y UChB: UN MODELO ANIMAL PARA EL ESTUDIO DEL ALCOHOLISMO (UChA and UChB rats: an animal model for the study of alcoholism)

ARTICULO ORIGINAL RATAS UChA Y UChB: UN MODELO ANIMAL PARA EL ESTUDIO DEL ALCOHOLISMO (UChA and UChB rats: an animal model for the study of alcoholism) Lutske Tampier (1, a) (1, b) y María Elena Quintanilla Resumen Abstract El abuso del alcohol y el alcoholismo generan graves problemas sociales. Estudios poblacionales han demostrado que la predisposición al alcoholismo está determinada en gran parte por factores genéticos. Debido a que es una enfermedad poligénica su tratamiento ha sido dificultoso. Debido al costo y a los problemas éticos con respecto a estudios en humanos, la mayoría de los experimentos deben realizarse en modelos de animales. Las ratas UChA (Universidad de Chile Abstemias) y UChB (Universidad de Chile Bebedoras) son uno de estos modelos desarrollados para el estudio del alcoholismo. Su selección comenzó en 1949 a partir de un grupo de ratas Wistar. Las ratas UChA llevan 93 generaciones, beben menos de 1g/kg/día, en condiciones de libre elección entre una solución de alcohol al 10% y agua. Estas ratas se caracterizan por la baja capacidad de eliminar rápidamente el acetaldehído formado a partir del metabolismo del etanol. Las ratas UChA son un buen modelo de lo que sucede con algunos individuos de raza oriental que presentan una mutación puntual en el gen que codifica la ALDH2 mitocondrial lo que genera niveles de acetaldehído circulante que son 5 20 veces más altos que los que se observan en individuos que presentan la enzima activa. Las ratas UChB llevan 83 generaciones, beben más de 4 g de alcohol /kg/día en condiciones de libre elección y se caracterizan por: presentar menor tono dopaminérgico en el nucleus accumbens; por su capacidad de desarrollar una tolerancia aguda frente a la acción de una dosis depresora de etanol y por desarrollar dependencia con el uso prolongado de alcohol. En esta revisión se demuestra que las ratas UChB cumplen con los requisitos de un modelo animal para el estudio del alcoholismo Alcohol abuse and alcoholism induce serious social problems. Population studies have shown that the predisposition to alcoholism is determined largely by genetic factors. Due to that It is a polygenic disease treatment has been difficult. Given the cost and ethical problems involved with studies in humans, most experiments should be carried in animal models of alcoholism. UChA (University of Chile Abstainer) and UChB (University of Chile Bebedora=drinker) rats developed at the University of Chile are one of these animal models to study alcohol problems. Its selection began in 1949 from a colony of Wistar rats. UChA rats, now generation 93, which drink less than 1g/kg/day of ethanol under a free choice condition between 10% ethanol solution and water, are characterized by the low capacity to quickly eliminate acetaldehyde formed during ethanol metabolism. UChA rats would be an animal analogue of some Eastern race individuals that have a point mutation in the gene that encodes the mitochondrial aldehyde dehidrogenase that generates levels of circulating acetaldehyde that are 5 20 times higher than that seen in individuals who have the active enzyme. On the other hand, UChB rats, now generation 83, drink more than 4g/kg/day under a free choice condition. They are characterized by a lower dopaminergic tone in nucleus accumbens, also by its ability to develop acute tolerance to the depressant effect of ethanol and for their capacity to develop dependence after a prolonged use of alcohol. The revision shows that UChB rats are a good animal model for the study of alcoholism. Palabras claves (Keywords), Ratas UChA y UChB, Consumo de alcohol, Deshidrogenasa aldehídica, Tolerancia aguda, Dependencia a alcohol. Correspondencia a: Lutske Tampier: Programa de Farmacología Molecular y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM). Facultad de Medicina. Universidad de Chile. FAX 56 2 7372783, Casilla 70.000. Santiago 7, Chile, e mail: ltampier@med.uchile.cl 1 Programa de Farmacología Molecular y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM). Facultad de Medicina. Universidad de Chile. a Químico Farmacéutico, Profesora Asociada; b Tecnólogo Médico, Magíster en Ciencias Biológicas, Profesora Asociada. Introducción Factores genéticos y alcoholismo: El abuso del alcohol y el alcoholismo generan graves problemas sociales. Actualmente constituyen la cuarta y quinta causa de mortalidad en Chile, a pesar de que se han realizado grandes esfuerzos para prevenir y tratar a aquellos individuos con alto riesgo 1. Estudios poblacionales acerca del abuso del alcohol han demostrado que la predisposición al alcoholismo está determinada en gran parte por factores genéticos, con 2 5 una heredabilidad de 50 60% existiendo genes protectores y genes permisivos. Entre los genes protectores están aquellas mutaciones detectadas en genes que codifican las dos principales enzimas que metabolizan el alcohol en el hígado, la deshidrogenasa alcohólica (ADH) y la deshidrogenasa aldehídica (ALDH). Etanol Acetaldehído Acetato ADH ALDH Distintas poblaciones raciales presentan una mutación inactivante de la enzima ALDH2 dando origen a la isoforma Rev. Farmacol. Chile (2010) 3(1): 5

ALDH2*2 y mutaciones activante de la ADH dando origen a la isoforma ADH1B*2, las cuales han mostrado consistentemente tener efecto protector contra el alcoholismo 6 8. Al consumir alcohol, los individuos portadores de estas mutaciones desarrollan niveles elevados de acetaldehído circulante que se han asociado a reacciones de intolerancia al alcohol, reacción flushing 9. En relación a factores genéticos permisivos, estudios poblacionales en sujetos con historia familiar de alcoholismo han sugerido una relación entre una baja respuesta inicial del individuo frente al alcohol, o tolerancia aguda a los efectos conductuales y el riesgo de desarrollar posteriormente alcoholismo 10,11. Debido al costo y a las limitaciones inherentes, especialmente problemas éticos con respecto a estudios en humanos, la mayoría de los experimentos deben realizarse en modelos animales. Por lo tanto es importante la obtención de modelos animales que presenten alta o baja preferencia por alcohol cuando se les da a elegir entre agua y una solución de alcohol. En general las ratas y ratones son muy heterogéneos con respecto a su consumo voluntario de alcohol y no suelen beber grandes cantidades de alcohol si ellos no reciben previamente un tratamiento especial, por ejemplo alcohol con sucrosa o sacarina, por las cuales los roedores sienten gran avidez, o bien ofreciendo solo una solución de alcohol al 5, 7, 10 o 15% v/v, como única fuente de bebida, por dos a tres semanas. La forma más natural es la obtenida mediante endogamia entre ratas que prefieren o no prefieren el alcohol durante varias generaciones. Así se han obtenido importantes modelos de animales para el estudio de como se desarrolla el alcoholismo y a la vez buscar estrategias con el fin de controlar, tratar o manejar el alcoholismo. Las ratas UChA (Universidad de Chile Abstemias) y UChB (Universidad de Chile Bebedoras) son uno de estos modelos desarrollados para el estudio del alcoholismo. Su selección comenzó en 1949 cuando el Profesor Dr. Jorge Mardones Restat (1908 1998) durante el curso de experimentos que realizaba sobre la influencia de condiciones nutricionales en el apetito de alcohol observó que las ratas Wistar presentaban una gran variabilidad en el consumo espontáneo de una solución de alcohol al 10 %. Algunas ratas bebían espontáneamente altas cantidades de alcohol, en cambio otras bebían solamente agua. En ese momento a Mardones se le ocurrió estudiar si esta gran variabilidad individual de la rata pudiera ser de origen genético y cruzó una rata hembra de alto consumo (bebía 5.8 g alcohol por kilo peso corporal al día) con una rata macho de alto consumo (bebía 3.4 g alcohol/kg peso/día) y así constató la tendencia de los hijos a beber más alcohol que la población general 12,13. La posterior cruza entre los descendientes de las ratas bebedoras y por otro lado la cruza entre los descendientes de las ratas abstemias por siete generaciones, llevó definitivamente a la evidencia de la existencia de una transmisión genética en la preferencia por el alcohol. Así el factor de herencia calculado a partir de la distribución de frecuencia del consumo de alcohol en 347 descendientes de la generación 1 a 7 mostró por primera vez que la apetencia o la capacidad de consumir cantidades altas de alcohol se heredaba 14. Para el estudio de consumo voluntario de etanol, las ratas se colocan a los 2 a 3 meses de edad en jaulas individuales y se les ofrece la posibilidad de elegir libremente entre una solución de alcohol al 10%(v/v), agua y alimento las 24 horas del día. El consumo diario de alcohol de cada rata se calcula promediando el consumo de los últimos 20 30 días, lo que se expresa en gramos alcohol puro consumido por kilo de peso por día. El consumo de agua se expresa en mililitro por kilo de peso por día. La Figura Nº1 muestra la representación gráfica de la distribución de consumo voluntario de alcohol en la colonia de ratas UChA generación F 90 91 y UChB generación F 82 83 durante el año 2009. La distribución mostró una clara segregación entre ambas líneas, lo que sugiere la existencia de genes responsables por el apetito (reforzador) y genes responsables por el rechazo (aversión) al alcohol. Figura 1. Distribución del consumo voluntario de alcohol en la población de ratas UChA (n=32) y de ratas UChB (n=58) que estaban en libre elección entre etanol 10%(v/v) y agua en el año 2009. A partir de las observaciones pioneras de Mardones y cols 14 se han desarrollado otras líneas de ratas que han sido seleccionadas por su preferencia o rechazo a consumir alcohol. Hoy en día existen cinco líneas bien determinadas de ratas que han sido seleccionadas por endogamia por su diferente consumo voluntario de alcohol. Estas son las líneas de ratas AA bebedoras (Alko Alcohol) versus ANA (Alko Non Alcohol) desarrolladas en Helsinki, Finlandia 15 ; las ratas P (Preferring alcohol) versus NP (Non Preferring alcohol) y las ratas HAD (High Alcohol Drinker) versus LAD (Low Alcohol Drinker) desarrolladas en Indianápolisis, USA 16 y las ratas sp (sardinian Preferring alcohol) versus Rev. Farmacol. Chile (2010) 3(1): 6

snp (sardinian Non Preferring alcohol) desarrolladas en Sardinia, Italia 17. Metabolismo del alcohol en ratas UChA y UChB: El alcohol es uno de los pocos fármacos que se eliminan siguiendo una cinética de orden cero, debido a que el alcohol satura el sistema de la ADH, siendo su velocidad de eliminación una constante. La Figura Nº 2 muestra que después de la administración intraperitoneal de una dosis de alcohol (1 g/kg) las ratas de ambas lineas presentan igual velocidad de eliminación del alcohol siendo esta de 330 ± 18 y 334 ± 20 mg etanol por kg peso /hora en UChA y UChB, respectivamente. La capacidad diaria de eliminación es de alrededor de 8 g por kilo peso por día, que es equivalente a la cantidad de alcohol que beben las ratas UChB. Por lo tanto el menor consumo de alcohol de las ratas UChA no se debería a una menor capacidad de metabolizar el etanol. Estudios in vitro no mostraron diferencias significativas en la actividad de la enzima ADH, entre ambas líneas 18, lo que se corrobora en que no se observan diferencias entre ambas líneas de ratas en la evolución de su nivel de alcohol a través del tiempo. Por el contrario hay una diferencia significativa en la evolución del nivel sanguíneo del acetaldehído obtenido durante la oxidación del alcohol. Las ratas UChA presentan a los 5 minutos de la administración de etanol una marcada alza en los niveles de acetaldehído que fue de 3 a 4 veces mayor a la que presentan las ratas UChB 18. Esta alza de las acetaldehidemias se debería a que las ratas UChA poseen una mutación en la ALDH2, un alelo Aldh2 2 ineficiente, mientras que los animales UChB poseen una forma Aldh2 1 eficiente 19,20. Esta diferencia entre las enzimas codificadas por un alelo Aldh2 2 ineficiente y el alelo Aldh2 1 eficiente explicaría en gran parte la diferencia en el consumo de alcohol. Las isoenzimas ALDH2 resultantes se diferencian en su afinidad (Km) por el cofactor NAD + y en su velocidad máxima (Vmáx) para la remoción del acetaldehído durante el metabolismo del alcohol. Esta mutación segrega con el fenotipo de la rata. Características de las ratas UChA: Las ratas UChA no beben alcohol debido a la baja capacidad de eliminar rápidamente el acetaldehído formado durante el metabolismo del etanol. Las ratas UChA serían un modelo de lo que sucede con algunos individuos de raza oriental que presentan una mutación puntual dominante negativa (Glu487Lys) en el gen que codifica la ALDH2 mitocondrial. Los individuos con uno o dos alelos de la ALDH2 mutada presentan niveles de acetaldehído circulante que son 5 20 veces más altos que los que se observan en individuos que presentan la enzima activa 21,22. Estos individuos presentan una intolerancia al etanol caracterizada por una marcada vasodilatación cutanea ( flushing ), taquicardia, náuseas, vómitos, dolor de cabeza y disforia generalizada, por un mecanismo aún desconocido. En este principio se basa el uso del disulfiram (Antabus ) en el tratamiento del alcoholismo 23. Se ha observado que un inhibidor de la actividad de la ADH y por consiguiente de la oxidación hepática del etanol a acetaldehído, como es el 4 metilpirazol, reduce los síntomas de intolerancia al etanol en humanos ALDH2 deficientes 9. Esta observación se confirmó en un experimento realizado en ratas UChA (Figura Nº3) sometidas a consumir solamente una solución de etanol al 10% como única fuente bebida por dos meses. Cuando estas ratas se cambiaron al régimen de libre elección entre 10% alcohol y agua, ellas dejaron de beber alcohol. Sin embargo, si son pretratadas con pirazol, un inhibidor de la ADH 24 el cual reduce los niveles de acetaldehído proveniente del metabolismo hepático del etanol, a valores prácticamente indetectables (< 5 µm), las ratas siguen consumiendo ahora en forma voluntaria alrededor de 4 a 5 g/kg/día. En conclusión, el acetaldehído es un metabolito altamente aversivo para la rata UChA que controla el consumo de alcohol. Figura 2. Alcoholemias (mg etanol/dl de sangre) y acetaldehidemias (µm) obtenidas a través del tiempo, en ratas UChA y UChB al administrarles una dosis de alcohol de 1 g/kg IP. * Diferencia significativa entre ambas líneas de ratas ( t de Student, p < 0.001) Características de las ratas UChB: Las ratas UChB beben voluntariamente altas cantidades de alcohol al 10%. En general las ratas heterogéneas que no han sido seleccionadas por su preferencia por alcohol, no Rev. Farmacol. Chile (2010) 3(1): 7

toman voluntariamente etanol en concentraciones mayores a 5 7 %. La Figura Nº 4 muestra que al colocar ratas UChB en condición libre elección frente a una solución de etanol al 10% v/v y agua, ellas presentan un consumo inicial de alrededor de 4 g alcohol /kg peso/día (iniciación) y van aumentando gradualmente su consumo llegando a un plateau de 6 8 g/kg/día alrededor de los 21 días. Alrededor de los dos a tres meses de consumo continuo las ratas pueden presentar un consumo no controlado (dependencia). Respecto al patrón de consumo circadiano, las ratas UChB beben altas cantidades de alcohol en cortos periodos, especialmente durante la noche, llegando a presentar alcoholemias en promedio entre 50 a 100 mg%. Estas alcoholemias en el hombre producen efectos farmacológicos caracterizados por desinhibición, euforia, alteraciones sensoriales, lo cual indica en medicina forense que el individuo está bajo los efectos del alcohol. Se ha propuesto que la cantidad de alcohol consumido voluntariamente por la rata esta sustentado por la búsqueda de un efecto farmacológico de agrado (reward) y limitado por el efecto aversivo que produce dosis más altas 25. Estudios efectuados en ratas UChA y UChB usando la técnica de la microdialisis cerebral que permite evaluar in vivo los niveles de DA en diferentes zonas, mostró en primera instancia, que las ratas UChB presentan en forma innata un menor tono basal dopaminérgico en el NAC que las ratas UChA 30 y que, por otra parte, la administración intraperitoneal de una dosis de etanol de 1g/kg, produjo una mayor liberación de DA en el NAC de ratas UChB que en el de ratas UChA. Ambos resultados sugieren que las ratas UChB beberían más alcohol con el fín de compensar su bajo nivel de DA 31. Este menor tono dopaminérgico y esta mayor liberación de DA en NAC es compartida con las ratas de Indiana, USA, que prefieren (P) o no prefierenalcohol (NP) 32 34. De tal forma se ha postulado que un menor tono dopaminérgico mesolimbico y una mayor respuesta a una dosis de alcohol sería un factor neuroquímico importante asociado a la conducta bebedora de la rata. Este aumento de liberación de DA provocado por el uso crónico de etanol va provocando una neuroadaptación de este sistema que lleva a una sensibilización de estas neuronas frente al efecto del alcohol, lo que finalmente hace que el consumo pase de controlado a no controlado 26. Figura 3. Efecto del pirazol (10 mg/kg IP, por 3 días consecutivos), un inhibidor de la alcohol deshidrogenada, sobre el consumo voluntario de alcohol en ratas UChA que han sido pre expuestas a consumo forzado de alcohol (etanol 10% como única bebida, por 2 meses). La mayoría de las sustancias que llevan a abuso estimulan la liberación de dopamina (DA) en regiones limbicas lo que provoca agrado o placer. Las sustancias de abuso activan el sistema de la recompensa brain reward system. Esta vía parte de células del área tegmental ventral (VTA) y se proyecta hacia el núcleo accumbens (NAC) y la corteza prefrontal. El alcohol estimula la liberación de dopamina en esas zonas, lo cual se asocia a efectos estimulantes, euforizantes y sería en parte la responsable de su autoadministración 26,27. En efecto se ha observado que la administración sistémica de etanol produce un aumento dosis dependiente de los niveles extracelulares de DA en NAC 28,29. Figura 4. Consumo voluntario de alcohol en ratas UChA y UChB que se encuentran en libre elección entre alcohol 10%(v/v) y agua (ratas UChA F82 83, UChB F75 76, año 2006). Un segundo factor que esta relacionado con el aumento de consumo de alcohol es la capacidad de la rata UChB de desarrollar tolerancia aguda a una dosis de etanol. Se define tolerancia aguda la que se desarrolla en minutos frente al efecto de una dosis de etanol. La administración de una dosis de etanol (2.3 g/kg i.p) induce en la rata una perdida de su función motora de la cual la rata se recupera antes de decaer las alcoholemias 35, es una tolerancia de tipo funcional. La Figura Nº 5 muestra que esta capacidad de la rata de desarrollar tolerancia aguda al efecto depresor motor del alcohol esta relacionada directamente con la cantidad de alcohol que ingiere la rata Rev. Farmacol. Chile (2010) 3(1): 8

voluntariamente. Mayor tolerancia aguda, mayor el consumo. Sin embargo no está claro como la tolerancia aguda se relaciona con las propiedades reforzadoras del alcohol. Los humanos también han mostrado presentar tolerancia aguda a varios efectos del etanol tanto cognitivos como de incoordinación motora 10,11. Estudios en hijos de alcohólicos ha mostrado que la sensibilidad a una dosis aguda de etanol es un buen predictor de la magnitud del futuro uso de alcohol. de dependencia como se describe a continuación. La Figura Nº6 muestra que (i) estas ratas presentan un aumento temporal del consumo post deprivación y ii) beben alcohol en concentraciones más altas. En este experimento se les ofreció a las ratas UChB un régimen de libre elección tres probetas (alcohol 10%; alcohol 20% y agua) durante dos meses (basal). Luego las probetas con alcohol se retiran por 7 días consecutivos y al octavo día se les reincorpora nuevamente las dos probetas con alcohol. Las ratas frente a la reinstalación de ambas probetas después del periodo de privación aumentan significativamente el consumo de alcohol, principalmente aumentan el consumo de alcohol más concentrado. Por otra parte, las ratas UChB que han estado menos de dos meses en libre elección reducen el consumo de alcohol frente a una tercera probeta conteniendo una solución de sacarina al 0.2%, la que es altamente apetecible por la rata. Las ratas bajan el consumo de alcohol debido a que la solución de sacarina es más reforzadora y menos aversiva para ellas. Sin embargo, si esta misma solución se ofrece a ratas UChB que han estado tres meses en libre elección (dependencia) ellas, iii) no bajan el consumo de alcohol y además beben altas cantidades de solución de sacarina, llegando a aumentar la ingesta de líquido total a más de tres veces el valor normal 38. Figura 5. Relación entre la tolerancia funcional aguda desarrollada al efecto depresor motor inducido por una dosis de alcohol (2.3 g/kg i.p.) y el consumo voluntario de alcohol en ratas UChB. A mayor tolerancia aguda, mayor el consumo (correlación r = 0.70, p< 0.001). La tolerancia se midió mediante el plano inclinado, evaluando el % dn la disminución de la fuerza que opone la rata a la caída, al inclinarse el plano, entre los 15 y 30 minutos de la administración del alcohol (Tampier y Mardones, 1999). Las ratas UChB después de un periodo de mantención en que presentan un consumo controlado, pueden pasar a una etapa de consumo no controlado (dependencia o adicción) que se desarrolla después de un tiempo variable en que la rata ha presentado consumo excesivo de alcohol. Validar un modelo de dependencia es difícil en animales de laboratorio, pero se han establecido cuatro criterios para aceptar que existe dependencia 36,37 según los cuales los animales: i) deben presentar un aumento temporal del consumo de etanol y de la relación etanol/líquido total, cuando el alcohol es reinstalado después de un periodo de privación. Este aumento temporal de consumo reflejaría las ansias o avidez por el alcohol lo que contribuye al problema de la recaída, ii) deben beber voluntariamente alcohol en concentraciones mayores a las habituales ej. soluciones al 20%, al 30%, iii) no deben reducir su consumo de etanol frente a la presentación simultanea de otras sustancias por las cuales sienten gran atracción como son las soluciones de sucrosa y de sacarina, iv) deben beber alcohol a pesar de la presencia de los efectos aversivos que pueden acompañar la bebida. Las ratas UChB que han estado 2 a 3 meses en libre elección cumplen con los requisitos de un modelo animal Figura 6. Aumento del consumo voluntario de alcohol, en especial de alcohol al 20% (ADE), en ratas UChB dependientes y deprivadas de alcohol por 7 días. Por último ratas UChB que presentan dependencia iv) beben alcohol a pesar de alzas en los niveles de acetaldehído periférico por acción del disulfiram o la cianamida. En los primeros 7 días de consumo voluntario la administración de una dosis de disulfiram o cianamida que aumentan los niveles de acetaldehído periférico después de beber alcohol provoca efectos aversivos en la rata UChB y ellas dejan de beber. En cambio si se administra la dosis de disulfiram o cianamida a ratas en etapa de consumo no controlado, las ratas no disminuyen su consumo de alcohol 39 a pesar de producir acetaldehidemias elevadas. Rev. Farmacol. Chile (2010) 3(1): 9

Se crea tolerancia al efecto del disulfiram y de la cianamida. Conclusión Las ratas UChB cumplen con los requisitos de un modelo animal para el estudio del alcoholismo. Agradecimientos: Se agradece al Sr. Juan Santibáñez S. su invaluable trabajo en el cuidado y mantención de estas líneas de ratas bebedoras y no bebedoras, por más de 30 años. Referencias: 1. CONACE. Resultado del sexto estudio nacional de drogas en población general de Chile. Consumo de alcohol y accidentes. Gobierno de Chile. 2004. 2. Kendler KS, Neale MC, Heath AC, Kessler RC, Eaves LJ. A twinfamily study of alcoholism in women. Am J Psychiatry. 1994; 151: 707 715. 3. Heath AC, Bucholz KK, Madden PA, Dinwiddie SH, Slutske WS, Beirut LJ, et al Genetic and environmental contributions to alcohol dependence risk in a national twin sample: consistency of findings in women and men. Phychol Med. 1997; 27: 1381 1396. 4. Prescott CA, Kendler KS. 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