LANZADERAS, CADENA RESPIRATORIA Y FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Dra. Carmen Peláez Pinelo Bioquímica para 2º año Medicina - CUNOR, 2012
Generalidades Oxidación de combustibles metabólicos es esencial para la vida CO 2 y H 2 O Reacciones redox en mitocondrias 40% de energía de alimentos se conserva en forma de ATP y 60% se libera en forma de calor Metabolismo basal es suma de reacciones exotérmicas del organismo Hombre adulto tiene MB de 1800kcal/día Mujer adulta tiene MB de 1300kcal/día Porción mayor de MB: calor procedente de mitocondrias
Oxidación de combustibles se divide en 2 estadios: a. Producción de coenzimas de nucleótido reducidas durante oxidación b. Síntesis de ATP a partir de energía libre proporcionada por oxidación de coenzimas reducidas Electrones pasan a cadena transportadora de electrones mitocondrial: sistema de transportadores conectados
Los sistemas vivos transfieren energía de una molécula a otra sin perderla toda en forma de calor Adenina (base púrica) + Ribosa (azúcar de 5C) + grupos fosfato (α,, ) Parte de la energía se conserva en forma química para impulsar las reacciones de biosíntesis no espontáneas Casi la mitad de energía obtenida en oxidación de combustibles metabólicos es canalizada hacia síntesis de ATP Principal transductor de energía de sistemas vivos Dos enlaces anhídrido de alta energía (al romperse producen ADP o AMP)
Energía libre de enlace de alta energía se usa para impulsar o favorecer avance de reacciones Casi todas las vías de biosíntesis son termodinámicamente desfavorables se convierten en favorables acoplando reacciones de hidrólisis de compuestos de alta energía Esto es posible a causa de alta energía libre o potencial de transferencia de grupo del ATP Tema o Motif (centro activo de una cinasa) usa ATP para impulsar reacciones de biosíntesis, procesos de transporte o actividad muscular frecuente en metabolismo
Principales coenzimas de oxidación-reducción que participan en transducción de energía desde combustibles al ATP NAD, FAD, FMN Se transfieren los electrones de CHO y grasas a estas coenzimas durante metabolismo de energía y pasan a sus formas reducidas NADH, FADH 2, FMNH2 Se transfieren 2 electrones pero número de protones transferido es variable NAD acepta un ión hidruro (H-) 1 protón y 2 electrones protón restante se libera FAD y FMN 2 electrones y 2 protones
Acontecimientos durante transporte de electrones NADH Y FADH 2 por transferencia de sus electrones a otras sustancias, se reoxidan a NAD y FAD para poder participar en reacciones de oxidación a sustratos adicionales Los electrones transferidos participan en oxidaciónreducción secuencias de numerosos centros rédox en 4 complejos enzimáticos antes de reducir O 2 a H 2 O Los protones son expulsados de mitocondria lo que produce un gradiente a través de membrana mitocondrial energía libre almacenada en este gradiente electroquímico conduce a la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi mediante fosforilación oxidativa
Mitocondrias Organelas subcelulares esenciales para metabolismo aerobio Principal función: oxidación de combustibles metabólicos y conservación de energía libre x síntesis de ATP Sistema de doble membrana Externa: enzimas y proteínas de transporte Porina permeable a iones, moléculas pequeñas, proteínas <10,000D Espacio intermembrana es equivalente a citosol en concentraciones de metabolitos e iones
Proteínas grandes transportadas por: TOM (translocasa de membrana mitocondrial externa) TIM (translocasa de membrana mitocondrial interna) Vital para célula porque proteínas mitocondriales son codificadas en núcleo y luego transportadas a mitocondria Genoma mitocondrial (ADNmt) codifica 13 subunidades vitales de bombas de protones y ATPsintasa Membrana mitocondrial interna (MIM) Crestas, impermeable a mayor parte de iones y moléculas pequeñas (NADH, ATP, coenzimas, fosfato, protones) Necesita proteínas transportadoras Contiene componentes de fosforilación oxidativa
LANZADERAS DE ELECTRONES Efectúan transferencia de electrones de NADH a mitocondrias En lugar de efectuar transferencia física de NADH que se produjo por metabolismo de CHO en citosol y que no puede atravesar MIM Dos lanzaderas redox que están accionadas por isoformas citoplasmáticas y mitocondriales de misma enzima Lanzadera de glicerofosfato Lanzadera de malato-aspartato
A. Glicerol-3-Fosfato 2 moles ATP Transfiere electrones de NADH desde citoplasma a mitocondria reduciendo FAD a FADH 2 Glicerol-3-P deshidrogenasa cataliza reducción de DHAP con NADH para formar glicerol-3-p y NAD Glicerol-3-P procedente de citoplasma es oxidado a DHAP por otra isoforma de glicerol- 3-P deshidrogenasa de MIM y FAD se reduce a FADH 2 Electrones son transferidos a vía común por ubiquinona
B. Lanzadera Malato- Aspartato 3 moles ATP Malato es capaz de atravesar MIM pero ésta es impermeable a producto (OAA) Intercambio se consigue por interconversión entre aminóacidos α-ceto y α- amino con participación de glutamato y α-cetoglutarato citoplásmatico y mitocondrial + isoenzimas de glutamato-oxalacetatotransaminasa (AST)
Translocasa ATP-ADP Mayoría de ATP generado en matriz mitocondrial por fosforilación oxidativa se usa en citosol Translocasa transporta ATP fuera de matriz en intercambio por ADP producido en citosol por hidrólisis del ATP Importa un ADP x un ATP que exporta Salida de carga negativa cotransporte bidireccional electrogénico
Transporte de fosfatos ATP se sintetiza a partir de ADP + Pi en mitocondria pero se usa en citosol Pi vuelve a mitocondria por transportador de fosfato Cotransporte unidireccional Pi - H
Fosforilación Oxidativa Energía libre de oxidación de NADH se usa en sistema de transporte de electrones para bombear protones hacia espacio intermembrana Energía producida cuando protones vuelven a entrar en matriz mitocondrial se usa para sintetizar ATP
Sistema Mitocondrial de Transporte de Electrones Conocido como cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria Localizado en membrana mitocondrial interna Formado por varios complejos de proteínas grandes y 2 pequeños componentes independientes: ubiquinona y citocromo c
Cada paso implica una reacción tipo redox Electrones dejan componentes que tienen potenciales de reducción más negativos y van a componentes con potenciales de reducción más positivos Electrones son conducidos por sistema en secuencia definida desde coenzimas de nucleótidos reducidas hasta oxígeno Cambios de energía libre impulsan transporte de protones desde matriz hasta espacio intermembrana 3 bombas de protones Después de cada paso electrones se encuentran en estado de energía más bajo
Electrones son canalizados hacia cadena de transportadora por flavoproteínas Cuatro clases: complejo I (FMN) y 3 con FAD Estas vías reducen ubiquinona (Q o coenzima Q 10 ) localizada al inicio de vía de transporte común (Q + complejo III + citocromo c + complejo IV) Flavoproteína reducida + Q Flavoproteína oxidada + QH2
Protones son bombeados desde matriz hasta espacio intermembrana por complejos I, III y IV Al final de cadena aceptor final de electrones es O2 reducido por transferencia de 4 electrones desde complejo IV forma 2 moléculas de H2O Se reduce 1 átomo de oxígeno x cada 2 electrones ADP Pi ½ O 2 2H+ 2ē ATP H 2 0
Por cada par de electrones transportado x complejos I, III ó IV cada complejo bombea # suficiente de protones para síntesis de un molde de ATP NADH sintetiza 3 moles de ATP FADH2 produce 2 moles de ATP no se usa la capacidad de bombeo de protones de complejo I
Complejo I o NADH-Q-reductasa o NADH deshidrogenasa Pasa electrones desde NADH hasta Q Flavoproteína que contiene FMN FAD y FMN contienen riboflavina Oxida NADH mitocondrial A través de FMN y complejos Fe-S (grupos prostéticos) transfiere electrones a ubiquinona consigue suficiente energía para bombear 4 protones desde matriz NADH + Q + 5H + (matriz) NAD + QH 2 + 4H + (espacio intermembrana)
Otras 3 flavoproteínas transfieren electrones (por FADH2) desde sustratos oxidables a ubiquinona (Q) Succinato-Q-reductasa (complejo II o succinatodeshidrogenasa del ciclo ATC) oxida succinato a fumarato y reduce FAD a FADH 2 Glicerol-3-fosfato-Q-reductasa (parte de lanzadera glicerol-3-p) oxida G3P citoplasmático a DHAP y reduce FAD a FADH 2 Acilgrasa-CoA-deshidrogenasa cataliza primer paso de oxidación mitocondrial de ácidos grasos y produce FADH 2
Ubiquinona o coenzima Q 10 Compuesto liposoluble en MIM (animales) Difunde hacia membrana interna y acepta electrones de 4 flavoproteínas mitocondriales los transfiere a complejo III Puede transportar 1 ó 2 electrones Fuente importante de radicales superóxido de célula
Complejo II o Succinato-coenzima Q oxidorreductasa Contiene enzima del ciclo ATC: succinato deshidrogenasa Traslada electrones desde succinato hasta CoQ Sus grupos redox comprenden: FAD (unido a succinato deshidrogenasa), grupo 4Fe-4S, grupo 3Fe-4S, grupo 2 Fe-2S y citocromo b 560 No sintetiza ATP sólo transferencia de electrones hacia CoQ desde sustratos reducidos (NADH o succinato)
Complejo III citocromo c-reductasa o ubiquinonacitocromo c reductasa o QH2-citocromo c reductasa Oxida ubiquinona y reduce citocromo c Ubiquinona reducida canaliza electrones que recoge en flavoproteínas mitocondriales transfiere a complejo III Electrones de Q son transferidos a través de 2 clases de citocromo b al citocromo c1 y citocromo c Transporte de 2 electrones a citocromo c proporciona suficiente variación de energía y bombeo de protones para sintetizar cerca de 1 mol de ATP Se bombean 4 protones (2 matriz y 2 QH2) QH 2 2 cyt c (oxidado) 2H (matriz) 2Q 2 cyt c reducido 4 H (espacio intermem brana)
Citocromo c Proteína pequeña con grupo hemo unida a superficie externa de MIM Transporta electrones del complejo III al IV Transporta 1 electrón reducción de O2 a 2 H2O por complejo IV requiere 4 moléculas de citocromo c reducidas Unión de citocromo c a complejos III y IV es electrostática (relacionada con Lys) Reducción de ferricitocromo c (Fe 3+ ) a ferrocitocromo c (Fe 2+ ) por citocromo c 1 modifica estructura tridimensional de proteína favorece transferencia de electrones a citocromo a de complejo IV
Complejo IV o citocromo c-oxidasa o citocromo-oxidasa Dímero en MIM Oxida citocromo c móvil y transporta electrones a través de citocromos a y a3 Reduce oxígeno a agua en reacción de transferencia de 4 electrones Bombea protones hacia exterior de mitocondrias Sintetiza 1 mol de ATP por cada par de electrones transferidos a oxígeno
Número real de protones bombeados: 4 Se necesitan otros 4 para reducir O2 a agua Reacción global: 4 cyt c (reducido) 4H (matriz) O2 4 cyt c (oxidado) 2 H2O Cobre es componente común Moléculas venenosas pequeñas (azida, cianuro, CO) se fijan al grupo hemo de citocromo a3 en citocromo c-oxidasa e inhiben complejo IV
GRADIENTE DE PROTONES Y SÍNTESIS DE ATP Hipótesis quimiosmótica Las mitocondrias producen ATP usando la energía libre procedente del gradiente de protones (fuerza motriz de protones) Fuerza motriz de protones resultado de gradiente de ph (gradiente de concentración) y de un desequilibrio de carga (gradiente electroquímico) en la MIM Para funcionar requiere sistema de MIM que sea impermeable a protones Cuando protones son bombeados fuera de matriz espacio intermembrana se convierte en más ácido y con mayor carga positiva que matriz (básica y carga negativa)
Energía libre del transporte electrónico se conserva por un bombeo de H + desde matriz mitocondrial hasta espacio intermembrana para crear un gradiente de H + electroquímico a través de la MIM. El potencial electroquímico de este gradiente sirve para sintetizar ATP La fosforilación oxidativa requiere una membrana mitocondrial interna intacta MIM impermeable a iones como H, OH, K, Cl Transporte electrónico genera transporte H fuera de mitocondrias intactas y crea gradiente electroquímico Compuestos que aumentan permeabilidad de MIM disipan gradiente electroquímico, permiten transporte electrónico continuar pero inhiben síntesis de ATP (desacoplan transporte oxidativo)
Complejo V o ATP-sintasa o F 0 F 1 -ATP sintasa Se encuentra revistiendo la cara matricial interna de MIM Conocida como ATPasa hidroliza ATP Formada por 2 complejos Componente de la MI: F 0 motor impulsado por protones y con estoiquiometría de a, b 2 y c 10-14 Subunidades c formar anillo c que rota en sentido horario en respuesta al flujo de protones por el complejo Subunidades y están unidas al anillo c y giran con él inducen aparición de grandes cambios de conformación en los 3 dímeros α 2 proteínas b inmovilizan el segundo complejo (F 1 -ATP sintasa)
F1 tiene estoiquiometría de α 3, 3,,, Parte principal formada por 3 dímeros α dispuestos como gajos de naranja actividad catalítica localizada en subunidades Cada rotación 120 de subunidad induce aparición de cambios de conformación en subunidades α los centros de fijación de los nucleótidos van alternando entre 3 estados 1. Se fija ADP y Pi 2. Sintetiza ATP 3. Libera ATP En cada vuelta: producen 3 ATP Mecanismo de cambio de la fijación
La energía libre motriz de protones usada por ATPsintasa no se emplea para sintetizar ATP sino para liberarlo Cuando el gradiente de protones es demasiado lento para favorecer la liberación de ATP ATP permanece fijado a ATP-sintasa y se interrumpe la síntesis de ATP ADP y Pi se unen al complejo tan pronto como sale ATP Para sintetizar cada ATP se requieren 3 protones Catálisis rotatoria: motor impulsado por protones Actúa en forma independiente respecto a cadena de transporte de electrones
F1 tiene 3 protómeros α químicamente idénticos pero distintos en conformación Cada protómero tiene un sitio catalítico para la síntesis de ATP O (conformación abierta) tiene baja afinidad por sustratos o productos L fija ligandos débilmente T fija ligandos fuertemente y es catalíticamente activo
En el primer paso: ADP + Pi se fijan al sitio L Aporte de energía conduce un cambio conformacional que convierte: Sitio L a T Sitio T a O Sitio O a L El sitio T tenía un ATP fijado y la energía se usó para cambiar el sitio a sitio O y se libera ATP Esta energía no se usó para sintetizar ATP sino para liberarlo de un sitio de unión firme El cambio conformacional lo conduce la subunidad (parte verde central de la imagen)
Mientras se libera el ATP del nuevo sitio O, otra molécula de ATP se forma (espontáneamente) en el nuevo sitio T Luego de 2 secuencias más, la enzima retorna a su estado inicial El sitio L siempre está ocupado por un ligando y ADP + Pi siempre se fija al sitio O luego que se libera el ATP
RELACIONES P:O Relación P:O es una medida del número de fosfatos de alta energía (cantidad de ATP) sintetizados por cada átomo de oxígeno (1/2 O2) consumido o por cada mol de agua producido Se calcula a partir de cantidad de ADP usado para sintetizar ATP y cantidad de Oxígeno captado por mitocondrias. NADH 3 FADH2 2
CONTROL RESPIRATORIO Es la dependencia de captación de oxígeno por mitocondrias según disponibilidad de ADP Condiciones normales: Oxidación y fosforilación están estrechamente acopladas Sustratos se oxidan Electrones se transportan Oxígeno se consume tan sólo cuando se requiere la síntesis de ATP Respiración acoplada ATP nunca se produce más rápido de lo necesario
Mitocondrias en reposo consumen oxígeno a velocidad lenta pero que puede incrementarse añadiendo ADP ADP es captado por mitocondrias Estimula la ATP-sintasa Disminuye el gradiente de protones Aumenta la respiración (estimula las bombas de protones para restablecer gradiente) Depleción de ADP Finaliza síntesis de ATP Respiración recupera su velocidad original Captación de oxígeno disminuye hasta su velocidad original
Si MIM pierde integridad estructural mitocondrias pueden desacoplarse parcialmente porosas protones pueden difundir por membrana interna sin necesitar ATP-sintasa Mecanismo de control respiratorio depende de necesidad de ADP y Pi para fijarse al complejo de ATP-sintasa Ausencia de ADP + Pi: protones no pueden entrar en mitocondria a través de complejo ATP-sintasa consumo de oxígeno disminuye bomba de protones no puede transportarlos contra una presión retrógrada elevada
Desacoplantes Transportan de nuevo los protones al interior de mitocondrias y hacen desaparecer el gradiente de protones sin intervención de ATPsintasa estimulan la respiración sistema hace un intento inefectivo de restaurar el gradiente de protones oxidando más combustible y bombeando más protones hacia el exterior de las mitocondrias Suelen ser compuestos hidrófobos (bases o ácidos débiles) 2,4-dinitrofenol (DNP)
Proteínas desacoplantes (UCP) Transportan protones desde espacio intermembrana a matriz mitocondrial por vías distintas a ATP-sintasa UCP 1 (termogenina) tejido adiposo marrón (Recién nacidos) proporciona calor corporal durante estrés por frío al desacoplar el gradiente de protones y generar calor en lugar de ATP UCP 2 modo ubicuo; UCP3 músculo esquelético; UCP 4 y 5 en cerebro
INHIBIDORES DEL METABOLISMO OXIDATIVO Inhibidores del Sistema de Transporte de Electrones Inhiben de modo selectivo complejos I, III o IV interrumpiendo flujo de electrones a lo largo de cadena respiratoria Interrumpen bomba de protones, síntesis de ATP y captación de oxígeno
Rotenona inhibe complejo I o NADH- Q-reductasa + algunos barbitúricos Inhibe oxidación de malato y lactato por NAD+ Los sustratos que aportan FADH2 aún pueden ser oxidados porque se omite paso por complejo I y electrones se donan a ubiquinona Inhibe captación de oxígeno Crossover point (punto de cruce): Rotenona causa reducción de todos los componentes previo al punto de inhibición porque no pueden ser oxidados y luego del punto de inhibición se oxidan por completo
Antimicina A inhibe complejo III o QH2-citocromo c-reductasa Impide transmisión al citocromo c de electrones procedentes del complejo I o de flavoproteínas que contengan FADH2 Componentes que preceden a complejo III se reducen por completo y posteriores se oxidan Inhibe estimulación de respiración por ADP Ácido ascórbico reduce citocromo c restablece respiración
Cianuro y Monóxido de Carbono inhiben complejo IV o citocromo c-oxidasa Azida Su inhibición es crucial porque pone fin a cadena de transporte de electrones Todos los componentes que preceden al complejo IV se reducen Oxígeno no puede reducirse Ninguno de los complejos es capaz de bombear protones, ni se sintetiza ATP No hay gradiente de protones Intoxicaciones alteran capacidad de transporte de oxígeno y síntesis de ATP
Inhibidores de ATP-sintasa Oligomicina Causa acumulación de protones fuera de mitocondria Sistema de bombeo de protones está aún intacto pero canal de protones está bloqueado
Inhibidores de ADP-ATP translocasa ADP-ATP translocasa mitocondrial se encarga de intercambiar el ATP mitocondrial recién sintetizado y ADP gastado del citosol Puede ser inhibida por plantas y toxinas del moho
REGULACIÓN DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA CONTROL RESPIRATORIO Y REGULACIÓN POR FEEDBACK (RETROALIMENTACIÓN) Cuando se añade ADP a mitocondrias aisladas estimula respiración y síntesis de ATP Cuando ADP ha sido convertido x completo a ATP respiración recupera su frecuencia inicial Relaciones NADH/NAD y ATP/ADP tienen efecto de feedback sobre enzimas fundamentales de glucólisis, oxidación de ácidos grasos y ciclo ATC Si fosforilación oxidativa se interrumpe por alto nivel de ATP NADH y ATP tienen efecto de feedback negativo sobre otras vías productoras de energía
REGULACIÓN MEDIANTE MODIFICACIÓN COVALENTE Y EFECTORES ALOSTÉRICOS (ATP- ADP) Principal objetivo es complejo IV Fosforilado (respuesta a acción hormonal) por proteínas dependiente de AMPc (PKA) Permite regulación alostérica por ATP (relación ATP/ADP) Valor alto de relación ATP/ADP inhibe fosforilación oxidativa Valor bajo la estimula Desfosforilado por fosfatasa de proteína estimulada por Ca 2+ Se pierde control de relación ATP/ADP y su actividad es muy estimulada aumenta producción de ATP
Complejo I presenta proceso reversible de fosforilación/desfosforilación Fosforilación catalizada por PKA aumenta actividad y se mantiene por niveles altos de Ca 2+ Desfosforilación por fosfatasa de proteína inhibida por Ca 2+
REGULACIÓN POR HORMONAS TIROIDEAS T 3 estimula síntesis de UCP2 y UCP3 pueden desacoplar gradiente de protones T 2 se fija al complejo IV induce un error o slip en citocromo c-oxidasa Bombea menos protones por cada electrón transportado a través del complejo termogénesis Acción de T 3 explica efectos termogénicos a largo plazo de hormonas tiroideas y T 2 efectos termogénicos a corto plazo
Control Coordinado del Metabolismo Oxidativo La fosforilación de la glucosa por ATP para formar glucosa-6-fosfato es catalizada por la hexocinasa Reacción activada por Pi Inhibida por Glucosa-6- fostato Fosfoglucosa isomerasa convierte G6P a fructosa- 6-fosfato
La enzima más regulada en la glucólisis es la fosfofructocinasa Cataliza la fosforilación de F6P por ATP para formar fructosa-1,6- bifosfato Activada por el sustrato F6P, Pi, AMP, NH4 y fructosa-1,6- bifosfato Inhibida alostéricamente por ATP y citrato Único ejemplo de un intermediario del ciclo ATC que regula una enzima glucolítica
En el último paso de la glucólisis, PEP se convierte a piruvato por piruvato cinasa Reacción inhibida por ATP (producto) Activada por ADP (sustrato)
La conversión de piruvato a acetil-coa por piruvato deshidrogenasa es una reacción muy regulada La reacción es activada por piruvato, ADP y Ca Es inhibida por aumentos en la relación [NADH]/[NAD] y el producto acetil-coa
La reacción de acetil- CoA con OAA para formar citrato es catalizada por la citrato sintasa Inhibida por citrato Aumentada por la relación de [NADH]/[NAD]
Isocitrato deshidrogenasa cataliza la conversión de isocitrato a alfacetoglutarato Esta reacción es activada por iones de Ca y ADP Inhibida por aumento en la relación [NADH]/[NAD]
Alfa-cetoglutarato deshidrogenasa cataliza la conversión de alfa-cetoglutarato a succinil-coa Inhibida por ATP y aumento en relación [NADH]/[NAD] Activada por aumento en relación [CoA]/[Succinil-CoA]