Calidad embrionaria como valor predictivo

BLOQUE Calidad embrionaria como valor predictivo Dr. Nicolás Prados Director de Laboratorio de Embriología Clínica IVI Sevilla 3 GAMETOS Y EMBRIONES

Contenido 1. Introducción... 2 2. Tipos de embriones... 2 Óptimos... 2 Subóptimos... 2 No viables... 3 3. Evaluación embrionaria... 3 NÚMERO DE CÉLULAS... 4 VELOCIDAD DE DIVISIÓN Y BLOQUEO EMBRIONARIO... 4 TAMAÑO CELULAR Y SIMETRÍA... 5 ASPECTO DEL CITOPLASMA... 6 CONTACTO INTERCELULAR Y COMPACTACIÓN... 6 ZONA PELÚCIDA... 6 MULTINUCLEACIÓN... 7 FRAGMENTACIÓN, CANTIDAD Y DISTRIBUCIÓN... 8 4. Selección embrionaria... 8 5. Nuevos criterios morfocinéticos... 9 6. Bibliografía... 10 7. Lecturas recomendadas... 12 UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 1 de 12

1. Introducción El éxito de una técnica de reproducción asistida es el nacimiento de un niño único y sano. Podemos considerar como distintos grados de fracaso, aparte de poner en riesgo la salud de la paciente, la no gestación, el aborto o la gestación múltiple. Aumentar la tasa de éxito de las técnicas de reproducción asistida implica aislar y cultivar los gametos y embriones de la mejor manera posible, distinguir su potencial y transferir en condiciones óptimas uno o dos embriones. Sólo la transferencia de un único embrión puede disminuir al mínimo el riesgo de un embarazo múltiple. El único método que dispone el embriólogo para elegir el mejor embrión es la observación y escrutinio de los embriones disponibles en la cohorte. No existe actualmente ninguna técnica de rutina para seleccionar los embriones por sí mismos que no sea costosa o agresiva para el embrión. Ni tampoco existen técnicas que sean capaces de mejorar la calidad intrínseca al embrión. En este capítulo revisaremos los criterios para seleccionar los mejores embriones de una cohorte en su tercer día de desarrollo, momento en el que habitualmente se realiza la mayor parte de las transferencias embrionarias. En otros temas se hace referencia al valor predictivo de la morfología de los cigotos y a la selección embrionaria en estadío de blastocisto. 2. Tipos de embriones En este capítulo desarrollaremos las características embrionarias que tomamos en cuenta para clasificar los embriones en el laboratorio en su tercer día de desarrollo y poder tomar una decisión sobre su destino. Los embriones los podemos clasificar según su potencial implantatorio: Óptimos Son los que tienen un desarrollo correcto y ninguna característica de mal pronóstico. Estos embriones serán siempre transferidos o criopreservados. También nos referimos a ellos como embriones de buena calidad. En pacientes de buen pronóstico (mujeres de menos de 36 años y ninguna patología adversa o en receptoras de ovocitos) estos embriones suelen tener un 50% o más de posibilidades de implantar. Lo habitual es que este grupo de embriones tenga un 25% de tasa de implantación o más. Subóptimos Son los embriones que presentan una serie de características que si bien van asociados a una menor viabilidad no son completamente descartables. Los transferiremos si no contamos con ninguno de mejor morfología. De la misma manera procederemos a criopreservarlos si existen otros embriones óptimos en la misma cohorte que van a ser criopreservados. Si no es así, podemos dejarlos en observación hasta su quinto día de desarrollo (D5) y criopreservarlos si alcanzan el estadío de blastocisto de manera correcta. También nos referimos a ellos como embriones acompañantes. Estos embriones suelen tener algo menos de la mitad de posibilidades de implantar (hasta un 20%) aunque siempre dependerá del tipo y extensión de las anomalías morfológicas que presentan. UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 2 de 12

No viables Son los que serán descartados completamente. Éstos se conocen también como anormales. Incluyen tanto los embriones evolutivos in vitro cuyas características están relacionadas con una falta de potencial implantatorio como los que están bloqueados. Obviamente esta clasificación es subjetiva y catalogar un embrión como anormal debe estar contrastado con la experiencia de cada laboratorio, pero se estima su potencial implantatorio en menos del 1%. 3. Evaluación embrionaria Se ha intentado hacer escalas numéricas de clasificación continua por puntos[1], pero toda clasificación o puntaje es subjetivo y debe ser contrastado con los resultados propios de cada laboratorio pues las condiciones de cultivo afectan al aspecto del embrión. La aplicación de un puntaje bien constrastado puede ayudar a distinguir a los embriones con una mayor tasa de formación de blastocistos o de implantación[2]. En nuestro caso preferimos una relación de las características de tal manera que su comparación junto a nuestra experiencia es la que nos hace decidir por el mejor embrión a transferir. La clasificación es así por potencial implantatorio y los criterios de valoración de los embriones como óptimos, subóptimos o no viables van a ir variando según nuestra experiencia en la transferencia de embriones de morfología similar en las condiciones de nuestro laboratorio. La Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR) ha publicado unos criterios de valoración de embriones tempranos[3]. En estos criterios se clasifican los embriones en cuatro tipos A, B, C y D según su morfología. Los dos primeros grupos podrían corresponderse de forma general a embriones óptimos en nuestra clasificación. El grupo C correspondería a los embriones subóptimos y el grupo D englobaría a los embriones subóptimos y no viables. Es interesante guiarse por esta clasificación a la hora de describir los embriones pues puede servir para comparar la calidad embrionaria y los resultados entre laboratorios. Aún así es importante correlacionar en cada laboratorio el patrón morfológico con las posibilidades de implantación, pues podría ocurrir que dentro de los embriones clasificados como de tipo D, algunos podrían ser transferibles o que algunos embriones de baja calidad morfológica (tipo C) tienen buenas tasas de implantación como ocurre a veces en pacientes muy jóvenes o en el programa de ovodonación (tabla 1). Los embriones se observan en un microscopio invertido a seiscientos aumentos con un objetivo de contraste modular y pletina calefactada. Es necesario observarlos cada veinticuatro horas para distinguir los distintos tipos de evolución. Muchas características en el tercer día de desarrollo embrionario in vitro (D3) se interpretan en función del aspecto en el segundo día de desarrollo embrionario in vitro (D2). La selección embrionaria debe ser dinámica. Los embriones no son estáticos y varían a lo largo del tiempo que están en cultivo. Para poder comparar los resultados y optimizar la selección de los embriones, uno de los factores más importantes a tener en cuenta es el momento en que se evaluan los embriones. Los embriones de D2 deben evaluarse a las 44 ± 1 horas tras inseminación/icsi. Los embriones de D3 deben evaluarse a las 66 ± 1 horas tras inseminación/icsi. El momento que se elija no es tan crítico como que todos los embriones se evalúen siempre en el mismo momento para que el criterio sea el más estable y parecido posible entre las distintas cohortes embrionarias. Sólo así UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 3 de 12

podremos después correlacionar determinada característica morfológica con una mejor o peor tasa de implantación. Preferimos la transferencia en D3 puesto que así distinguimos mejor la calidad embrionaria y podemos predecir mejor la capacidad implantatoria de cada uno de ellos. Incluso en el caso en el que no es posible la selección en D3 porque se han obtenido solo uno o dos cigotos, se prefiere su desarrollo hasta D3 pues así podemos descartarlos si son anormales, especialmente si se han bloqueado. Obviamente para conseguir esto, el laboratorio y las condiciones de cultivo deben ser las mejores posibles para no perjudicar el correcto desarrollo de los embriones. La evaluación de la morfología embrionaria con el fin de elegir el embrión más viable requiere experiencia y un buen equipamiento. Se debe tener en cuenta que aunque es necesario evaluar los embriones cada veinticuatro horas, éstos tampoco deben estar fuera del incubador más tiempo del que es estrictamente necesario. Para ello microscopios y lupas deben estar revisados, en condiciones óptimas y provistos de pletinas o superficies calefactadas. Es de gran ayuda disponer de un sistema de vídeo o fotografía para volver a realizar observaciones detalladas a posteriori sin tener que volver a observar en el microscopio a los embriones. Es conveniente que toda la información quede almacenada en soporte informático para poder analizar todos los detalles recogidos y comprobar que la selección es correcta. Se están desarrollando sistemas estancos de cultivo que no necesitan sacar los embriones fuera instalando microscopios y cámaras dentro del incubador (por ejemplo, el EmbryoScope de Unisense). Estos sistemas permiten analizar de forma dinámica la morfología de los embriones sin que varíen las condiciones de cultivo y proporcionar nuevos parámetros que se escapan a la observación tradicional. NÚMERO DE CÉLULAS El número de células óptimo en D2 es de cuatro células y en D3 es de siete u ocho células. Seis, nueve o diez células pueden ser aceptables si no hay asociadas otras anomalías. Los embriones de cinco células o más de 10 sin más anomalías relevantes se consideran subóptimos. Embriones que presentan en D2 seis o más células y en D3 nueve o más células presentan una alta probabilidad de presentar aneuploidías o blastómeras multinucleadas[4]. Embriones con cuatro o menos células en D3 llegan a implantar en raros casos pero casi todos se bloquearán in vitro. Se descartan como no viables. La figura 1 muestra algunos ejemplos de embriones según el número de blastómeras. VELOCIDAD DE DIVISIÓN Y BLOQUEO EMBRIONARIO Una velocidad de división normal es la que presenta un embrión que dobla su número de células en 24 horas de D2 a D3 (cuatro a ocho, tres a seis, cinco a diez, dos a cuatro) y es un pronóstico de viabilidad[5]. Una velocidad mayor se correlaciona con anomalías cromosómicas y una menor con un posible bloqueo embrionario. UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 4 de 12

Otra característica que recientemente se ha añadido a la velocidad de división es el momento de la primera división, cuando el cigoto se divide en dos células. Los embriones que antes se dividen presentan tasas de implantación mayores dentro de una cohorte. Sin embargo la mayoría de los laboratorios no recogen esta característica ya que implica una segunda observación (y salida del incubador) de los cigotos de 6 a 8 horas tras el chequeo de la fecundación[6]. El desarrollo de las nuevas técnicas de time-lapse mencionadas como el EmbryoScope permite estudiar al detalle el momento y la sincronía de todas las divisiones celulares y no solo la primera. Es posible que este parámetro se vuelva mucho más importante en la evaluación de embriones en estos sistemas. El desarrollo de muchos embriones se bloquea entre los días 2 y 3 de desarrollo. Esto corresponde al momento en que comienza a activar su genoma propio (comienza su transcripción activa). Un embrión que tras 24 horas no incrementa el número de blastómeras se puede considerar bloqueado o en vías de bloquearse y por tanto anormal. El bloqueo embrionario se puede deber a anomalías cromosómicas o del centrosoma o a las condiciones subóptimas del laboratorio. Este es uno de los motivos por los que se prefiere la transferencia en D3 incluso cuando solo se dispone de uno o a dos cigotos. La pérdida de viabilidad causada por las condiciones subóptimas ambientales en el laboratorio no es de recibo en el laboratorio de reproducción actual con el personal y los medios adecuados. El embriólogo debe tener la tranquilidad de que un embrión bloqueado entre D2 y D3 iba a bloquearse igualmente en el útero tras la transferencia, con lo que la paciente no sufre un acto médico innecesario ni deposita esperanzas infundadas en el procedimiento. La tabla 2 agrupa las distintas combinaciones de número de células en D2 y D3 en las categorías ASEBIR. TAMAÑO CELULAR Y SIMETRÍA En el embrión normal la forma de las blastómeras va variando desde la esfera inicial del cigoto a los elipsoides del estadío de 8 células. Se considera normal una distribución regular del volumen celular de tal manera que todos las blastómeras tengan un tamaño similar en embriones con 2, 4 o 8 células. En el resto de embriones es normal una relativa asimetría. En este caso se considera que tienen una simetría normal. Un embrión con un número impar de células y todas exactamente del mismo tamaño se considera que es asimétrico. Una ligera asimetría (diferencias hasta del 20% en volumen) no se considera de mal pronóstico pero los embriones con células claramente asimétricas se pueden considerar como subóptimos[7]. Células muy alargadas y algo deformes pueden estar en división. Los embriones que presentan una blastómera de gran tamaño en relación al resto (presencia de célula dominante, que ocupa una tercera parte o más del volumen del embrión) se consideran anormales puesto que se asocia a una alta tasa de poliploidía[8]. La figura 2 muestra algunos ejemplos de embriones asimétricos. Es mucho más relevante y de mayor impacto sobre la viabilidad embrionaria la asimetría observada en D2 que en D3. Esto es un reflejo de la polaridad, la distribución de los componentes celulares, los ejes y el huso mitótico. UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 5 de 12

ASPECTO DEL CITOPLASMA El citoplasma puede variar en su aspecto claro o algo granulado. La aparición de vesículas en el tercer día de desarrollo se considera señal de la activación del genoma embrionario, al aumentar la transcripción y por tanto el retículo endoplasmático y los lisosomas. Es por tanto un indicio de buena salud embrionaria[9], pero no es un indicador de gran relevancia para distinguir la capacidad implantatoria de un embrión[2]. Por otra parte, la aparición de vacuolas y la contracción del citoplasma se correlacionan con la degeneración y lisis del embrión. Los embriones que presentan estas alteraciones en más de dos blastómeras los consideramos anormales. Los embriones que presentan estas alteraciones en solo una o dos blastómeras se pueden considerar subóptimos dependiendo del tamaño de la anomalía. Habitualmente preferimos dejarlos en observación hasta blastocisto pues no es de buen pronóstico de supervivencia a la criopreservación la presencia de vacuolas. La figura 3 muestra distintos aspectos del citoplasma de los embriones humanos. CONTACTO INTERCELULAR Y COMPACTACIÓN A veces las células presentan muy pocas zonas de contacto entre ellas. La formación de uniones de adherencia (tight junctions) comienza en el estadío de seis a ocho células y las uniones tipo gap no aparecen hasta el estadío de morula[10]. Estas uniones son relevantes para la compactación y diferenciación temprana del embrión. Los embriones cuyas células tienen pocas o ninguna zona de contacto entre sí presentan un mal pronóstico de supervivencia tras la congelación. Presentan células libres y muy esféricas (embriones PCA o poor cell adherence ). Estos embriones tienen las mismas tasas de implantación tras la transferencia en fresco que el resto de embriones óptimos, pero deben ser elegidos para transferir antes que otro con buena adherencia entre blastómeras, que sobrevivirá mejor a la descongelación. Dependiendo de las condiciones de cultivo la compactación puede comenzar a observarse en D3. Se considera de buen pronóstico la compactación en un embrión de al menos 8 células si ocurre por igual con todas las blastómeras. Se considera de mal pronóstico una compactación localizada o regional pues demuestra una asincronía entre las blastómeras. Estos embriones se consideran desorganizados. También se consideran desorganizados los embriones que no siendo asimétricos presentan células de forma no elipsoidal (arriñonadas, alongadas, rectas, ) aunque no se debe descartar que la blastómera esté en división. Por lo general la compactación no es una característica fiable de la capacidad implantatoria del embrión. La figura 4 presenta varios ejemplos. ZONA PELÚCIDA El ovocito maduro está protegido por una capa proteica llamada zona pelúcida de 15 a 20 µm de espesor y que limita el llamado espacio perivitelino entre ella y el ovocito. La zona pelúcida es una capa gelatinosa compuesta por tres glicoproteínas distintas con un borde interno, o membrana, más denso. Las funciones de la zona pelúcida son la protección del ovocito y el UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 6 de 12

preembrión en sus primeros estadíos, facilitar la fecundación (al tener receptores para los espermatozoides en su superficie), evitar la entrada de más de un espermatozoide en la fecundación (endureciéndose), y preservar el correcto desarrollo del embrión confinándolo en un volumen pequeño. Anomalías en la estructura o función de las glicoproteínas de la zona pelúcida puede desembocar en fecundaciones anómalas, una disminución de la viabilidad embrionaria y menor capacidad para implantar. Además tras la crioconservación y posterior descongelación de los preembriones humanos la zona pelúcida se endurece aun más. El grosor de la zona pelúcida se ha descrito como un factor pronóstico de su capacidad para eclosionar y por tanto de su viabilidad[11]. El grosor disminuye asimétricamente durante el cultivo in vitro y se relaciona una zona más delgada con una mayor capacidad implantatoria. El grosor de la zona pelúcida también está relacionado con la estimulación ovárica[12]. Se recomienda la técnica de eclosión asistida (assisted hatching) para los casos de anomalía de la zona, especialmente cuando es muy gruesa o presenta tabiques internos[13]. De esta manera se restablece la capacidad del embrión de eclosionar. Otras anomalías son zonas muy delgadas que habitualmente se presentan junto a espacios perivitelinos más amplias de lo habitual y debris perivitelino. Se postula que las zonas pelúcidas de pacientes mayores de 36 años o de morfología anormal pueden impedir la correcta eclosión de los embriones y que estas pacientes se ven beneficiadas de la aplicación de esta técnica. Una zona pelúcida oval o pigmentada sin ninguna otra característica relevante no se considera pernicioso. En la figura 5 mostramos algunos ejemplos. MULTINUCLEACIÓN Los embriones humanos muestran tanto in vitro como in vivo blastómeras multinucleadas. Este fenómeno se puede deber tanto a una división nuclear sin la correspondiente celular, fragmentación del núcleo o una migración incorrecta de los cromosomas durante la anafase. La presencia de blastómeras multinucleadas en D2 y D3 se correlaciona con una menor tasa de implantación y desarrollo hasta blastocisto[14]. Estos embriones suelen ser mosaicos o aneuploides. Cuando aparecen solo en el D3 de desarrollo no parece que afecte tanto a su capacidad implantatoria[15], de tal manera que embriones con blastómeras multinucleadas en D2 se consideran anormales y los que tienen embriones multinucleados en D3 y no en D2 son subóptimos. A la hora de evaluar la multinucleación tanto en D2 como en D3 distinguiremos la ausencia de multinucleación (es decir, observamos un único núcleo en todas las blastómeras) de la falta de visibilidad de los núcleos (si está en interfase no observaremos ningún núcleo). Los primeros son los de mejor pronóstico. También anotaremos el número de blastómeras multinucleadas y el número de núcleos por blastómera por si hiciera falta comparar estos embriones. En la figura 6 se muestran ejemplos de embriones multinucleados. UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 7 de 12

FRAGMENTACIÓN, CANTIDAD Y DISTRIBUCIÓN Además del número de células, la fragmentación es el parámetro más importante en la evaluación de viabilidad de un embrión[16]. Aunque se han propuesto desde hace tiempo categorías simplificadoras, se debe cuantificar la fragmentación del embrión como el porcentaje del volumen que ocupa la fragmentación. Se desconoce si la aparición de la fragmentación es un efecto externo (por ejemplo de las condiciones de cultivo o de la hiperestimulación ovárica) o es una propiedad inherente del desarrollo embrionario. El mecanismo debe ser de defensa del embrión para librarse de componentes citoplasmáticos dañinos o para mantener cierta relación citoplasma-núcleo. Se han propuesto distintas hipótesis que expliquen los efectos perniciosos de la presencia de fragmentos: el secuestro de proteínas reguladoras[17], la interferencia entre blastómeras[18] o la inducción de la apoptosis[19]. La mayoría de los fragmentos se forman durante la mitosis, durante las dos primeras divisiones celulares. Si la pérdida es grande y muy temprana el desarrollo se puede ver gravemente perjudicado[20]. La presencia de fragmentos no significa per se una menor viabilidad y embriones con hasta un 35% de fragmentación implantan en una razonable proporción tras retirarles con micromanipulación los fragmentos[21]. Sí es más relevante la distribución de los fragmentos. Distinguiremos cinco que están resumidos en la tabla 2. El tipo I, II, y III no se considera pernicioso para un embrión hasta en un 10 %. Si la proporción es hasta el 35% se considera subóptimo. Si es mayor del 35% o del tipo IV independientemente de la proporción se considera anormal[14]. La figura 7 muestra más ejemplos. 4. Selección embrionaria Como dijimos al comienzo no se puntúa cada embrión sino que comparamos todas estas características para decidir entre los embriones disponibles cuáles transferimos, cuáles criopreservamos y cuáles desechamos. En la Tabla 3 resumimos las características de cada grupo de embriones. Entre los embriones óptimos elegiremos para transferir los que presenten una mayor vesiculación del citoplasma, las células sean simétricas, y la zona presente áreas más finas. Elegiremos también los embriones que presenten buenos contactos entre las células y la menor cantidad de fragmentos. La clasificación ASEBIR en tipos A, B, C y D también nos sirve para ordenar los embriones por su morfología. Los embriones que presenten alguna anomalía no grave sin acumularlas se pueden considerar para transferir si no hay ninguno óptimo y serán siempre criopreservados. Según el número y gravedad de las anomalías que acumulen los dejaremos en observación para evaluar su criopreservación en día quinto de desarrollo (blastocisto). Las distintas técnicas de selección embrionaria permiten con bastante seguridad elegir a los mejores embriones de una cohorte, los de mayor potencial implantatorio, para transferir. Es más problemático, y depende de la experiencia de cada centro, descartar los embriones como no viables especialmente cuando no están bloqueados o completamente fragmentados. Ante la duda siempre es posible llevarlos hasta el día 5 ó 6 de cultivo y solo congelarlos si dan lugar UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 8 de 12

a blastocistos de una calidad aceptable. A nuestro juicio, se debe evitar transferir embriones anormales o que no tienen ninguna posibilidad de implantación y por tanto cancelar el ciclo si no hay otros embriones disponibles. Con un sistema informatizado se debe rutinariamente auditar y comparar los datos de morfología embrionaria con los de su viabilidad (embarazo, implantación y nacimiento de niños sanos). De esta manera se podrá valorar el impacto de cada característica evaluada y se puede llegar a seleccionar mejor los embriones: en un reciente trabajo, se ha visto como la morfología del pronúcleo y sus nucleolos, y la morfología del embrión en día 2 son las variables predictivas de mayor impacto, más que la morfología del día 3 o su capacidad para llegar a blastocisto[22]. Esto no quita que sean también parámetros a tener en cuenta. Esto va englobado en el control de calidad interno del laboratorio para que el grado de variabilidad interno entre los distintos embriólogos sea mínimo. Existen ya programas de control de calidad externo que incluyen la valoración morfológica embrionaria a los que es muy recomendable adherirse. 5. Nuevos criterios morfocinéticos El sistema de grabación continua o time-lapse del EmbryoScope (u otros sistemas parecidos) ha revolucionado la forma de seleccionar los embriones añadiendo nuevos parámetros para seleccionar embriones al mismo tiempo que no es necesario sacarlos del incubador para observarlos. Entre los parámetros que añaden a la selección son principalmente los tiempos exactos de las distintas divisiones, si estas divisiones son sincrónicas o no, la aparición y desaparición de la multinucleación o la evolución de la proporción de fragmentos entre otros parámetros. Estos parámetros generan algoritmos de selección mucho más finos que el clásico descrito anteriormente y ya han sido validados clínicamente [23]. Sin embargo estos algoritmos deben ser validados en cada centro pues al ser más sensibles sufren variaciones producidas por las distintas variaciones de cultivo. Aunque el valor predictivo es bajo todavía, estos algoritmos también se han desarrollado para predecir el sexo de los embriones [24] o su normalidad cromosómica [25]. Sin duda, es un gran paso hacia un laboratorio automatizado y estandarizado [26]. UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 9 de 12

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7. Lecturas recomendadas J Remohí, A. Cobo, N Prados, J.L. Romero, A Pellicer. Manual Práctico de Esterilidad y Reproducción Humana. Laboratorio de reproducción asistida 4ª Edición Ed. McGraw-Hill Interamericana 2011 ISBN 978-84-481-6088-3 Lucinda L. Veeck. An Atlas of Human Gametes and Conceptuses (The Encyclopaedia of Visual Medicine Series) Parthenon Publishing. 1999 ISBN 18-507-0016-8 DK Gardner y cols. Textbook of Assisted Reproductive Techniques. 2 nd Edition. Taylor & Francis 2004 ISBN 1-84184-313-X 2016 IVI Reservados todos los derechos UNIDAD 06: Calidad embrionaria como valor predictivo Página 12 de 12