Inhibición de recristalizacion en hielo debido a la actividad de la proteína de unión del hielo detectada por resonancia magnética nuclear

Inhibición de recristalizacion en hielo debido a la actividad de la proteína de unión del hielo detectada por resonancia magnética nuclear

Presentado por: Castro Ángela Ochoa Paula Pineda Mónica

PALABRAS CLAVES Resonancia magnética nuclear Hielo Proteína de unión de hielo Crioconcervacion Recristalizacion Biotecnología

RMN (resonancia magnética nuclear) La resonancia magnética, hace uso de las propiedades de resonancia aplicando radiofrecuencia a los núcleos atómicos o dipolos entre los campos aplicados de la muestra. Es común denominar resonancia magnética al aparato que obtiene imágenes por resonancia magnética.

Hielo: El hielo se presenta en 12 estructuras o fases cristalinas diferentes a la fase estable, esta fase suele denotarse como fase I según la terminología de Tamman, esta fase I presenta dos variantes relacionadas entre si, el hielo hexagonal y el hielo cubico.

Proteína de unión de hielo: Proteínas anticongelantes o proteínas estructurales del hielo se refiere a una clase de poli péptidos producidos por ciertos vertebrados, plantas, hongos y bacterias que permiten su supervivencia en ambientes bajo cero.

La Crio-conservación Proceso mediante el cual se enfrían y almacenan células, órganos o tejidos para preservar sus cualidades ante posibles reacciones biológicas, esta preservación debe ser a temperaturas criogénicas (bajas).

Recristalizacion: técnica instrumental utilizada para llevar a cabo la purificación de sustancias solidas que contienen impurezas. Biotecnología: tecnología que estudia y aprovecha los mecanismos e interacciones biológicas de los seres vivos, en especial en células, mediante un amplio campo multidisciplinario. Es decir es la aplicación de principios de la ciencia para tratamiento de materiales orgánicos por sistemas biológicos para producir bienes y servicios.

RESUMEN Se utilizo la resonancia magnética nuclear y mediciones de tiempo de auto-fusión en el agua liquida presenta en el hielo. Esto se realizo con o sin una proteína de unión de hielo bacteriana (IBP). Se encontró una modificación de la estructura de hielo por el IBP, ya que se indico una inhibición de la recristalizacion del hielo. Se lograron resultados que ponen en relieve el potencial de las técnicas de RMN en la evaluación del impacto de los IBP en la recristalizacion del hielo.

INTRODUCCION Las proteínas con actividad de interacción con hielo han sido identificadas en peces, plantas y en los insectos resistentes al frio. Este estudio se realizo porque las propiedades de las proteínas que interacciona con hielo son útiles en áreas de la biotecnología, especialmente en la línea de células de crio-conservación y la fabricación de alimentos. En la aplicaciones de la biotecnología se ha demostrados la utilidad de la RMN para monitorizar la composición de la fase de agua no congelada durante la formación de criogeles.

MATERIALES Y METODOS Se utilizaron proteínas extracelulares (ECP) Y EL IBP recombinante (ribp). para las proteínas extracelulares, las bacterias v3519-10 se cultivaron en medios líquidos a 4 c. El sobrenadante que contiene el IBP se filtro y se centrifugo para obtener un extracto crudo de proteínas extracelulares de V3519-10. La concentración de las proteínas se determino mediante el ensayo de Bradford, usando el reactivo de coomassie plus.

Para IBP recombinante (ribp) el ADN que codifica el IBP se añadió a un lado del cubo del hielo, donde se clono y se transformo en células BL21. Las células BL21 se cultivaron en medio LB a 37 c hasta una densidad óptica de 0,8, se añadió un reactivo para dar una concentración final de 1 mm y reducir la temperatura a 18 c. Finalmente las proteínas se extrajeron del cultivo después de encubar durante la noche y la ribp se purifico, tomando un tamaño aproximadamente de 52 Kda.

METODOLOGIA Se prepararon 5 muestras de hielo, todas las muestras contenían un litro de solución de NaCl 7 g. IBP se añadió a 3 muestras. La muestra de hielo que contiene una preparación cruda de la IBP consistía en 7 g /l, solución de NaCl con 10 g/ml de 3519-10 ECP, donde se denomino hielo con ECP.

Las otras dos muestras contiene 7 g/l de NaCl con 2 y 4 mg /L de IBP recombinante, y se conoce como hielo con ribp. Se prepararon dos muestras de control, en la primera solución de NaCl sin proteína, y en la segunda solución de NaCl con albumina de suero bovina (BSA). Las muestras se analizaron mediante RMN en múltiples puntos durante 1800 h y se almacenaron en un congelador a -13,5 c entre las mediciones de RMN.

RESULTADOS (a)- (c): t = 39, 578 y 1.705 h. El crecimiento de cristales de hielo a partir de ~ 200 m hasta 1 mm se produce claramente en este período de tiempo. (d) - (f): t = 102, 651 y 1730 h. La inhibición del crecimiento de cristales de hielo es clara sobre este período de tiempo.

EVOLUCIÓN DE LA T 2 TIEMPOS DE ALOJAMIENTO CON EL ENVEJECIMIENTO PARA CINCO MUESTRAS DE HIELO El control de hielo (diamantes negros), el hielo con BSA (círculos abiertos), el hielo con ECP (círculos rellenos), el hielo con ribp (2) (triángulos rellenos) y hielo con ribp (4) (cuadrados rellenos).

Datos de tiempo de los desplazamientos de difusión dependiente Δ con la edad de hielo: el control de hielo (rombos abiertos, t = 25 h; cerrado diamantes, t = 1.922 h), hielo con ECP (círculos abiertos, t = 92 h; cerrados círculos, t = 1.909 h), hielo con ribp (2) (triángulos abiertos, t = 189 h; triángulos cerrados, t = 1,922 h) y hielo con ribp (4) (cuadrados abiertos, t = 20 h; cuadrados cerrados, t = 1,914 h).

La longitud de poro lp p calcula a partir de T 2 tiempos de relajación como función del envejecimiento de hielo para el control de hielo (diamantes rellenos), hielo con ribp (2) (triángulos rellenos) y hielo con ribp (4) (cuadrados rellenos). La falta de cambio en la escala de longitud con el envejecimiento es evidencia de que IBP inhibe el crecimiento del tamaño de la vena líquida

CONCLUSION La técnica de resonancia magnética nuclear, logro caracterizar cuantitativamente la estructura de red de la hebra de hielo líquido; entendiendo así que las técnicas RM pueden monitorear los procesos de recristalización del hielo de forma no invasiva, importante método que se utiliza en los procesos biotecnológicos. También a partir de la lectura de este artículo se logró interpretar que los resultados demuestran el gran potencial de la RM en la supervisión de procesos de biotecnología

GRACIAS