MICROPROPAGACIÓN
El arte y la ciencia de multiplicar plantas in vitro Aloe Agave
Micropropagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.
Embriogénesis somática y organogénesis Ambas tecnologías son utilizables como métodos de micro-propagación No siempre permiten obtener plantas idénticas entre si y a las progenitoras Su aplicación más notable radica en la posibilidad de producir plantas enteras a partir de una o unas pocas células
1. Cultivo de meristemas----------> Plantas libres de virus organgénesis 2. Explantos --------------> vástagos ---> plantas embriogénesis 3. Explantos --------------- Embriones somáticos Semillas artificiales
Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta
Propagación vegetativa por embriogénesis somática Explanto (disco de hoja) Callo REGENERACIÓN Suspensión celular GERMINACIÓN ENCAPSULACIÓN Embriones somáticos GERMINACIÓN Semilla artificial
Embriogénesis somática
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA Los embriones se regeneran a partir de células somáticas, ya sean tejidos u órganos existentes o tejidos formados de novo esto se contrapone a la embriogénesis sexual o zigótica
Diferentes tipos de embriones no zigóticos Embriones adventicios oembriones somáticos que provienen de otros órganos o embriones Embriones partenogénicos formados a partir de huevos no fertilizados Embriones androgenéticos formados a partir de gametofitos masculinos
La embriogénesis somática difiere de la organogénesis Se forman a partir de células simples sin conexión vascular con el tejido materno
La formación y desarrollo de embriones somáticos fué reconocida por Steward et al. (1958) y Reinert (1958, 1959) en cultivos de Daucus carota
Los dos caminos de la embriogénesis somática Embriogénesis directa (Sharp et al., 1980) Los embriones se forman directamente a partir delos explantos sin formación de callos Embriogénesis indirecta Los embriones se desarrollan a partir de callos desarrollados del explanto
Tipos de células embriogénicas Células Pre-embriogénicas determinadas, PEDCs Provienen de tejidos relacionados con los embriones zigóticos Células embriogénicas inducidas, IEDCs Empleo de reguladores de crecimiento y condiciones de cultivo específicas para la generación de los callos y posteriorments otras para redeterminarle a las céluas el desarrollo embriogénico
Factores de inducción embriogenica Tejidos florales o reproductivos Auxinas (2,4-D) Medios reducidos en nitrogeno
La embriogénesis somática es poco usada como método de propagación Alta probabilidad de mutaciones Dificultad metodológica con algunas especies en particular Pérdida de la capacidad regenerativa luego de repetidos subcultivos Los embriones somáticos presentan frecuentemente una profunda dormancia
MATERIAL DE PARTIDA SEMILLAS IMADURAS GERMINACIÓN Embriogénesis en soja DESARROLLO PROLIFERACIÓN INDUCCIÓN
Embriogénesis en vid Callos embriogénicos derivados de cultivos de anteras Embriones somáticos y plántulas de la variedad Sultanina
Embriones somáticos de alfalfa La función inductiva es llevada a cabo por auxinas (2,4-D).
Maduración de los Embriones Somáticos La suspensión donde están los embriones somáticos se filtra La fracción colectada se esparce en un medio de cultivo sin reguladores de crecimiento Esto da lugar a homogeneización del tamaño y estado de desarrollo de embriones somáticos: Estado globular-a los 4 días Estado corazón Estado torpedo-a los 7-10 días Estado de maduración final En ocasiones es necesario tratarlos con sustancias como acido abscísico, maltosa o realizar pretratamientos a temperaturas bajas
Una de las ideas con embriones somáticos es producir semillas sintéticas o artificiales surge como resultado de la posibilidad de su aplicación en agricultura.
Mientrasel embrión cigótico se nutre del tejido materno, el somático recibe sus nutrientes directamente de un medio de cultivo. Por lo tanto las sustancias de reserva del embrión somático presentan diferencias bioquímicas en relación con el endosperma de una semilla natural. Además, las estructuras que rodean al embrión cigótico le proveen de protección y controlan el intercambio gaseoso, mientras que el somático debe ser encapsulado para facilitar su manipulación y almacenamiento, y por tanto deben ser incorporados nutrientes, reguladores de crecimiento y fungicidas.
Encapsulamiento Mecanizado Los materiales usados para encapsular los embriones somáticos deben cumplir dos funciones: Protección física Contener nutrientes, antibióticos y funguicidas,.
Pasos en la producción de semillas artificiales 1. Inducción a la embriogénesis somática 2. Producción sincronizada y a gran escala de los embriones somáticos 3. Maduración de los embriones somáticos 4. Encapsulamiento mecanizado 5. Almacenamiento de las semillas artificiales 6. Siembra en invernadero o campo
Encapsulación Alginato de sodio cultivo embrionado ø 4mm 50 mm CaCl 2 15-30 min Cápsules ø 4.5-5.0 mm 0.8-1.2 g/cap Alginato Embrión Nutriente
Almacenamiento de las Semillas Sintéticas El almacenamiento es otro aspecto importante a tener en cuenta Lo ideal: que las semillas sintéticas tengan un comportamiento similar a la mayoría de las semillas verdaderas y permanezcan viables por mucho tiempo La criopreservación con nitrógeno líquido podría resolver este punto.
Morfogénesis
Micropropagación por cultivo de vástagos (Microcutting ) Forma especializada de organogénesis Implica la generación de vástagos a partir de meristemas preexistentes Requiere la ruptura de la dominancia apical
Micropropagación por cultivo de vástagos Etapa1 Etapa 2 Etapa 3 ************* ****************** **************** plant mass production -------> hardening root development Explant cut ---> subculture (leaf meristem) transplanting into soil cut ---> subculture Advantitious Acclimatization shoots -------> cut ---> subculture Culture in field
Micropropagación por cultivo de vástagos Etapa 1: Establecimiento del sistema aséptico Etapa 2: Multiplicación de los propágulos por repetidos subcultivos Etapa 3: Transferencia de las plántulas al suelo
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 1: establecimiento del cultivo aséptico Fuentes del explanto * Apices de los vástagos o tallos * Yemas axilares * Yemas florales no desarrolladas
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 1: establecimiento del cultivo aséptico Dormant buds are cut from the stock plants and surfacesterilized. When placed on the appropriate growing medium, they begin the micropropagation process.
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 2: Propagación
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 3: Trasplante In many commercial labs, rooting in culture (in vitro) is skipped in favor of rooting out of culture (ex vitro). This tray of unrooted microshoots has now been taken out of the sterile environment. The microcuttings, as they are called, are trimmed up and soaked in a rooting hormone (auxin) solution...
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 3: Trasplante...then planted in flats much like young bedding plants. At this point they still have no roots.
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 3: Trasplante Flats of unrooted microcuttings are transferred to a fog chamber within a greenhouse. Directly out of culture, the plantlets need high humidity levels and reduced light (similar to the in vitro environment).
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 3: Trasplante Over the next 10-14 days, fogging is diminished and the tent opened up, until the plants do not need extra protection (ie. the plantlets on the right). This process is known as acclimatization or hardening off.
Micropropagation through shoot tip culture Stage 3: transplanting The microcuttings have rooted, transplanted into larger cells, and increased greatly in size in only a few weeks.
Micropropagaciónpor cultivo de vástagos Etapa 3: Trasplante After all that work, the plants are ready for the field. They are moved to a shade house at least one week before planting to finish the hardening-off process
Etapas de la Micropropagación con enraizamiento in-vitro Etapa 0 Seleccion & preparación de la planta madre Esterilización de los tejidos Etapa I -Iniciación del cultivo Disposición de los explantos en los medios Etapa II - Multiplicación Los vástagos generados son transferidos al medio de desarrollo específico dónde se dividen constantemente Etapa III - Enraizamiento Los vástagos son transferidos al medio de enraizamiento Etapa IV Transferencia al suelo
shoot differentiation from leaf tissue plantlets differentiating from root tissue
COMPARISON OF CONVENTIONAL & MICROPROPAGATION OF VIRUS INDEXED REGISTERED RED RASPBERRIES Conventional Micropropagation Duration: 6 years 2 years Labor: Dig & replant every 2 years; Subculture every 4 weeks; unskilled (Inexpensive) skilled (more expensive) Space: More, but less expensive (field) Less, but more expensive (laboratory) Required to prevent viral Screening, fumigation, spraying None infection:
Características de la Micropropagación Sistema de reproducción clonal La etapa de multiplicación se puede repetir de manera de llegar a un número ilimitado de clones Se simplifica el manipuleo de los ciclos productivos Independencia estacional y ambiental Posibilidad de producción de plantas libres de enfermedades (libres de virus)
Inconvenientes * Desarrollo asincrónico * Vitrificación (hiperhidración, aspecto vidrioso de los tejidos, los desórdenes fisiológicos que genera permiten el crecimiento y multiplicación pero no el enraizamiento) * Contaminación crónica * Problemas en el enraizamiento * Variaciones genéticas