Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Odontología Área Básica Curso de Histología DOCUMENTO DE APOYO EL MICROSCOPIO La Histología, término derivado de las raíces griegas histos, que significa tejidos, y logos, que significa estudio o conocimiento de, significa literalmente ciencia o conocimiento de los tejidos, tanto vegetales como animales. En la actualidad se interpreta como ciencia que estudia la estructura y función de los tejidos, órganos y sistemas del cuerpo humano desde el punto de vista microscópico. Aunque con frecuencia se afirma que el cuerpo está formado por células, es importante comprender que los tejidos corporales contienen otros dos componentes. Si el cuerpo estuviera formado sólo por células, sería demasiado débil para sostener la masa celular. Para resolver este problema, las células de uno de los tejidos básicos, el Tejido Conectivo, elaboran varias clases de sustancias intercelulares, sin vida, pero no inertes. Además, para conservar su vida y actividad funcional, las células deben tener un aporte contínuo tanto de oxígeno, como de sustancias nutritivas, así como un método para eliminar sus productos tóxicos de desecho. Esto se logra por los líquidos corporales, que incluyen la sangre, que circula en el sistema vascular sanguíneo, y otros líquidos. Por lo tanto, los tres componentes de los tejidos del cuerpo son las células, las sustancias intercelulares y los líquidos corporales. Microscopio El microscopio es una máquina mecánica y óptica que sirve de instrumento para observar estructuras que no son visibles facilmente a simple vista. Se usa como instrumento indispensable en el estudio de la Histología, por lo cual se mencionarán algunas de sus características generales y funcionamiento básico con el fin de utilizarlo correcta y eficazmente en el laboratorio. Básicamente se pueden clasificar por el tipo de fuente luminosa que usan. El de uso más frecuente es el microscopio óptico que utiliza luz visible y es con el que se cuenta en el laboratorio. Entre las modificaciones de este tipo están los microscopios de luz polarizada, de contraste de fases, de interferencia y de campo oscuro. Los otros tipos de microscopios que utilizan luz invisible están el de luz ultravioleta y el electrónico. La utilidad de cualquier tipo de microscopio no solo depende de su capacidad de aumento, sino de su capaciadad para resolver detalles o resolución. Más allá de ciertos límites, el aumento no agrega nuevos detalles. El aumento útil de un microscopio óptico ordinario es de 1,500 veces (1,500 X). El poder de resolución es la medida de la capacidad del microscopio para separar claramente dos puntos que se encuentran muy juntos. Más allá del poder de resolución de cualqueir microscopio, los dos puntos aparecerán como uno solo. La resolución con sistema de lentes está limitada por la longitud de onda de la luz y por la apertura numérica o capadidad de reunión de la luz del objetivo. El poder de resolución de un microscopio óptico bien construido es de alrededor de 0.2 micras. El microscopio óptico de luz actúa como un mecanismo de ampliación en dos etapas. La lente del objetivo proporciona el aumento inicial, y la lente ocular se coloca de tal manera que amplifica la imagen primaria por segunda vez. El aumento total se tiene multiplicando el poder de ampliación del objetivo por el del ocular. Normalmente se emplea una lente condensdora adicional bajo la platina del microscopio para concentrar la luz de la fuente en un haz muy brillante que ilumina el objeto, proporcionando así la luz suficiente para el examen de la imangen ampliada. Aunque la lente condensadora no contribuye al aumento total, influye en la calidad de la imagen observada. Estructura y manejo del microscopio óptico
Las partes esenciales que componen un microscopio óptico son: a. oculares b. revolver c. objetivos d. platina e. tornillos para desplazar la preparación sobre la platina en sentido longitudinal y transversal f. condensador g. tornillo macrométrico h. tornillo micrométrico i. diafragma iris j. tornillo para regular la altura del condensador k. interruptor l. regulador de la intensidad de luz m. pinzas para ajustar la preparación sobre la platina n. pie o soporte Parte mecánica - Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en él se encuentra la fuente de iluminación. - Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el portaobjetos con la preparación, y unas escalas que ayudan a conocer qué parte de la muestra se está observando. La platina presenta 2 tornillos, generalmente situados en la parte inferior de la misma, que permiten desplazar la preparación sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal respectivamente. - Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de oculares y objetivos. - Revólver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos. - Brazo o asa: une el tubo a la platina. Lugar por el que se debe tomat el microscopio para trasladarlo de lugar. - Tornillo macrométrico o de enfoque grosero: sirve para obtener un primer enfoque de la muestra al utilizrse el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma perceptible. - Tornillo micrométrico o de enfoque fino: sirve para un enfoque preciso de la muestra, una vez que se ha realizado el enfoque con el macrométrico. También desplaza verticalmente la platina, pero de forma prácticamente imperceptible. Es el único tornillo de enfoque que se utiliza, una vez realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor aumento. Parte óptica - Oculares: son los sistemas de lentes más cercanos al ojo del observador, situados en la parte superior del microscopio. Son cilindros huecos provistos de lentes convergentes cuyo aumento se reseña en la parte
superior de los mismos (normalmente 10X en los microscopios que se utilizarán en esta práctica). Dependiendo de que exista uno o dos oculares, los microscopios pueden se mono o binoculares. - Objetivos: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la parte inferior del tubo, mediante el revólver. En esta estructura se pueden acoplar varios objetivos (ordenados de forma creciente según sus aumentos, en el sentido de las agujas el reloj). Un anillo coloreado es distintivo de los aumentos de cada objetivo, que también van reseñados en el lateral del mismo. Algunos objetivos no enfocan bien la preparación al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersión (normalmente van marcados con un anillo blanco). - Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los concentra sobre la preparación, de manera que proporciona mayor o menos contraste. Se regula en altura mediante un tornillo (letra J de la figura). - Fuente de iluminación: en los microscopios a utilizar, el aparato de iluminación está constituido por una lámpara halógena de bajo voltaje (12V) situada en el pie del microscopio. La luz procedente de la bombilla pasa por un reflector que envía los rayos luminosos hacia la platina. - Diafragma o iris: sobre el reflector de la fuente de iluminación. Abriéndolo o cerrándolo permite graduar la intensidad de la luz. - Transformador: ya que el voltaje de la bombilla es menor que el de la red, es necesario para enchufar el microscopio. Algunos modelos ya lo llevan incorporado en el pie del microscopio. Además, el transformador dispone de un potenciómetro para regular la intensidad de la luz. Montaje y enfoque de una preparación microscópica Antes de observar la preparación al microscopio, esta debe de ser montada sobre vidrio. Para ello existen dos piezas de vidrio denominadas portaobjetos (porta), que, como su nombre indica, es el soporte sobre el que va la muestra, y cubreobjetos (cubre) que siempre ha de colocarse sobre la muestra. Consejos prácticos - Revise que el microscopio esté conectado a una fuente de poder confiable y estable. - Se debe mantener apagada la luz del microscopio siempre que no se esté utilizando, ya que la vida media de la bombilla es corta. - Siempre se debe comenzar el enfoque con el objetivo de menor aumento. - Anotar siempre el número de aumentos con el que se observa la preparación. Para calcularlo basta multiplicar el número de aumentos del objetivo por el de los oculares. Hacer esquemas y dibujos de lo observado con cada aumento. - Si utiliza el aceite de inmersión (solamente para el objetivo de 100X), debe asegurarse de utilizar solamente el aceite proporcionado por los docentes, y al finalizar la práctica limpiar apropiadamente el lente con un paño especial o papel limpia lentes y xilol. Si después de observar la muestra con aceite de inmersión desea volver a verla con un lente de menor aumento deberá eliminar todos los residuos de aceite de la laminilla antes de cambiar el lente objetivo. TÉCNICA HISTOLÓGICA El objetivo de la Técnica Histológica es la preparación, apropiada de los distintos tejidos y órganos para su observación y estudio microscópico. Esta técnica consiste una serie de pasos que son:
1. Obtención de la pieza 2. Fijación 3. Deshidratación 4. Aclaración 5. Inclusión 6. Corte o Microtomía 7. Coloración 8. Montaje OBTENCIÓN DE LA PIEZA.- Como primer paso, en cualquier Técnica Histológica e Histopatológica es tener la pieza que vayamos a estudiar, ya sea riñon, piel, hígado, cerebro, etc. Se puede obtener de distintas maneras. Una de ellas es con el animal vivo, o sea, al momento de una cirugía, se efectúa una biopsia del órgano que deseemos estudiar. Otra manera es la toma de la muestra con la necropsia del recién muerto, o a las pocas horas de fallecido. Esto se aplica en histopatología. Una vez tomada la pieza histológica, debemos evitar el proceso de destrucción y putrefacción celular que ocurra en éstos tejidos, para lo cual nos valemos de ciertas substancias químicas que sabemos evitan ésta destrucción. Esto en el caso de la histología normal, es con el propósito de estudiar los tejidos con toda su estructura normal, con el mínimo de cambios microscópicos. Por lo que pasamos al siguiente paso: FIJACIÓN.- Los líquidos utilizados suspenden todas las actividades vitales de las células, evitando al máximo cualquier cambio en su estructura y morfología, a fin de no falsear su interpretación, manteniendo por lo tanto las células con los caracteres que tenían en vida. Para ésto los fijadores deben llenar ciertos requisitos: 1.- Rapidez de acción- es decir, debe actuar inmediatamente, y evitar las retracciones y contracciones, para que no se alteren las formas de las células. 2.- Poder de penetración es decir, que fije tanto las capas superficiales como las más profundas. 3.- Conservar al máximo las características estructurales que las células presentaban en vivo. 4.- Favorecer o permitir los pasos ulteriores para su observación (microtomía, valoración, etc.). 5.- No provocar la aparición de fallas artificiales o artefactos. 6.- No endurecer demasiado los tejidos ni tornarlos quebradizos. Los fijadores, desde el punto de su composición química pueden ser: simples cuando es solo una substancia y compuestos ó mezclas cuando son varias substancias. Los fijadores más utilizados son los simples, y de ellos el más comúnmente utilizado es el formaldehído (formol), ya sea al 4 ó al 10 %. La fijación se obtiene en un plazo que varía de 1-4 días, de acuerdo al tamaño de la pieza. Una vez fijadas las piezas, éstas están embebidas en agua lo que impide que sean penetradas por la parafina, ya que no es miscible en agua. Para que la parafina penetre en los tejidos es imprescindible, eliminar el agua de los tejidos o dicho de otra manera: deshidratarlos. DESHIDRATACIÓN.- La deshidratación la obtenemos sumergiendo los tejidos en substancias anhidras. Para este fin se utiliza alcohol. Ahora bien, se deben colocar las piezas en alcohol de menor (70 ) a mayor (100 ) concentración, con un intervalo de 3 horas en cada incremento de 10 para evitar una deshidratación brusca. Una vez terminada la deshidratación se procede al siguiente paso.
ACLARACIÓN.- Se sumergen las piezas en toluol o xilol con el fin de eliminar los residuos de alcohol que pueden permanecer en el tejido. La substancia más comúnmente utilizada es el xilol. Después que la pieza ha sido fijada, deshidratada y aclarada se le efectúa la Inclusión. INCLUSIÓN: Este paso tiene como finalidad darle solidez a la textura de los tejidos, incluyendo una substancia sólida en el interior de los mismos, que sirva de sostén a los elementos anatómicos y que a su vez se preste para ser seccionada en cortes muy delgados. La substancia más utilizada es la parafina. Esta parafina se funde y luego se procede a colocar la pieza en estudio en un pequeño vaso de plástico, en el cual se vierte la parafina, en estado líquido. Se coloca este vaso posteriormente en un refrigerador o bajo agua helada con el fin de que se solidifique. Dando como resultado un bloque de parafina. Ya solidificada se retira del vaso y se procede a quitar el excedente de parafina con un bisturí hasta obtener un pequeño bloque de forma más o menos cuadrilátera. La parte del bloque de parafina que no contenga la pieza se une o adhiere a una base para poder colocarlo en el microtomo y así proceder al siguiente paso. CORTE O MICROTOMIA.- Es el paso mediante el cual se obtienen cortes sumamente delgados de la pieza de inclusión. Esto se efectúa por medio de un aparato llamado microtomo. Hay varios tipos en el mercado; los más utilizados son los microtomos para piezas en parafina y los microtomos para corte en congelación. De éstos dos a su vez, el más empleado en Histología es el microtomo para piezas en parafina de cuchilla fija y bloque móvil. Una vez efectuada la microtomía, se obtiene una tira larga de parafina, la cual contiene en su interior los cortes de la pieza en estudio con un diámetro promedio de 3 a 5 micras. Se coloca una parte de ésta tira en una estufa de baño maría, que contiene agua a una temperatura más o menos tibia y se procede enseguida a colocar un trozo sobre cubreobjetos, para pasar al siguiente paso el cual es: Coloración. COLORACIÓN O TINCIÓN.- Se llama coloración al procedimiento mediante el cual se tiñen las preparaciones histológicas, fundándose en la afinidad que para determinados agentes colorantes poseen los diversos componentes de la célula y substancias intercelulares, siendo indispensable que nos se destiñen con un lavado ulterior efectuado con el disolvente empleado para preparar la solución. El término de agente colorante es utilizado en un amplio sentido, e incluye a todas las substancias que son capaces de combinarse con los tejidos y mejorar la visibilidad de sus componentes al impartirles color, siendo necesario que no tiñan difusamente por igual a los componentes de un preparado, sino que se fije selectivamente en determinados elementos en forma constante y regular. Desde el punto de vista químico, los colorantes se dividen en: Ácidos, básicos y neutros. Los colorantes ácidos son sales cuya base es incolora y produce iones de hidrógeno, y el ácido es colorante, como la Eosina, la propiedad colorante es debida al ácido eosínico y no a la base de sodio que es incolora. Los colorantes ácidos tienen afinidad especial por el citoplasmo, por lo que se dice que es acidófilo (el citoplasma posee sales básicas por lo que capta las substancias acidas). Los colorantes básicos poseen la base colorante y el ácido incoloro produciendo iones hidróxido. Los colorantes básicos se fijan de preferencia al núcleo, por lo que se dice que el núcleo es basófilo (el núcleo posee ácido desoxirribonucleico por lo que capta las substancias básicas). Los colorantes neutros, son mezclas en proporciones convenientes de colorantes ácidos y básicos, tanto uno como otro tienen propiedades de colorear fijándose selectivamente el ácido en el citoplasma y la base en el núcleo. Habiendo colocado el corte en el portaobjetos, se colocan varios de estos en una canastilla y se procede a introducirlos en una serie de recipientes de vidrio de los cuales contiene varios reactivos, entre ellos los colorantes (por ejemplo hematoxilina y eosina) por un tiempo determinado de acuerdo a un protocolo ya establecido. MONTAJE.- Este paso consiste en colocar sobre el corte, un cubreobjetos bien limpio con una gota del medio de
montaje, evitando que se formen burbujas de aire, el medio de montaje más frecuentemente utilizado es el Bálsamo de Canadá. Se deja secar el bálsamo y ya está lista la preparación para ser observada. OBSERVACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA: Para facilitar el trabajo en el laboratorio se les recomienda: 1) Observar la muestra en la laminilla o portaobjetos y tratar de identificar las estructuras más llamativas (presencia de cápsula, conductos, demasiada uniformidad entre otros), así como si la muestra está limpia de polvo o aceite. 2) Colocar la laminilla en el microscopio y observarla con las lentes de menor aumento. Recorrer toda la extensión del corte y seleccionar la porción que se estudiará con mayor detalle. 3) Identificar las principales células observando su núcleo, citoplasma, material extracelular, espacios o cavidades propias del tejido o producidas como artefactos (defectos indeseables producidos durante el proceso de preparación histológica) 4) Describir la muestra tomando en cuenta: a) color b) forma del tejido c) forma y características celulares d) dirección y sentido de las fibras o sustancia extracelular observada e) zonas de mayor iluminación f) Zonas de mayor densidad g) Tubos, conductos o hallazgos importantes describiendo la estructura que les dio origen. h) Agrupaciones celulares. i) Diversidad u homogenidad de la muestra. j) Presencia de capas k) Domio apical o presencia de estructuras especiales en la superficie l) Debe omitirse la descripción de los artefactos. Artefactos: Hay que comprender que no todos los cortes son perfectos. Debido a esto las preparaciones pueden presentar alteraciones producidads por la manipulación o tinción. Estas alteraciones reciben el nombre de artefactos y pueden ser principalmente: Encogimiento: producido por las sustancias químicas con las que se fijan los tejidos. Precipitados: Si el fijador se amortigua de manera inadecuada o no se quita a la perfección de los tejiso, sus cristales pueden precipitar y permanecer en la muestra. Pliegues y arrugas: Los cortes son tan delgados que con frecuencia se pliegan o se arrugan al hacerse el corte o al colocarlos en las laminillas. Generalmente aparecen en color más oscuro, y de manera lineal. Defectos en la cuchilla del micrótomo: Si el filo está mellado, esto crea defectos que aparecen como líneas rectas de color pálido a través de la muestra. Manejo poco cuidadoso: El manejo poco cuidadoso del tejido fresco al extirparlo puede producir pellizcamiento por pinzas o el aplastamiento por tijeras desafilads o mutilación del mismo. Degeneración postmortem: cuando no se ha preservado la muestra correctamente o se obtiene de un cadaven con avanzado estado degenerativo.