FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA ELS BACTERIÒFAGS COM A MODEL PER A L ESTUDI DELS VIRUS 3 de febrer de 2010
El taller mostrarà com es poden utilitzar els bacteriòfags per comprendre els cicles dels virus, com es pot detectar la presència de virus per mètodes de cultiu i el seu paper immunològic. Responsables Montserrat Llagostera Casas María Pilar Cortés Garmendia Professorat Carlota Bardina Fons Joan Domingo Espin Denis Spricigo Joaquim Seras Franzoso Gloria Vicuña Giraldo 2
RESUM Els bacteriòfags són virus que infecten, únicament, cèl lules bacterianes. Estan formats per una càpside proteica que embolcalla el material genètic, el qual pot ser ssrna, dsrna, ssdna o dsdna, en format lineal o bé circular. 3
Es coneixen dos tipus de bacteriòfags: els virulents (o lítics) i els temperats (o moderats). Quan infecten una cèl lula, els primers sempre realitzen un cicle lític, mentre que els segons poden realitzar un cicle lític o un cicle lisogènic. Tot procés infectiu generat per un bacteriòfag s inicia a través dels següents passos : 4
Un cop el bacteriòfag ha injectat el seu material genètic a l interior de la cèl lula bacteriana, els fags virulents realitzen un cicle lític en el qual el material genètic es replica a l interior cel lular i un cop forma els virions complets destrueix la cèl lula per lisi, alliberant-se així els nous virions formats. En canvi, els fags temperats poden lisar la cèl lula a l igual que els virulents o bé inserir el seu cromosoma en el cromosoma bacterià, donant lloc a una cèl lula anomenada lisogènica. El fag integrat en el cromosoma bacterià rep el nom de profag. 5
EFECTE DE LA INFECCIÓ DE BACTERIÒFAGS VIRULENTS O TEMPERATS Problema: Has de determinar si el bacteriòfag usat en la infecció de Salmonella enterica Typhimurium és virulent o temperat. Protocol: 1.- Fer una sembra (dilució 1/100) d un cultiu de nit. 2.- Deixar créixer durant 2 hores a 37ºC, per tal de tenir el cultiu a l inici de la fase exponencial. 3.- Infectar el cultiu bacterià amb el bacteriòfag a una MOI de 1 (la MOI és la multiplicitat d infecció; relaciona el nombre de partícules fàgiques amb el nombre de cèl lules bacterianes) 4.- Prendre mostres d 1 ml de cultiu cada mitja hora i llegir-ne la seva densitat òptica (DO) a una longitud d ona de 550 nm. RESULTATS: Omple la taula amb les teves dades i digues com és el bacteriòfag amb el que has treballat. Temps (min) Control Fag 1 Fag2 0 120 (0) 150 (30) 180 (60) 210 (90) 6
Exemple de resultats esperats 10 Infecció sobre LT2 1 DO (Abs 550) 0,1 Control Fag1 Fag2 0,01 0,001 0 50 100 150 200 250 Temps (min) Cinètica d infecció de dos bacteriòfags diferents (temperat i virulent) d un cultiu de Salmonella enterica sv Typhimurium. TITULACIÓ D UN LISAT VÍRIC Problema: Calcula la concentració del lisat d un bacteriòfag a partir de les plaques de cultiu que et donarà el professorat. RESULTATS: 1. Comptar les unitats formadores de calba (pfu): 2. Calcular la concentració tenint en compte la dilució sembrada i el volum de mostra sembrat. Pfu/ml = nº de calbes / (volum sembrat x factor de dilució acumulat) 7
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) L ELISA és una tècnica bioquímica utilitzada per detectar la presència d antígens o anticossos en una mostra. En l estudi dels virus és una tècnica que permet detectar la presència d aquestes entitats en diverses mostres (detecció de l antigen) o bé la presència d anticossos en organismes infectats per aquests virus (detecció de l anticòs). 8
Problema: S han immunitzat tres animals amb tres antígens virals diferents. S ha de determinar quin antígen genera una major resposta immunològica. Protocol: 1. Dipositar 100 l d antigen (P22 1/50) o tampó carbonat. 2. Mantenir-ho 24 h a 4ºC. 3. Eliminar l antigen. 4. Rentar 3 cops amb 100 l PBST. 5. Saturar els pouets amb 200 l de PBSTM (1 h a temperatura ambient). 6. Eliminar l excés. 7. Rentar 3 cops amb 100 l PBST. 8. Eliminar l excés. 9. Afegir el primer anticòs fent dilucions seriades. 10. Mantenir-ho 24 h a 4ºC. 11. Rentar 3 cops amb 100 l PBST. 12. Afegir el segon anticòs 1/4000 (1 h a temperatura ambient). 13. Eliminar l excés. 14. Rentar 3 cops amb 100 l PBST. 15. Afegir 100 l de revelador (incubar 5-10 minuts a temperatura ambient). 16. Aturar la reacció amb 100 l de SDS 1%. 17. Llegir a 405nm. 9
10
Resultats En realitzar el protocol anterior s han obtingut els següents resultats. El títol d un anticòs s expressa com la dilució d anticòs que dóna la meitat de la màxima senyal. Calcula el títol de cada anticòs i digues quin antigen produeix una major resposta antigènica. 11