XIX National Congress of Biochemical Engineering VIII International Congress of Biochemical Engineering XII Biomedicine and Biotechnology Scientific Meetings Clave: PNT125ALD20140116 Actividad insecticida de Heliopsis longipes A. Gray Blake contra el vector del dengue, Aedes aegypti Alejandro Hernández-Morales 1, Jackeline Lizzeta Arvizu-Gómez 2, Jorge Molina-Torres 3, Blanca Estela Gómez-Luna 4, Brenda Alvarado-Sánchez 1, María Luisa Carrillo-Inungaray 1, Abigail Reyes- Munguía 1. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES 1 Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Romualdo del Campo 501, Fraccionamiento Rafael Curiel, CP 79060. Cd. Valles, S.L.P. 2 Universidad Autónoma de Nayarit. 3 Departamento de Ingeniería Agroindustrial, División de Ciencias de la Salud e Ingenierías, Campus Celaya-Salvatierra, Universidad de Guanajuato. Prolongación Río Lerma S/N, Colonia Suiza, C. P. 38060, Celaya Guanajuato, México. 4 Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN Unidad Irapuato. Km 9.6 Libramiento Norte Carretera Irapuato-León, C. P. 36821, Irapuato Guanajuato, México. CORREO ELECTRÓNICO aldolasa@yahoo.com.mx
INTRODUCCIÓN Los mosquitos constituyen un problema de salud pública debido a que actúan como vectores para la transmisión de enfermedades infecciosas como el dengue. Además, son plaga causante de respuestas alérgicas como reacción cutánea local y reacciones sistémicas como angioedema y urticaria en los seres humanos 1. Las estrategias para el control del dengue consisten en la aplicación de insecticidas químicos, organofosforados y piretroides, los cuales son aplicados en los criaderos de mosquitos para disminuir la población del insecto-vector. Sin embargo el uso continuo de éstos químicos ha ocasionado el desarrollo de resistencia en los mosquitos, además de riesgos para la salud del hombre y daño para el medio ambiente; lo cual dificulta el control del vector y conlleva a la recurrencia de la enfermedad. Por estas razones es necesario explorar otras alternativas para controlar los insectos, minimizando los efectos adversos en el medio ambiente 2,3. Las plantas representan una excelente alternativa para la búsqueda de insecticidas de mayor eficacia, rentabilidad y amabilidad con el medio ambiente; debido a que constituyen una fuente importante de compuestos bioactivos, algunos de los cuales se ha demostrado que pueden actuar como insecticidas contra los estadíos larvario y adulto de los mosquitos; o bien como insectistáticos, inhibiendo el desarrollo normal de los insectos. H. longipes es una planta cuyas raíces han sido utilizadas debido a su potencial insecticida contra la mosca doméstica, cucaracha e insectos plaga, ejerciendo efectos tóxicos y paralizantes, semejantes a los observados con las piretrinas 4. Las propiedades insecticidas de esta planta, son atribuidas a una molécula denominada afinina, una alcamida formada por un ácido graso de 10 átomos de carbonos, con tres insaturaciones (2E,6Z,8E), unido a una isobutilamida. Se ha sugerido que las insaturaciones presentes en esta molécula desempeñan un papel importante en la actividad insecticida. En base a estos antecedentes se evaluó el efecto insecticida de H. longipes contra A. aegypti, así como la importancia de las insaturaciones 6Z,8E de la afinina.
OBJETIVOS Determinar el efecto insecticida del extracto etanólico de H. longipes, afinina, N-isobutil-2E-decenamida y N-isobutildecanamida contra A aegypti. MATERIALES Y MÉTODOS Se colectaron raíces de H. longipes, las cuales fueron trituradas y maceradas en etanol absoluto durante una semana. El macerado se concentró a sequedad hasta obtener un extracto amarillo, el cual se disolvió en etanol y fue cuantificado por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM). El extracto obtenido fue fraccionado mediante cromatografía en columna utilizando como eluyente Hexano: Acetato de Etilo (Hex:AcoET) y sílica gel 200 como fase estacionaria. La fracción eluida con el sistema 70:30 Hex:AcoET fue identificada como afinina, y posteriormente fue purificada mediante cromatografía en capa fina (CCF) y cuantificada por CG-EM. La afinina purificada se saturó, a 80ºC, con hidrógeno utilizando óxido de platino como catalizador. La reducción catalítica se llevó a cabo durante 3 minutos para obtener la N-isobutil-2E-decenamida, molécula que fue purificada mediante CCF con AgNO3 para eliminar otros intermediarios en la reacción. Para la obtención de la N-isobutil-decanamida, el proceso de hidrogenación se realizó durante 7 minutos y posteriormente se purificó mediante CCF-AgNO3. Las moléculas obtenidas: N-isobutil-2Edecenamida y N-isobutil-decanamida fueron identificadas mediante CG-EM. Para los ensayos de actividad insecticida se evaluaron diferentes concentraciones del extracto etanólico, la afinina y sus moléculas derivadas contra larvas de 3 er estadío larvario de A. aegypti. Como control positivo Themephos y etanol como control negativo. Los tratamientos fueron evaluados a las 48 h, realizando tres réplicas. Los porcentajes de mortalidad se transformaron al arcoseno de la raíz cuadrada para realizar el análisis de varianza. Las diferencias entre los tratamientos se determinaron mediante la Prueba de Tukey (P=0.05). La dosis letal media fue determinada mediante análisis Probit.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para determinar el efecto insecticida de H. longipes, larvas de 3 er estadío larvario de A. aegypti, fueron expuestas a concentraciones crecientes de 0 a 50 ppm de extracto etanólico durante 48 h. Los resultados obtenidos muestran que el extracto etanólico de H. longipes posee actividad larvicida, la cual es dependiente de la concentración. Se obtuvo el 100% de mortalidad de las larvas a una concentración de 7 ppm de extracto etanólico, mientras que la dosis letal media DL50 a 4.07 ppm. Previamente se había demostrado que el extracto etéreo de H. longipes es efectivo contra mosquitos adultos de A. aegypti, causando 100 % de mortalidad cuando es asperjado a una concentración de 25 ppm 5. Esta concentración es más elevada en comparación con la dosis requerida para causar el mismo efecto en larvas del mosquito, sugiriendo que las larvas del 3 er estadío son más susceptibles que el adulto. Estos resultados demuestran la efectividad del extracto etanólico de H. longipes para el control de A. aegypti. La actividad larvicida observada con el extracto etanólico puede ser atribuida a la afinina, la alcamida mayoritaria presente en las raíces y la responsable de los efectos biológicos atribuidos a la planta 5,6. Para determinar el rol de la afinina sobre la actividad larvicida contra A. aegypti. La molécula fue purificada y evaluada. Los resultados muestran que la afinina posee efecto larvicida, el cual es dependiente de la concentración, obteniéndose 100% de mortalidad de las larvas a una dosis de 14 ppm y una DL50 a 7.38 ppm. Los resultados muestran que se requiere mayor cantidad de afinina para observar los mismos efectos del extracto etanólico de H. longipes, lo cual sugiere que el extracto contiene otras moléculas que ejercen efecto sinérgico junto con la alcamida mayoritaria. Por otra parte se ha sugerido que las insaturaciones presentes en la estructura de la afinina desempeñan un papel importante en la actividad biológica de la molécula (Figura 1A). Para determinar la importancia de las insaturaciones de la afinina, la molécula se sometió a reducción catalítica para obtener dos moléculas: la molécula parcialmente reducida, la N-isobutil-2E-decenamida y
la totalmente reducida, la N-isobutildecanamida (Figura 1B, 1C). molécula original, indicando que los dobles enlaces en las posiciones 6Z,8E son indispensables para mantener la actividad larvicida de la afinina (Figura 2). Figura 1. Estructura de las alcamidas evaluadas. A) Afinina B) N-isobutil-2Edecenamida C) N-isobutil-decanamida Se evaluaron diferentes dosis de las moléculas obtenidas a partir de la afinina. Los resultados muestran que 50 ppm de la molécula parcialmente reducida, la N- isobutil-2e-decenamida causa 93% de mortalidad de las larvas, mientras que la DL50 a 36.97 ppm. Respecto a la molécula totalmente reducida, la N-isobutildecanamida no mostró efectos a ninguna de las concentraciones evaluadas. La toxicidad de las moléculas en relación a la afinina muestra que la N-isobutil-2Edecenamida conserva el 20 % de la Figura 2. Actividad larvicida de las alcamidas. A) Afinina B) N-isobutil-2Edecenamida. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos Tukey (P=0.05). En el caso de la N-isobutil-decanamida, que no muestra efecto, sugiere nuevamente la importancia de los dobles enlaces 2E,6Z,8E de la afinina para ejercer el efecto insecticida. Estos resultados actividad larvicida observada con la sugieren la importancia de los dobles
enlaces de la afinina para la actividad insecticida. La importancia de las insaturaciones de la afinina ha sido demostrada para la actividad contra bacterias, observándose que la N-isobutyl- 2E-decenamida incrementa hasta 10 veces la actividad contra Escherichia coli, Erwinia carotovora y Bacillus subtilis, mientras que la N-isobutil-decanamida solo muestra efecto bacteriostático contra B. subtilis 6. En el caso de actividad antimicótica, ninguna de las formas reducidas muestra efecto, demostrando la importancia de las insaturaciones de la afinina 6. CONCLUSIONES H. longipes posee actividad insecticida contra larvas de A. aegypti, siendo la afinina una de las alcamidas bioactivas de esta planta. Además las insaturaciones 2E,6Z,8E de la afinina son indispensables para ejercer el efecto larvicida. Estos resultados muestran el potencial de H. longipes para el control de larvas del mosquito transmisor del dengue. AGRADECIMIENTOS Programa Integral de Fortalecimiento Institucional P/PIFI-2013-24MSU0011E- 15. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Sen-Sung C, Hui-Ting C, Shang-Tzen C, Kun-Hsien T, Wei-June Ch (2003). Bioactivity of selected plant essential oils against the yellow fever mosquito Aedes aegypti larvae. Bioresource Technology 89:99-102. 2. Hay S I, Cox J, Rogers D J, Randolph S E, Stern D I, Shanks G D, Myers M F, Snow R W (2002). Climate change and the resurgence of malaria in the East African highlands. Nature 415:905-909. 3. Maharaj R, Maharaj V, Crouch N R, Bhagwandin N, Folb P I, Pillay P, Gayaram R (2011). Screening for adulticidal bioactivity of South African plants against Anopheles arabiensis. Malaria Journal 10:223. 4. Little E (1948). El chilcuague (Heliopsis longipes). Planta insecticida. Boletín de la Sociedad Botánica de México 7:23-27. 5. Jacobson M (1971). The insaturated isobutilamides. In. Naturally occurring insecticides. Jacobson M and Crosby D G (eds) Marcel Dekker. New York pp. 137-173. 6. Molina-Torres J, Salazar-Cabrera CJ, Armenta-Salinas C, Ramírez-Chávez E. (2004). Fungistatic and bacteriostatic activities of alkamides from Heliopsis longipes roots: Affinin and reduced amides. Journal of Agricultural Food Chemistry 52, 4700-4704.