VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) PARA Escherichia coli.

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1 37 VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) PARA Escherichia coli. A continuación, se muestran los efectos de las concentraciones de extracto de ajo empleadas para la determinación de la CMI de Escherichia coli, se realizaron las pruebas de disco con las respectivas concentraciones de extracto de ajo utilizando etanol como solvente. La zona de inhibición se obtiene por la diferencia de diámetro (in) de papel Whatman impregnado de extracto de ajo con el diámetro de inhibición (in) marcado en cada uno de los agares. Estas concentraciones son aquéllas a las que se obtuvieron zonas de inhibición detectables y medibles, después de 24 horas de incubación a 36ºC. Se realizaron controles utilizando únicamente etanol en el disco, resaltando que, para todos los casos, no se detectó zona de inhibición. En la tabla VIII, se reportan los valores promedio de diámetro de la zona de inhibición, en agar EMB, con estos datos se elaboró la gráfica para la determinación de CMI (Figura 2). Como era de esperarse, al aumentar la concentración de ajo en el extracto, la zona de inhibición aumenta.

2 38 coli. Tabla VIII. CMI-Valores promedio zona de inhibición. Agar EMB. Escherichia Agar EMB Concentración(g ajo/ml) Zona-papel (in) Agar EMB zona-papel (in) concentración (gr/ml) Fig. 2. CMI-Valores promedio zona de inhibición en Agar EMB para Escherichia coli. En la tabla IX, se reportan los valores promedio de la zona de inhibición, en agar CASO, datos con los que se elaboró la gráfica para la determinación de CMI (Figura 3).

3 39 Al igual que en el caso anterior (agar EMB), al aumentar la concentración de ajo en el extracto, la zona de inhibición aumenta. Tabla IX. CMI-Valores promedio zona de inhibición. Agar CASO.Escherichia coli. Agar CASO Concentración Zona-papel (in) Agar CASO zona-papel (in) concentración(gr/ml) Fig. 3. CMI-Valores promedio zona de inhibición. Agar CASO. Escherichia coli. Los resultados muestran que la concentración más pequeña, a la que se obtiene una zona de inhibición es.25 g ajo/ml etanol, es a ésta a la que se le denominará CMI para Escherichia coli.

4 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA LETAL (CML), PARA ESCHERICHIA COLI. Para la determinación de la CML, se realizaron diluciones de los extractos de ajo obtenidos con agua como disolvente. Se realizó el conteo de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml), después de 24 horas de incubación a 36ºC. En la tabla X, se reportan los valores promedio de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro, para la elaboración de la gráfica para la determinación de CML (Figura 4). Tabla X. Concentración- valores promedio UFC/ml. CML E.coli. Concentración UFC/ml

5 41 Concentración mínima letal E.Coli UFC/ml concentración (gr/ml) Fig. 4. Concentración- valores promedio UFC/ml. Determinación CML E.coli. Se encuentra que la Concentración de.25g ajo/ml agua, es la concentración a la cual no se observa crecimiento microbiano, por lo cual, se le denominará como Concentración Mínima Letal. Las sucesivas diluciones, tras 24 horas de incubación a 36ºC, muestran un crecimiento bacteriano considerable, lo que indica, que el extracto de ajo obtenido con agua como disolvente, muestra una alta efectividad a concentraciones mayores. A fin de comparar estos resultados, es necesario realizar el análisis de la respuesta en escala logarítmica, basado en la población bacteriana inicial y el número de microorganismos sobrevivientes (Tabla XI, Figura 5).

6 42 Tabla XI. Concentración crecimiento logarítmico para E. Coli. Concentración log(n/no) Concentración mínima letal E. coli vs log(n/no) log(n/no) concentración (gr/ml) Fig. 5. Concentración crecimiento logarítmico para E. Coli. Se observa que una concentración de.25g de ajo/ml agua, tiene un efecto letal sobre el crecimiento de Escherichia coli, pues no se detectaron sobrevivientes. Concentraciones superiores a.125g ajo/ml agua, tienen un efecto inhibitorio pues el número de sobrevivientes es menor al inicial, sin embargo, se observa que concentraciones menores no

7 43 tienen efecto y promueven el crecimiento bacteriano, resultando en poblaciones mayores a las iniciales DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) PARA Listeria innocua. A continuación, se muestran las concentraciones empleadas para la determinación de la CMI para Listeria innocua, se realizaron las pruebas de disco con las respectivas concentraciones de extracto de ajo utilizando etanol como solvente. Estas concentraciones son aquellas a las que se obtuvieron zonas de inhibición detectables y medibles, después de 24 horas de incubación a 36ºC. De la misma manera, se realizaron controles en lo que se utilizó sólo etanol en el disco, detectando una nula zona de inhibición. En la tabla XII, se reportan los valores promedio de diámetro de zona de inhibición en agar CASO, utilizados para la elaboración de la gráfica para la determinación de CMI de Listeria innocua (Figura 6). Se observa que las concentraciones mayores proporcionan una zona de inhibición mayor.

8 44 Tabla XII. Inhibición-diámetro zona de Inhibición. CMI para L.innocua. Concentración zona-papel(in) Agar CASOY Listeria innocua zona-papel(in) concentración (gr/ml) Fig. 6. Inhibición-diámetro zona de Inhibición. CMI para L.innocua.

9 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA LETAL (CML) PARA Listeria innocua. Para la determinación de la CML, se realizaron diluciones de los extractos de ajo obtenidos con agua como disolvente. Se realizó el conteo de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml), después de 24 horas de incubación a 36ºC. Para la elaboración de la gráfica, se utilizan los valores promedio de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (Figura 7). innocua. Tabla XIII. Concentración-UFC/ml promedio. Determinación de CMI, Listeria concentración UFC/ml

10 46 Concentración mínima letal Listeria innocua UFC/ml concentración (gr/ml) Fig.7. Concentración-UFC/ml promedio. Determinación de CMI, Listeria innocua. La concentración a la que se encuentra que existe un crecimiento bacteriano menor es a.125 g/ml. Esta concentración, es a la que se denominará como Concentración Mínima Letal. Las sucesivas diluciones muestran un crecimiento bacteriano significativo. Es necesario realizar el análisis de la respuesta en escala logarítmica, basada en el número inicial de microorganismos y el número de sobrevivientes. (Tabla XIV, Figura 8).

11 47 Tabla XIV. Concentración-log(N/No). Determinación de CMI, Listeria innocua. Concentración log(n/no) e Concentración mínima letal L.innocua vs log(n/no) log(n/no) concentración(gr/ml) Fig. 8. Concentración- crecimiento logarítmico para Listeria innocua.

12 COMPARACIÓN DE CONCENTRACIONES MÍNIMAS LETALES PARA CADA UNO DE LOS MICROORGANISMOS. Se considera necesario realizar una comparación entre las CML para cada uno de los microorganismos estudiados. Concentración mínima letal comparativa log(n/no) Listeria innocua Escherichia coli concentración Fig. 9. Comparación de CML para cada uno de los microorganismos. En la Figura 9, se observa que la CMLde Escherichia coli,es mayor que la CML de Listeria innocua. Esto se debe a que se trata de bacterias Gram negativa y Gram positiva respectivamente. Cada una de ellas posee una sensibilidad al extracto de ajo diferente.

13 ESTUDIO DE TIEMPO DE EXPOSICIÓN CONTRA UFC/ML SOBREVIVIENTES. ESCHERICHIA COLI. Con el fin de comprobar que la CML encontrada para Escherichia coli, es la adecuada, se realizó un análisis de CML en función del tiempo de exposición, efectuando los correspondientes conteos de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro. Los conteos se realizaron por 72 horas. En la Tabla XV, se reportan los valores promedio de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro, para cada uno de los tiempos de exposición (Figura 1). Tabla XV. CML-tiempo de exposición. UFC/ml (promedio) Escherichia coli. exposición (min) 1día 2 día 3 día

14 5 Conc.min.letal E. coli vs tiempo exposición UFC/ml tiempo exposicion (min) 24 hrs 48 hrs 72 hrs Figura 1. CML de Escherichia coli respecto al tiempo de exposición. Se observa que los tiempos cortos de exposición, resultan poco efectivos para evitar el crecimiento bacteriano. Los mejores resultados se obtienen en los tiempos largos de exposición. Con el fin de comprobar estos resultados, se prolongan los tiempos de observación; los cuales al incrementarse muestran un crecimiento bacteriano significativo.

15 ESTUDIO DE TIEMPO DE EXPOSICIÓN CONTRA UFC/ML SOBREVIVIENTES. LISTERIA INNOCUA. Tomando a la CML encontrada, se recurre al estudio de Tiempo de Exposición, realizando los conteos de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro correspondientes. Para Listeria innocua, el estudio de Tiempo de Exposición, se llevó a cabo con la CML de.125 g/ml, realizando los conteos por 72 horas El estudio de Tiempo de Exposición, se prolongó con el fin de comprobar la efectividad de la CML, los conteos de UFC/ml por 12 horas (Tabla XVI). Tabla XVI. CML- Tiempo de exposición, valores promedio.12 horas. Listeria innocua. 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 12 horas final tiempo (min) caja #m.o #m.o #m.o #m.o #m.o ufc/ml 48 a b c a b c X X X X X 54 a b c a b c a b c a b c

16 52 66 a b c a b c X X X X X X=contaminada Conc. min. letal L.innocua vs tiempo de exposición 25 UFC/ml horas 48 horas 72 horas 96 horas 12 horas Tiempo exposición (min) Fig. 11. CML para Listeria innocua respecto al tiempo de exposición. Se observa que la CML para Listeria innocua, muestra una alta efectividad para tiempos de exposición largos y para las primeras 48 horas de observaciones. Al prolongar el tiempo de observaciones, se encuentra

17 53 que hay un crecimiento bacteriano significativo que comprueba que el extracto de ajo a la concentración seleccionada como CML, funciona como agente bacteriostático.

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