RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Obtención de las Fracciones del Extracto Metanólico Crudo de Aloysia sonorensis

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1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Obtención de las Fracciones del Extracto Metanólico Crudo de Aloysia sonorensis El fraccionamiento se realizó a partir de 1 g del extracto metanólico de A. sonorensis. Se obtuvo un rendimiento del 7% de la fracción hexánica, un 1.4% de la fracción de acetato de etilo, un 6% de la fracción etanólica y un 2% de la fracción residual. Durante la obtención de las fracciones se formaron sólidos que correspondieron al 11.6%, los cuales no se incluyeron debido a que no son afines al solvente con el cual se obtuvieron inicialmente (Tabla I). Evaluación de la Actividad Antiproliferativa de las Distintas Fracciones Sobre la Línea Celular Cancerosa M12.A k.c3f6 Para llevar a cabo la evaluación de la actividad antiproliferativa de cada una de las fracciones sobre la línea celular cancerosa M12.A k.c3f6, se utilizaron cuatro concentraciones: 2 µg/ml, µg/ml, µg/ml y µg/ml. Los resultados de la evaluación de la actividad antiproliferativa mostraron que la fracción hexánica, acetato de etilo y etanólica poseen un efecto antiproliferativo sobre esta línea celular, mientras que la fracción residual no indujo efecto alguno, incluso a una concentración de 2 µg/ml (fig. 2).El análisis estadístico mostró que en la fracción residual no existen diferencias estadísticamente significativas (p>.5) entre las cuatro concentraciones, ni con el control de DMSO (fig. 2). La fracción etanólica causó un efecto dosis-dependiente, donde a una concentración de 2 µg/ml inhibió 67.7% de la proliferación celular, a µg/ml un 52.4%, a µg/ml un 14.1% y a µg/ml no mostró efecto alguno. El análisis estadístico mostró que en las concentraciones de µg/ml, µg/ml y 2 µg/ml hay una proliferación celular diferente, estadísticamente 1

2 Tabla I. Rendimiento del fraccionamiento del extracto metanólico crudo de Aloysia sonorensis. Solvente Fracción seca (g) Rendimiento (%) Hexano.7 7 Acetato de etilo Etanol 6. 6 Residual* 2. 2 Material no incluido *Residuo del extracto metanólico crudo después de todos los lavados. 1 Sólidos no incluidos en las fracciones. 11

3 Residual Etanólica Acetato de etilo Hexánica Figura 2. Porcentaje de viabilidad celular de las distintas fracciones de Aloysia sonorensis sobre la línea celular M12.A k.c3f6. Datos representativos de tres experimentos diferentes. Barras con la misma figura (,,, ) son estadísticamente iguales (p>.5). 12

4 significativa (p<.5) a la del control de DMSO y entre sí (fig. 2). A las 24 h, se observó una disminución de la población celular en las concentraciones de 2 µg/ml, µg/ml y µg/ml en comparación con el control de DMSO y la presencia de una gran cantidad de células con formas alargadas. La presencia de células con esta forma particular dependió de la concentración de la fracción, siendo en la concentración de 2 µg/ml donde se encontró una mayor cantidad de estas células. La fracción de acetato etilo mostró un mayor efecto antiproliferativo. A una concentración de 2 µg/ml se inhibió el % de la proliferación celular, a µg/ml un 78.3% y a µg/ml un 73.5%, pero a µg/ml no mostró efecto alguno. El análisis estadístico de esta fracción indicó que a µg/ml, µg/ml y 2 µg/ml hay una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO. Además, entre las concentraciones de µg/ml y µg/ml no hay diferencia estadísticamente significativa (p>.5) en la proliferación celular (fig. 2). A las 24 h, se encontró a 2 µg/ml una gran cantidad de detrito celular (restos de células muertas), algunas células con formas alargadas y células en estado de suspensión, así como también células con características morfológicas típicas de apoptosis, las cuales son células con núcleo condensado y polarizado hacia un punto, mostrando un citoplasma vacío dando el aspecto de una burbuja de jabón (Wyllie y col., 1984). En la concentración de µg/ml aumentó la cantidad de células con formas alargadas, sin embargo predominaba una población de células en estado de suspensión. Conforme disminuía la concentración se reducía la cantidad de células en los estados antes mencionados y se presentaban células adheridas al pozo (fig. 3). La fracción hexánica resultó tener una actividad antiproliferativa similar a la fracción de acetato de etilo sobre esta línea celular, teniendo una inhibición 13

5 A) B) C) D) Figura 3. Efecto de la fracción de acetato de etilo de Aloysia sonorensis sobre la línea celular M12.A k.c3f6. Las observaciones se llevaron a cabo con un microscopio invertido (1x) a las 24 h de ser tratados con la fracción a distintas concentraciones; (A) DMSO, (B) µg/ml, (C) 2 µg/ml, (D) 2 µg/ml (4x). Flecha negra, células con forma alargada. 14

6 del 97.1% a una concentración de 2 µg/ml, un 8.3% a µg/ml, un 71.1% a µg/ml, a µg/ml no mostró efecto alguno. El análisis estadístico de esta fracción demostró que a µg/ml, µg/ml y 2 µg/ml hay una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO y entre sí (fig. 2). A las 24 h, a 2 µg/ml se observó detrito celular, pocas células en suspensión y mayoritariamente células con una morfología apoptótica. A partir de la concentración de µg/ml apareció un mayor número de células en estado de suspensión y células con formas alargadas y escasas células adheridas. Conforme disminuye la concentración se invierten las proporciones, demostrando un efecto dosis-respuesta (fig. 4). Los resultados demuestran que la actividad antiproliferativa de Aloysia sonorensis, se encuentra en las fracciones menos polares, hexano y acetato de etilo, las cuales se observó una actividad aún mayor a la reportada para el extracto metanólico previamente (Morales, 21), el cual a µg/ml, mostró una inhibición del 37% de la proliferación celular, mientras que las fracciones hexánica y acetato de etilo tuvieron una inhibición del 71.1% y 73.5% respectivamente, indicando que el fraccionamiento mejoró la actividad antiproliferativa de A. sonorensis. Además estas fracciones indujeron distintos efectos, como la suspensión de las células, la cual pudiera explicarse como una pérdida de la adhesión celular y que es uno de los efectos más comunes entre los extractos. Como se había reportado anteriormente, el extracto metanólico de Aloysia sonorensis indujo una morfología de células alargadas sobre la línea celular M12.A k.c3f6 (Morales, 21; Leyva, 21). En los resultados de este trabajo, este comportamiento se observó en las fracciones de hexano y acetato de etilo. Este efecto se puede relacionar con el 15

7 A) B) C) D) Figura 4. Efecto de la fracción hexánica de Aloysia sonorensis sobre la línea celular M12.A k.c3f6. Las observaciones se llevaron a cabo con un microscopio invertido (1x) a las 24 h de ser tratados con la fracción a distintas concentraciones; (A) DMSO, (B) µg/ml, (C) 2 µg/ml, (D) 2 µg/ml (4x). Flecha blanca, célula con morfología apoptótica. Flecha negra, células con forma alargada. 16

8 mecanismo de acción de los compuestos presentes en A. sonorensis, y que estos podrían actuar sobre el proceso de mitosis. Esto ha sido descrito (Hister y col., 29) en el extracto acuoso y el aceite esencial de las hojas de Aloysia gratissima y que inhiben la división celular sobre células de Allium cepa. Otro de los cambios provocado por estas fracciones ha sido la inducción de una morfología típica de apoptosis, en el cual se presentan células con un núcleo condensado y una membrana con forma de burbuja de jabón. Esta característica se ha presentado principalmente en esta línea celular M12.A k.c3f6 a la concentración de 2 µg/ml y hasta el momento no se ha reportado que los compuestos presentes en las especies del género Aloysia induzcan este estado, por lo que es necesario realizar más estudios que comprueben estas observaciones. Evaluación de la Actividad Antiproliferativa de las Distintas Fracciones sobre la Línea Celular Cancerosa HeLa Con el fin de ampliar la evaluación de la actividad antiproliferativa de Aloysia sonorensis, se llevó a cabo la evaluación sobre otra línea celular cancerosa HeLa (Carcinoma cervical humano). Para la evaluación de las distintas fracciones se utilizaron cuatro concentraciones 2 µg/ml, µg/ml, µg/ml, µg/ml. Los resultados de la evaluación de la actividad antiproliferativa demostraron que nuevamente las fracciones principalmente activas fueron, hexano, acetato de etilo y etanol (fig. 5). La fracción residual mostró actividad antiproliferativa sobre esta línea celular solamente en la concentración de 2 µg/ml inhibiendo en un 14.2% la proliferación celular, y estadísticamente demuestra una diferencia significativa de la proliferación celular a la del control de DMSO (fig. 5). Las observaciones realizadas a las 24 h, mostraron que solamente en la 17

9 Residual Etanólica Acetato de etilo Hexánica Figura 5. Porcentaje de viabilidad celular de las distintas fracciones de Aloysia sonorensis sobre la línea celular HeLa. Datos representativos de tres experimentos diferentes. Barras con la misma figura (, ) son estadísticamente iguales (p>.5) 18

10 concentración de 2 µg/ml hubo una disminución de la población celular, en comparación al control de DMSO. La fracción etanólica, tuvo un efecto similar. A 2 µg/ml mostró una inhibición del 54.1% de la proliferación celular, y en las concentraciones de µg/ml, µg/ml y µg/ml no se tuvo efecto alguno sobre la línea celular HeLa. El análisis estadístico de esta fracción indicó que solo a 2 µg/ml hay una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO (fig. 5). En las observaciones a las 24h, se encontró que en la concentración de 2 µg/ml se presentaron algunos cambios morfológicos, como células con formas alargadas, irregulares, una gran cantidad de células en suspensión y detrito celular. Además de que las células se aglomeraban en grandes grupos. La fracción acetato de etilo demostró tener una actividad antiproliferativa muy particular. A una concentración de 2 µg/ml inhibió un 36.8% mientras que a µg/ml un 7.3% de la proliferación celular, a µg/ml y µg/ml no hubo efecto alguno. El análisis estadístico demostró que a 2 µg/ml y µg/ml hay una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO, y entre sí (fig. 5). Las observaciones realizadas a las 24 h, mostraron que en la concentración de 2 µg/ml se encontraba una gran cantidad de células en suspensión y detrito celular, así como algunas células con morfología típica de apoptosis, sin embargo, también se observaba una cierta cantidad de células adheridas. En la concentración de µg/ml, se observó que casi en su totalidad se encontraban las células en suspensión y no presentaban ningún característica particular, simplemente se encontraban suspendidas en el medio, también la cantidad de detrito celular era menor a la de 2 µg/ml. A µg/ml 19

11 y µg/ml no tuvo efecto alguno, las observaciones fueron similares al control de DMSO (fig. 6). La fracción hexánica mostró tener una actividad dosis-dependiente, donde a una concentración de 2 µg/ml inhibió en un 64.2% de la proliferación celular, a µg/ml un 31.7%, y a µg/ml y µg/ml no tuvo actividad alguna. El análisis estadístico demostró que a 2 µg/ml y µg/ml hubo una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO, y entre sí (fig.5). A las 24 h, se observó a 2 µg/ml una gran cantidad de detrito celular, así como células en suspensión y adheridas las cuales presentaban vesículas muy prominentes, algunas células presentaban formas irregulares, y otras presentaban una morfología típica de apoptosis. A una concentración de µg/ml se observaron algunas células en suspensión y multi-vesículas, y que la población de células adheridas es notoriamente mayor a la de 2 µg/ml, en las concentraciones de µg/ml y µg/ml no se mostró diferencia alguna con el control de DMSO (fig. 7). Los resultados demuestran que las fracciones más activas fueron la hexánica, acetato de etilo y etanólica. Sin embargo el efecto de la actividad antiproliferativa se redujo sobre esta línea celular, HeLa, esto pudiera ser debido al diferente nivel de proliferación de estas células, las cuales son de lento crecimiento en comparación con la M12.A k.c3f6. Algunos fármacos antimitóticos como la vinblastina o colchicina, afectan principalmente a las células con mayor proliferación como las células de cáncer (Risinger y col., 29; Clément y Col., 28). Entre las características más importantes que presentaron las fracciones en esta línea celular, resalta la inhibición de la adhesión celular, la cual se presentó principalmente en la fracción de acetato de etilo, donde curiosamente 2

12 A) B) C) D) Figura 6. Efecto de la fracción acetato de etilo de Aloysia sonorensis sobre la línea células HeLa. Las observaciones se llevaron a cabo con un microscopio invertido (1x) a las 24 h de ser tratados con la fracción a distintas concentraciones; (A) DMSO, (B) µg/ml, (C) 2 µg/ml, (D) 2 µg/ml (4x). Flecha blanca, célula con morfología apoptótica. 21

13 A) B) C) D) Figura 7. Efecto de la fracción hexánica de Aloysia sonorensis sobre la línea células HeLa. Las observaciones se llevaron a cabo con un microscopio invertido (1x) a las 24 h de ser tratados con la fracción a distintas concentraciones; (A) DMSO, (B) µg/ml, (C) 2 µg/ml, (D) 2 µg/ml (4x). Flecha blanca, célula con morfología apoptótica. Flecha negra, vesículas. 22

14 mostró ser más activa en una concentración de µg/ml que a una de 2 µg/ml, en las observaciones a las 24 h de aplicar el extracto, la mayoría de las células a µg/ml se encontraban suspendidas. Sin embargo, no se observaba detrito celular, esto pudiera deberse a que a esa concentración solamente inhibe la adhesión celular pero no resulta tóxico para la célula, en cambio a una concentración de 2 µg/ml se apreciaban una gran cantidad de detrito celular, así como células en suspensión y células aglomeradas, estas características de agrupación de las células podría deberse a un efecto de activación celular la cual pudo ser inducida por la alta concentración de compuestos presentes, provocando una menor actividad sobre las células. La fracción hexánica también mostró características muy particulares a altas concentraciones como la presencia de vesículas muy prominentes sobre las células que se encontraban adheridas en la placa, estas vesículas se encontraban principalmente en la periferia de las células. Evaluación de la Actividad Antiproliferativa de las Distintas Fracciones sobre la Línea Celular Normal L-929 Para obtener una evaluación completa de la actividad antiproliferativa, se realizó la evaluación de las fracciones de Aloysia sonorensis sobre una línea celular normal L-929 (fibroblastos del tejido subcutáneo de ratón). La evaluación sobre una línea celular L-929, se realizó para determinar si el efecto no era citotóxico sobre una línea celular normal. Algunos compuestos pueden afectar principalmente a las células cancerosas y en menor grado a las células normales. Sin embargo, hay distintos compuestos, como la colchicina, que no discriminan entre células malignas y benignas. 23

15 Los resultados demostraron que las fracciones hexánica, acetato de etilo y etanólica tienen una actividad antiproliferativa sobre esta línea celular, pero en menor proporción que sobre las líneas cancerosas. La fracción residual no mostró actividad en ninguna de las cuatro concentraciones (fig. 8). La fracción etanólica, produjo un efecto dosis-dependiente donde a las concentraciones de 2 µg/ml se inhibió en un 34% la proliferación celular y a µg/ml un 18.3%. Sin embargo a µg/ml y µg/ml no hubo efecto alguno sobre la proliferación de estas células. El análisis estadístico de los datos nos indicó que a 2 µg/ml y µg/ml hay una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO, y entre si (fig. 8). La fracción de acetato de etilo, provocó una inhibición de la proliferación celular en todas las concentraciones; a µg/ml se inhibió el 34.2%, a µg/ml un 37.4%, a µg/ml un 39.7% y a 2 µg/ml un 67.1%. El análisis estadístico reveló que en las cuatro concentraciones hay una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO, y que entre las concentraciones de µg/ml, µg/ml y µg/ml no existe diferencia entre su proliferación celular (fig. 8 y 9). La fracción hexánica, demostró actividad en las cuatro concentraciones, donde a µg/ml se inhibió en un 27.1% de la proliferación celular, a µg/ml un 28.8%, a µg/ml un 38.2% y a 2 µg/ml se inhibió un 73.1%. El análisis estadístico indicó que en las concentraciones de µg/ml y 2 µg/ml hay una proliferación celular diferente, estadísticamente significativa (p<.5) a la del control de DMSO, y que entre las concentraciones de µg/ml a µg/ml y µg/ml a µg/ml, no existen diferencias significativas, (fig. 8 y 1). Los resultados demuestran que las fracciones activas, hexano y acetato, afectaron a la línea normal L-929, aunque en menor proporción que a las líneas 24

16 Residual Etanólica Acetato de etilo Hexánica Figura 8. Porcentaje de viabilidad celular de las distintas fracciones de Aloysia sonorensis sobre la línea celular L-929. Datos representativos de tres experimentos diferentes. Barras con la misma figura (,,, ) son estadísticamente iguales (p>.5)

17 A) B) C) D) Figura 9. Efecto de la fracción de acetato de etilo de Aloysia sonorensis sobre la línea células L-929. Las observaciones se llevaron a cabo con un microscopio invertido (1x) a las 24 h de ser tratados con la fracción a distintas concentraciones; (A) DMSO, (B) µg/ml, (C) 2 µg/ml, (D) 2 µg/ml (4x). Flecha blanca, vesículas. 26

18 A) B) C) D) Figura 1. Efecto de la fracción hexánica de Aloysia sonorensis sobre la línea células L-929. Las observaciones se llevaron a cabo con un microscopio invertido (1x) a las 24 h de ser tratados con la fracción a distintas concentraciones; (A) DMSO, (B) µg/ml, (C) 2 µg/ml, (D) 2 µg/ml (4x). Flechas negras, células con forma alargada. Flecha blanca, vesículas. 27

19 celulares cancerosas. Mostrando un efecto lineal en las concentraciones de µg/ml, µg/ml y µg/ml, las cuales inhibieron alrededor del 35% de la proliferación celular y a 2 µg/ml alrededor de un 8%, esto en ambas fracciones. Comparando los resultados con las otras líneas celulares, las fracciones menos polares mostraron mayor actividad sobre la línea celular M12.A k.c3f6 seguida por la línea HeLa y por último sobre la línea normal L Estos resultados nos sugiere que los compuestos de las fracciones activas de Aloysia sonorensis, al igual que algunos fármacos antimitóticos, afectan principalmente a las células de proliferación acelerada, y que el mecanismo de acción, aún desconocido, de estas fracciones, produce un bloqueo de la mitosis, llevando a la inducción de apoptosis (Risinger y col., 29). Hasta el momento comparando los resultados de las fracciones entre las distintas líneas celulares, observamos que las fracciones hexánica y acetato de etilo muestran una actividad antiproliferativa muy similar en las cuatro concentraciones probadas, por lo que estas fracciones pudieran compartir compuestos idénticos o muy similares. Para confirmar esto, se realizó una cromatografía en capa fina y se compararon los patrones de bandas presentes en ambas fracciones. Se encontró que ambas fracciones muestran patrones distintos. Sin embargo, comparten una banda que al exponerse a luz UV (λ 365nm) muestra un color amarillo, esta banda pudiera representar al grupo de compuestos que son los responsables de la actividad antiproliferativa de estas fracciones (fig. 11). 28

20 A) H Ac E R B) H Ac E R Figura 11. Cromatografía en capa fina las distintas fracciones de Aloysia sonorensis. Como fase móvil se utilizó hexano y acetato de etilo en relación 3:7. (A) Diagrama del patrón de bandas obtenidas bajo la exposición a luz UV. (B) Cromatofolios expuestos a luz UV. 29