6.1 Germinación y crecimiento de las plantas de N. tabacum en hidroponía y administración de los distintos tratamientos con zinc.

Transcripción

1 6. RESULTADOS 6.1 Germinación y crecimiento de las plantas de N. tabacum en hidroponía y administración de los distintos tratamientos con zinc. Los resultados de estudios sobre la expresión en levaduras de la forma mutada de CAX1 en las cuales la His 338 Ala, generando CAX1cd, indican que las células de levaduras son más tolerantes a los metales pesados (Shigaki et al., 2005). Para poder determinar si la expresión de CAX1cd les confiere a las plantas de N. tabacum fenotipos con una tolerancia a los metales similar a la de las levaduras, las plantas crecieron en presencia de distintas concentraciones de Zn 2+ y se compararon con las silvestres WT y las que presentaban sólo el vector de expresión vacío VEC. Las plantas de N. tabacum (de 4 semanas) se trasladaron a medios de hidroponía con una solución de 1.0 X nutrientes Hoaglands para administrar los distintos tratamientos con o sin la presencia de Zn 2+. A cada contenedor se le asignó un tratamiento con Zn 2+ a distintas concentraciones (no zinc, 250μM, 1 y 2mM). Figura 6.1 Plantas de N. tabacum (WT, VEC, CAX1cd) de 4 semanas, se trasplantaron a hidroponía por 1 semana. Las plantas se colocaron en el mismo contenedor para evitar errores experimentales debidos a la localización del contenedor o diferencias en la evaporación entre contenedores. 23

2 En ausencia de Zn 2+, las plantas que expresaban el transportador CAX1cd fueron indistinguibles de las silvestres. Sin embargo, sorpresivamente las plantas VEC presentaban consistentemente un crecimiento más lento y eran más pequeñas que las plantas silvestres y las CAX1cd bajo todas las concentraciones probadas (Figura 6.2). Después de ser tratadas por dos semanas con Zn 2+ en la figura 6.2 se puedo observar que a bajas concentraciones (250 µm) las plantas WT y CAX1cd crecieron de manera similar. Por otro lado, a mayores concentraciones de Zn 2+ (1 mm) hubo una clara diferencia entre el tamaño de la planta y el color de las hojas de las CAX1cd cuando las comparamos con WT y VEC, ya que las plantas CAX1cd mostraron evidentes aumentos en la biomasa de hojas y raíces. Al ser expuestas a 2 mm zinc aún las plantas que expresan CAX1cd mostraron una reducción en las tasas de crecimiento y en la biomasa de hojas y raíces. En la figura 6.3 podemos observar la comparación entre las hojas de las mismas plantas. Los resultados siguen una tendencia similar a la observada al nivel de la planta completa. Las hojas jóvenes de las plantas que crecieron en ausencia de Zn 2+ son de tamaño similar entre las WT y las que expresan CAX1cd, mientras que las VEC son considerablemente más pequeñas. En presencia de Zn 2+ (250 µm y 1 mm), las hojas de las plantas que expresan CAX1cd son consistentemente más grandes que las silvestres. Hojas maduras de WT y VEC tratadas con 2 mm Zn 2+, mostraron síntomas de clorosis (pérdida de clorofila inducida por estrés) presentando un color amarillento, mientras que las hojas maduras de las plantas transformadas con CAX1cd permanecieron verdes (Figura 6.2). 24

3 WT VEC CAXcd No zinc 250 µm zinc 1 mm zinc 2 mm zinc Figura 6.2 Comparación de crecimiento de las plantas de N. tabacum tratadas con distintas concentraciones de zinc. Plantas de N. tabacum de 4 semanas (WT = silvestre, VEC= vector control y CAX = planta mutante para el transportador AtCAX1) crecieron por 2 semanas en presencia o ausencia de 250 µm, 1 mm y 2 mm de zinc. Las plantas fueron removidas de los contenedores de hidroponía y se fotografiaron digitalmente bajo condiciones idénticas. La regla representa 15 cm. Las fotografías representan 3 experimentos independientes. 25

4 Figura 6.3 Comparación entre hojas jóvenes de las plantas de N. tabacum tratadas con distintas concentraciones de zinc. Plantas de N. tabacum de seis semanas (WT = silvestre, VEC= control vector y CAX = planta mutante para el transportador AtCAX1cd) crecieron durante dos semanas en presencia o ausencia de 250 µm, 1 mm y 2 mm de zinc. Hojas jóvenes (segundas dos hojas de la parte superior de la planta) fueron removidas de las plantas y fotografiadas digitalmente bajo condiciones idénticas. La regla representa 15cm. Las fotos son representativas de tres experimentos independientes. 26

5 6.2 Acumulación de zinc en las hojas de las plantas de Nicotiana tabacum. Para poder determinar si las plantas transformadas con CAX1cd, eran capaces de acumular Zn 2+ a niveles más altos que las silvestres, medimos los niveles de Zn 2+ que se pudieron extraer con ácido sulfosalicílico en hojas jóvenes y maduras de las plantas WT, VEC y las transformadas para CAX1cd que fueron tratadas con concentraciones crecientes de Zn 2+ en el medio. En hojas jóvenes aisladas de las plantas WT, VEC o que expresaban CAX1cd, los niveles de Zn 2+ se incrementan conforme aumenta la concentración en la solución hidropónica, según el tratamiento. Los niveles más altos fueron medidos en las hojas jóvenes de las plantas tratadas con 2mM Zn 2+ durante dos semanas (hasta 189 µmol Zn 2+ g -1 FW) [Figura 6.4]. Las hojas maduras acumularon niveles substancialmente menores en comparación con las hojas jóvenes y los niveles no se incrementaron cuando se aumentó la concentración Zn 2+ de 250 µm hasta 2 mm zinc. Los niveles máximos de Zn 2+ en hojas maduras son de 53 µmol zinc g -1 FW, que es un 28 % del valor obtenido para hojas jóvenes. Sorprendentemente, hubo poca de diferencia entre las distintas líneas de N. tabacum. No se pudieron identificar diferencias significativas entre las plantas WT, VEC o las que expresaban CAX1cd, ya fuera en hojas jóvenes o maduras (Figure 6.3). 27

6 Falta indicar las unidades de Zn 2+ son micromoles? Figura 6.4. Medición de la acumulación de Zn 2+ en hojas de N. tabacum crecidas en hidroponía. Esta gráfica muestra las concentraciones de zinc extraíbles con ácido sulfosalicílico de hojas jóvenes y viejas de las plantas WT, VEC y las que expresan CAX1cd que crecieron durante dos semanas en presencia de 250 µm, 1 y 2 mm ZnSO 4. Las hojas jóvenes se refieren al segundo par de hojas de la parte superior de la planta, mientras que las hojas maduras al segundo par de hojas de la parte inferior de la planta. Los valores representan la media y SD de 3 hojas tomadas de 3 diferentes plantas. 6.3 Análisis del transporte de Zn 2+ acoplado al de protones en vesículas del tonoplasto. En levaduras, la tolerancia incrementada de las células hacia los metales pesados está directamente relacionada con un aumento cuantificable del transporte de Zn 2+ al interior de las vesículas vacuolares de levaduras acoplada al transporte de protones (Shigaki et al., 2005). Este incremento en la actividad de intercambio de metales fue consecuencia del incremento en la afinidad del transportador CAX1cd para el Zn 2+ como se muestra 28

7 en el análisis de la cinética de Michaelis Menten (Shigaki et al., 2005). De manera similar a los experimentos en levaduras, se aislaron y purificaron vesículas del tonoplasto a partir de hojas de plantas de N. tabacum WT, VEC y CAX1cd y se midió el transporte de Zn 2+ dependiente del de protones. La recuperación de la fluorescencia de quinacrina se utilizó para monitorear la disipación del gradiente de ph transmembranal preestablecido (por la activación de la H + -ATPasa vacuolar), seguido por la adición de Zn 2+ (Fig.6.4). La tasa inicial del transporte H + / Zn 2+ fue calculada durante los primeros 100 segundos y los resultados indican que no existen diferencias significativas entre la planta silvestre (WT) y la mutante para el transportador CAX1cd. Figura 6.4 Transporte de zinc dependiente de protones en vesículas del tonoplasto aisladas de los tres tipos de plantas de N. tabacum WT, VEC y CAX1cd. Un gradiente de ph preestablecido (ácido al interior) se generó en las vesículas del tonoplasto previo a la adición del zinc. Se añadió zinc (200 µm) y se midió la recuperación de la fluorescencia de quinacrina durante los primeros 100 seg. en las vesículas de tonoplasto de las distintas líneas (WT rojo, VEC amarillo, CAX1cd azul). Las muestras son representativas de 3 experimentos distintos. Los datos originales se pueden encontrar en el apéndice. Las tasas iniciales del intercambio zinc/protones fueron calculados durante los primeros 100 segundos y se pueden encontrar en la Tabla 1. 29

8 Tabla 1. Tasas iniciales del intercambio zinc/protones calculados durante los primeros 100 segundos en vesículas del tonoplasto de las plantas de N. tabacum. Los valores se expresan en %F min -1 mg proteina -1 y son las medias ±DS de 3 experimentos. Zn 2+ (mm) WT VEC CAX1cd %F min -1 mg proteina ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±