La proteómica para la identificación de moléculas y su interés en salud. Dra. Nardy Diez García Fundación IDEA Proyecto Prometeo

Transcripción

1 La proteómica para la identificación de moléculas y su interés en salud Dra. Nardy Diez García Fundación IDEA Proyecto Prometeo

2 Estudios omics

3 Proteómica Agronomía Parasitología Biomedicina

4 "Conocer el proteoma de un organismo es tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas por ese organismo, en un momento dado y bajo determinadas condiciones concretas de tiempo y ambiente"

5 Flujo de trabajo en Proteómica Preparación de la muestra Identificación Proteína 2D Electroforesis Análisis Imagen pi, PM LC/ESI MS Busque en bases de datos publicas Fingerprint Masas Peptidicas MALDI-MS Picking Digestión Enzimática Spotting

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14 Proyecto Misión Ciencia Distribución geográfica de B. colombiensis (amarillo), asper (verde) y atrox (gris). Tomado de Calvete y colaboradores, 2009.

15 El genero Bothrops comprende entre 32 a 37 serpientes ampliamente distribuidas en América latina desde México hasta Argentina y en Venezuela son ampliamente conocidas como mapanares. Estas serpientes presentan una gran diversidad en cuanto a numero de especies morfología e historia natural Las Bothrops son responsables del 9% de los envenenamientos y en Venezuela B.colombienses es la culpable del 36% de los 5000 casos El veneno de Bothrops induce un cuadro patofisiológico que produce: edemas, hemorragias, necrosis, desfibrinilización, fiebre, shock y nefrotoxicidad

16 Electroforesis 2DE Espectrometría de masas Venómica Electroforesis Multiplex Antivenómica Inmunoproteómica para diseño a la carta de anticuerpos

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21 Electroforesis Multiplex Cy3 Cy5 Cy2 Marcaje Separación en base al pi Separación por Masa molecular

22 Bot 3 Bot 2 Bot 4 Bot 5 Bot 3 Bot 4 Cy3 : Bot3 (505PMT) Bot 5 Bot 4 Bot 5 Total de seis geles Cy5 : Bot2 (485 PMT)

23 Cy2 : STD Pool (480 PMT) Cy3 : Bot3 (505PMT) Cy5 : Bot2 (485 PMT) Cy2/Cy3/Cy5 Cy3/Cy5

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27 506

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29 76 for gi , Phospholipase A2 homolog 1 (Piratoxin-I) (PrTX-I) (Myotoxin SIV-SP5) Jose_12, 1791=4003 Final - Shots Digestor_309; Run #2; Label N (R18471,S1535) (R11360,S445) (R11884,S404) (R18750,S723) (R15116,S232) (R12927,S149) (R11337,S111) (R17725,S202) (R15049,S121) (R14996,S60) (R16428,S60) (R15703,S86) (R16699,S167) (R15155,S46) (R21162,S74) (R14273,S64) (R17801,S120) Mass (m/z)

30 10,53 15,79 15,79 L- amino oxidasa Metaloproteasas 10,53 10,53 36,84 Bothrombina Fosfolipasa A Lectinas Desconocidas

31 Comparación del venoma de Crotalus pifanorum

32 Distribución geográfica de la fauna escorpiónica de importancia médica en Venezuela. Tomado de Borges y colaboradores, 2010.

33 Género y especies de Tityus en Venezuela Hembra macho cata sanare Td Td Tb Tz Td Tb Tz

34 T.d. T.p. T.z.

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36 Búsqueda de moléculas bioactivas en organismos marinos (Convenio Venezuela-Cuba) Condylactis gigantea

37 Caracterización de proteínas y moléculas de interés Condylactis gigantea

38 Toxina CgNa (Ständker et al.,2006; Salceda et al., 2007) Prolongación del potencial de acción en neuronas DGR de ratas Efecto de la sub-fracción sfp-1b de C. gigantea sobre los potenciales de acción en neuronas DGR de ratas. En la figura se muestran los trazos de corriente en ausencia (control) y presencia de la sub-fracción sfp-1b obtenido de la anémona marina C. gigantea (Anémona), registrado durante 10 milisegundos luego de un impulso de 25 mv. La gráfica es representativa de 7 experimentos independientes

39 Espectro de masas de la sub-fracción sfp-1b obtenida C. gigantea. En el análisis se muestra de los dos iones monoisotópicos mayoritarios obtenidos por espectrometría demasas de tipo MALDI-TOF.

40 Efecto de iones divalentes y sus agentes quelantes en el proceso de activación de las proteínas con actividad proteolítica de la fracción FP-2 obtenidas de la anémona marina C. gigantea. 1.- Sin iones añadidos. Solución de activación: 2.- CaCl 2, 3.-NaCl 2, 4.- ZnCl 2, 5.-Todos los iones. B.- Efecto de agentes quelantes de iones divalentes sobre la activación de las proteínas con actividad proteolítica de la fracción FP-2 obtenidos de la especie de anémona marina C. gigantea. Las muestras fueron incubadas a 37 C por 90 min posterior a la corrida en las siguientes condiciones: 1.-Con azul de coomassie, para la condición sin activación. Solución de activación: 2.- Sin iones añadidos, 3.- Todos los iones, 4.- EDTA, 5.- EGTA. Resultados representativo de 2 geles.

41 Caracterización de proteínas y moléculas de interés Cuadro resumen de la actividad citotóxica de los extractos y fracciones obtenidos de la anémona marina Condylactis gigantea sobre la línea celular de cáncer de próstata PC-3. Extracto Fracciones Actividad Citotóxica Extracto Etanólico Total (EET) Extracto Proteico Total (EPT) Extracto Soluble en Etanol (ESE) Extracto Metanólico Total (EMT) Fracción Proteica 1 (FP-1) - Fracción proteica 2 (FP-2) F1-1 + F1-2 + F2-1 + F2-2 + F3-1 + F3-2 +

42 Caracterización de proteínas y moléculas de interés Cromatografía en capa fina de los extractos orgánicos obtenidos de la especie de C. gigantea.

43 Extractos y Fracciones No proteicas de Condylactis gigantea con actividad citotóxica en la línea celular de cáncer de próstata PC-3 Cambios morfológicos de los cultivos de la línea celular de cáncer de próstata PC-3 por efecto de la actividad citotóxica de los extractos y fracciones no proteicas de la especie de anémona marina C. gigantea. A.- Cultivo control. B.-Vehículo: etanol (2.5%). C.- EET (200µg/mL). Concentración máxima evaluada 500 µg/ml de: D.- ESE. E.- F1-1. F.- F1-2. G.- F2-1. H.- F2-2 I.- F3-1. J.- F3-2. El registro fotográfico se realizó a las 24 horas posteriores al tratamiento, en cámara de luz blanca con aumento 10X.

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45 +++: Presencia cuantiosa, ++: Presencia notable, +: Presencia leve, - : ausencia.

46 Callyspongia vaginalis Aplysina fistularis

47 Colaboradores Iván Galindo (Fundación IDEA) Carolina Bernal (Fundación IDEA) Adolfo Borges (UCV) José Faks (Fundación IDEA) Jais Nieves (USB-Fundación IDEA) Viviana Martini (UCV-Fundación IDEA) Orlando Serrano (ULAT-Panamá) Daymile Peréz (Fundación IDEA)

48 Muchas gracias

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