Parasitismo e infestación del nematodo Romanomermis iyengari en larvas del mosquito Culex quinquefasciatus en laboratorio

Parasitismo e infestación del nematodo Romanomermis iyengari en larvas del mosquito Culex quinquefasciatus en laboratorio Gregorio Ambrosio Torres 1, Irma Antonio Méndez 1, Lauro Gasga Pérez 1 y Rafael Pérez Pacheco 2 1 Instituto Tecnológico de Pinotepa. Kilómetro 26. Carretera Pinotepa Nacional, Oax. Acapulco, Gro. San José Estancia Grande, Oax. C. P. 71600. México. E-mail: tec_pinotepa@yahoo.com.mx. CIIDIR-Oaxaca. IPN. Hornos No. 103. Sta. Cruz Xoxocotlán, Oax. C. P. 71230. México. E-mail: rafaelperezpacheco@yahoo.com. Resumen Se evaluó el parasitismo de Romanomermis iyengari en larvas de segundo instar de Culex quinquefasciatus. Se probaron 12 tratamientos, resultantes de combinar tres dosis de nematodos por larva (10, 15 y 20), con cuatro tipos de agua (destilada, de arroyo contaminado, de río y de laguna) colectados en criaderos naturales de mosquitos en Santiago Pinotepa Nacional, Oaxaca; se utilizó un diseño factorial en un arreglo completamente al azar, con cuatro repeticiones, se considero el tipo de agua como factor A y las dosis como factor B. Se realizó el análisis de varianza de los resultados y se compararon las medias mediante la prueba de Tukey ( =0.01). Los porcentajes de parasitismo (PP) obtenidos variaron de 52.5 a 100% y las medias de infestación (MI) variaron de 0.95 nematodos por larva en agua de arroyo contaminado con dosis de 10, hasta 14.02 nematodos por larva en agua de laguna con dosis de 20. Los PP y MI obtenidos, constituyen un indicador del potencial de R. iyengari para utilizarlo como alternativa en el control de C. quinquefasciatus en los criaderos naturales de Pinotepa Nacional, con una dosis de 10:1 o 15:1 nematodos por larva, para reducir el uso de insecticidas químicos y su efecto adverso. Palabras clave: Control biológico, Control de mosquitos, Mermithidae. Abstract The parasitism of Romanomermis iyengari was evaluated on second instar Culex quinquefasciatus larvae. Twelve treatments resultant of to combine three dosages of nematodes (10, 15 and 20 per larva), with four types of water (distilled, of contaminated stream, river and lagoon) collected in natural breeding sites of mosquito larvae in Santiago National Pinotepa, Oaxaca. A factorial experiment was used random completely, with four repetitions, considering the types of water like factor A and the doses as factor B. Analyses of variance of the results were made and compared the averages by means of the Tukey test ( =0.05). The percentage of parasitism (PP) obtained varied from 52.5 to 100%; and the means of infestation (MI) of 0.95 nematodes by larva in water contaminated with dose of 10, and up to 14.02 nematodes by larva in water of lagoon with dose of 20. The obtained PP and MI, constitute an indicator of the potential of R. iyengari to use it as alternative in the control of C. quinquefasciatus in the natural breeding sites of Pinotepa Nacional, applying dose of 10:1 or 15:1 nematodes by larva, to reduce to the chemical insecticide used and its adverse effect. Introducción Key words: Biological control, Mosquito control, Mermithidae. Los mosquitos verdaderos están representados por 2500 especies (Fichter, 1993); de las cuales, la especie Culex quinquefasciatus (Say, 1823) se considera importante, debido a los hábitos hematófagos de las hembras, ya que éstas necesitan alimentarse regularmente de sangre para llevar a cabo la ovogénesis y aumentar la viabilidad de los huevos. Estos causan molestas picaduras que irritan la piel de los humanos, ya sea en el interior de habitaciones de zonas urbanas o, con mayor frecuencia los expuestos totalmente al ambiente natural. C. quinquefasciatus, habita en regiones tropicales y subtropicales y abarca hasta las isotermas de 20 o C (Sabage y Miller, 1995). Abunda principalmente en América y África tropical, Medio y Lejano Oriente, sur de Asia, Nueva Guinea, Australia y el sur de Estados Unidos (Brewer et al., 1987; Almiron et al., 1995). En Bogota, Colombia a temperaturas medias de 14.8 y 15.1 C, humedad relativa del 72,5 y 74,1%, respectivamente, se registraron altos porcentajes de eclosión (83,58%) y emergencia (98,61%) de C. quinquefasciatus lo que indica, el alto grado de adaptación de esta especie. Estas características, más la capacidad vectorial y la resistencia 10

Gregorio Ambrosio Torres, Irma Antonio Méndez, Lauro Gasga Pérez y Rafael Pérez Pacheco a los insecticidas, hacen de esta especie un problema de salud pública (Salazar y Moncada, 2004). En México, las temperaturas medias y humedad relativa en las regiones tropicales y subtropicales coinciden con los datos antes citados; por lo que, los altos índices de eclosión y emergencia son similares y como consecuencia, se considera también un problema de salud pública. La importancia de los nematodos parásitos de insectos y el papel que juegan en la regulación natural, se conoce desde hace muchos años (Garrido, 2003). Actualmente, se conocen 19 familias de nematodos que contienen algunas especies considerados parásitos facultativos u obligados de insectos (Poinar, 1975); de las cuales, la familia Mermithidae, incluye especies que atacan a insectos considerados plagas (Nickle, 1972; Poinar, 1979). El nematodo Romanomermis iyengari (Welch, 1964) es un parásito obligado que pasa parte de su desarrollo en un hospedero vivo (Poinar, 1975); presenta características importantes como agente de control biológico (Petersen y Cupello, 1981), ya que es especifico para larvas de mosquitos, inocuo para el resto de hidrobiontes (invertebrados y vertebrados), no afecta al hombre y no genera resistencia en los mosquitos (Petersen y Willis, 1972). También se ha demostrado su posibilidad de supervivencia en el medio, y se han reportado controles sucesivos de larvas de mosquitos por largos periodos (Petersen y Willis 1975; Santamarina y Pérez, 1997). La producción masiva del nematodo R. iyengari, a gran escala, se puede realizar con materias primas locales, haciéndolo altamente competitivo en comparación con otros métodos desde el punto de vista económico y sustentable; asimismo, su aplicación se puede realizar con aspersoras convencionales y técnicas tradicionales (Pérez et al., 1996). No obstante R. iyengari es una especie poco estudiada a nivel mundial; por lo que es necesario conocer su ciclo biológico y su hábitat con más precisión (Pérez, 2002) así como sus niveles de infestación bajo diferentes condiciones físicas y químicas del ambiente acuático. En un estudio referido a la susceptibilidad de C. quinquefasciatus al nematodo R. iyengari, se determinaron mayores niveles de parasitismo por nematodos en larvas depositadas en agua destilada, respecto a las que estuvieron en agua suavizada, obteniéndose los más altos valores de parasitismo con las dosis 15:1 y 20:1 nematodos por larva (Garrido, 2003). En otra investigación se comprobó que los mayores PP y MI, ocurren en larvas del primero y segundo estadio de desarrollo (Martínez, 1999); al mismo tiempo se observó una relación directamente proporcional entre los niveles de parasitismo e infestación, con respecto a las dosis más altas del nematodo (Martínez, 1999; Garrido, 2003). Por otro lado, se observaron infestaciones con R. iyengari en larvas de C. quinquefasciatus, en concentraciones de cloruro de sodio de 0.00 M (agua destilada) a 0.05 M (2.92 g/l) registrando porcentajes de parasitismo de 100% a 3.3% respectivamente, observándose un brusco descenso del PP a partir de 0.03M (1.75g/l) con 18.33% de PP; y con respecto al efecto del ph registraron PP de 63 a 100% a ph entre 4.5 a 8.0 (Pérez et al., 1999; Hernández, 2004). Aún con los resultados obtenidos en el control biológico de mosquitos, no se ha generado la información suficiente para integrar opciones tecnológicas adaptables a diferentes condiciones ecológicas de México; por lo que, es necesario realizar varias investigaciones básicas y aplicadas. Por estas razones, se realizo un experimento de laboratorio en la Planta de producción masiva de nematodos parásitos ubicada en el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR-IPN-Oaxaca), con el objetivo de conocer el efecto parasítico del nematodo R. iyengari en larvas del segundo instar del mosquito C. quinquefaciatus, con diferentes dosis de nematodos por larva, en distintos tipos de agua, colectados en el municipio de Santiago Pinotepa Nacional, Oaxaca. Materiales y métodos Tratamientos y variables evaluadas. En esta investigación se estudiaron dos factores: a) Tipos de agua (destilada, de arroyo contaminado, río y laguna) y b) Dosis de nematodos (10, 15 y 20 nematodos por larva), que se consideraron niveles en cada factor, que al combinarse dieron como resultado 12 tratamientos; utilizándose un arreglo factorial y un diseño experimental completamente aleatorio, con cuatro repeticiones por tratamiento. Las unidades experimentales fueron charolas de plástico de 21 x 13 x 5 cm que contenían 500 ml de agua, en las que se depositaron 100 larvas del segundo instar del mosquito. El ph del agua utilizada fue de 7.0, 7.57, 7.57 y 6.9 en agua destilada, agua de arroyo contaminado, agua de río y agua de laguna, respectivamente; en tanto, la salinidad fue de 0.0 M, 0.35 M, 0.04 M y 0.02 M, en agua destilada, agua de arroyo contaminado, agua de río y agua de laguna, respectivamente. La temperatura ambiente promedio del agua en las unidades experimentales, durante el día, fue de 22 º C ±4º C. Se efectuó un análisis de varianza a las variables evaluadas Porcentajes de Parasitismo (PP) y Medias de Infestación (MI); las cuales, permitieron conocer el efecto de los dos factores: Tipos de agua (destilada, de arroyo contaminado, río y laguna) y dosis de nematodos (10, 15 y 20 nematodos por larva) y las interacciones entre ellos. Para comparar las diferencias entre medias obtenidas, se realizó la prueba de Tukey con un nivel de significancia = 0.01. 11

Cría masiva de mosquitos. Para iniciar la cría de Culex quinquefasciatus se recolectaron huevecillos, larvas y pupas del insectario del CIIDIR-IPN- Oaxaca. Para su desarrollo, este material biológico se colocó en bandejas de plástico de 47 x 35 x 12 cm, con cuatro litros de agua. Las pupas se recolectaron diariamente y se depositaron en un recipiente de plástico de 24 x 19 x 9 cm, que contenía dos litros de agua, los cuales fueron colocados dentro de una jaula entomológica de 60 x 60 x 60 cm para cuando pasaran a estado adulto, quedaran en el interior de la jaula. Los machos adultos se alimentaron con agua azucarada; mientras que, las hembras se alimentaron con sangre de pollo que se introdujo inmovilizado en la jaula de mosquitos por una noche. Los huevecillos depositados por las hembras en la superficie del agua se recolectaron diariamente, colocándose en bandeja de plástico de 47 x 35 x 12 cm que contenía cuatro litros de agua, para su eclosión. En estas bandejas se desarrollaron las larvas, las cuales fueron mantenidas con alimento utilizado para peces tilapia, agregando cada dos días el alimento previamente molido. Las pupas se colocaron en bandejas con agua que se ubicaron en el interior de jaulas para la emergencia de adultos, repitiéndose el ciclo de vida para disponer continuamente de material biológico para los bioensayos y cría del nematodo (Pérez et al., 1996). Cría masiva de nematodos. Se depositaron cinco balsas (paquetes de huevecillos) de aproximadamente 200 huevecillos de mosquito C. quinquefasciatus en bandejas de plástico de 47 x 35 x 12 cm, las que contenían cuatro litros de agua cada una. Cuando las larvas alcanzaron el segundo instar (de cuatro a cinco días) se infestaron con nematodos preparasíticos (juvenil dos) de R. iyengari, a una dosis de cinco nematodos por larva de mosquito. Los nematodos procedían de cultivos con seis semanas de almacenamiento. Estos cultivos se inundaron con agua destilada para inducir la eclosión de los huevecillos y la emergencia de nematodos preparasíticos infectivos. Cuatro horas después de inundados los cultivos, el agua se decanto, se calculó la concentración de nematodos mediante el método de dilución volumétrica, para determinar el volumen requerido en las infestaciones evaluadas (Petersen y Willis, 1972). Desarrollo del experimento. Se depositaron 500 ml de cada uno de los cuatro tipos de agua evaluados en 48 charolas de plástico color blanco de 21 x 13 x 5 cm, que constituyeron las unidades experimentales, en cada una de estas, se colocaron 100 larvas de segundo instar del mosquito C. quinquefasciatus, siendo un total de 4800 larvas. Para aplicar las dosis evaluadas se aplicaron 3.2 ml de inoculo (nematodos preparasíticos), que corresponde a la dosis de 10 nematodos por larva, 4.8 ml para la dosis de 15 nematodos por larva y 6.5 ml para la dosis de 20 nematodos por larva; las cuales, se calcularon con base en el método de dilución volumétrica propuesto por Petersen y Willis (1972), (Pérez et al. 2004). Resultados y discusión En el cuadro 1, se presenta el análisis de varianza realizado a los datos de las MI, los resultados obtenidos muestran diferencia altamente significativa entre tratamientos, tipos de agua y dosis evaluadas, y en la interacción entre los tipos de agua y las dosis (pd»0.0001); indicando que las MI están determinadas por la dosis aplicada de nematodos, por el tipo de agua y por la interacción que se presenta entre dosis y tipos de agua. CV = 15.13 % Cuadro 1. Análisis de varianza de las MI causadas por diferentes dosis de R. iyengari en diferentes tipos de agua, en larvas del segundo instar de C. quinquefasciatus. Fuentes de Grados de Suma de Cuadrados F F P <F variación libertad cuadrados medios calculada tabular Tratamientos 11 934.66 84.96 69.30 2.8 0.000 Factor A (tipos agua) 3 630.63 210.21 166.81 4.5 0.000 Factor B (dosis) 2 237.54 118.77 94.25 5.3 0.000 Interacción 6 66.48 11.080 8.79 3.4 0.000 Error 36 45.36 1.22 Total 47 980.02 12

Gregorio Ambrosio Torres, Irma Antonio Méndez, Lauro Gasga Pérez y Rafael Pérez Pacheco En el cuadro 2, se muestra el análisis de varianza realizado a los datos de PP que previamente fueron transformados con raíz cuadrada, observándose diferencias altamente significativas entre tipos de agua (pd»0.0001), pero no entre dosis de nematodos y en la interacción entre tipos de agua y dosis, difiriendo a los resultados obtenidos con las MI, debido a que en los tratamientos donde se registraron iguales o similares PP con el análisis estadístico realizado no se permite diferenciar detalles del efecto de los tratamientos, como se observó en las MI que indican el número promedio de nematodos por larva por tratamiento. En los PP y MI causadas por diferentes dosis del nematodo R. iyengari en larvas de segundo instar de C. quinquefasciatus depositadas en diferentes tipos de aguas (Destilada, Arroyo contaminado, Río y Laguna) colectadas en criaderos naturales del municipio de Pinotepa Nacional, Oaxaca, se registraron diferencias altamente significativas (pd»0.001). Los más altos PP y MI observados en agua destilada y agua de laguna indican que los valores de las variables fisicoquímicas de esta agua no presentan efecto negativo en la motilidad y capacidad infectiva de los Cuadro 2. Análisis de varianza de los PP causado por diferentes dosis de R. iyengari en diferentes tipos de agua, en larvas del segundo instar de C. quinquefasciatus. Fuentes de Grados de Suma de Cuadrados F F P<F Variación libertad cuadrados medios calculada tabular Tratamientos 11 12375.00 1125.00 13.72 2.8 Factor A (tipos de agua) 3 11025.00 3675.00 44.84 4.5 0.000 Factor B (dosis) 2 337.50 168.75 2.059 5.3 0.141 Interacción 6 1012.50 168.75 2.059 3.4 0.082 Error 36 2950.00 81.94 Total 47 15325.00 CV = 9.92 % En el cuadro 3, se presentan los PP y MI registradas en los diferentes tratamientos evaluados. En el agua de arroyo contaminado se presentaron los más bajos PP y MI que variaron de 52.5 a 80% y de 0.95 a 1.62 respectivamente. Las MI variaron de 0.95 con la aplicación en dosis de 10:1 en agua de arroyo contaminado a 14.02 nematodos por larva en la dosis de 20:1 en el agua de laguna. Las mayores MI se presentaron en la dosis más alta (20:1) en las aguas destilada (11.45), de río (12.82) y de laguna (14.02) y las menores MI se registraron en las dosis de nematodos en agua de arroyo contaminado. Las comparaciones entre medias, de las MI y PP realizadas mediante la prueba de Tukey (pd»0.01), indicó diferencias altamente significativas entre los promedios registrados por tipo de agua y por dosis evaluadas (Cuadro 3). preparasíticos de R. iyengari similar a lo reportado por Pérez et al. (1999, 2002) y Gajanana et al. (1978), quienes reportan que en aguas que se acercan más a las características del agua destilada la efectividad del nematodo es mayor. Los valores más bajos de parasitismo e infestación, se presentaron en los tratamientos con agua de arroyo contaminado, en las tres dosis de nematodos evaluadas (10, 15 y 20 nematodos por larva); lo que permite inferir que los contaminantes del agua, el ph y las concentraciones de sales, tuvieron efecto adverso en la capacidad de búsqueda y parasítica del nematodo evaluado; lo cual, coincide con los resultados obtenidos por Pérez et al (1999) y Hernández Cuadro 3. Medias de infestación y porcentaje de parasitismo en larvas del segundo instar de C. quinquefasciatus causado por diferentes dosis de R. iyengari en cuatro tipos de agua. Tratamientos. 13 Medias de Infestación Porcentaje de Parasitismo (larvas parasitadas) Tipos de agua Dosis (nematodos/larva) Destilada 10:1 5.18 e* 100 a* Destilada 15:1 8.55 cd* 100 a* Destilada 20:1 11.45 abc* 100 a* De arroyo contaminado 10:1 0.95 f* 52.5 b* De arroyo contaminado 15:1 1.17 f* 57.5 b* De arroyo contaminado 20:1 1.62 f* 80.0 ab* De río 10:1 6.30 de* 100 a* De río 15:1 10.25 bc* 100 a* De río 20:1 12.82 ab* 100 a* De laguna 10:1 5.80 de* 100 a* De laguna 15:1 10.87 abc* 100 a* De laguna 20:1 14.02 a* 100 a* * Valores con letras distintas en la columna son significativamente diferentes según Tukey (pd»0.01).

(2004), quienes concluyen que infestaciones de R. iyengari en C. quinquefasciatus ocurrieron en concentraciones de NaCl entre 0.00 M (agua destilada) y 0.03 M (1.75 g/l), observándose un brusco descenso del PP en concentraciones de 0.05 M (2.72 g/l); mientras que, la tolerancia a valores de ph fue posible entre valores de 3.6 a 8.4, en la misma especie. Información importante fue obtenida en el presente estudio debido a que permite diagnosticar a las dosis de nematodos y tipos de agua en los cuales es factible utilizar a R. iyengari con objeto de reducir la población de larvas de C. quinquefasciatus en Pinotepa Nacional, Oaxaca. Por otra parte, fue posible determinar el tipo de agua más conveniente para reproducir masivamente nematodos parásitos de mosquitos en el área del municipio de Pinotepa. Al mismo tiempo, los resultados indican la importancia que juegan las variables fisicoquímicas del agua en la implementación del control biológico de mosquitos con nematodos parásitos. No obstante, es conveniente continuar las investigaciones para generar la información necesaria para implementar el control biológico de mosquitos, con la dosis y especie de nematodo más adecuada. Conclusión Con la dosis de 15:1 y 20:1 nemátodos por larva, se logró que al menos un nematodo preparasítico de R. iyengari penetre y se desarrolle en larvas del segundo instar de C. quinquefasciatus en agua de arroyo contaminado. Las medias de infestación de R. iyengari en larvas de C. quinquefasciatus resultaron significativamente diferentes al incrementarse las dosis, en los diferentes tipos de agua evaluados; por lo tanto, R. iyengari es una alternativa ecológica viable para ser utilizada en un programa de manejo integrado de C. quinquefasciatus. Literatura citada Almiron, W. R., S. G. Humeres y S. N. Gardenal. 1995. Distribution and hibridization between Culex pipiens and Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) in Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz. 90: 469-73. Brewer, M., L. Bufa y W. 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