MECANISMOS DE DEFENSA NATURAL DE LAS PLANTAS. EL CULTIVO ECOLÓGICO FRENTE AL CONVENCIONAL F.M. del Amor, J. Navarro, J.M. Gambín, G. Ortuño, C. Palao Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA). C/Mayor s/n. 30150 Murcia. E-mail: franciscom.delamor@carm.es RESUMEN Como consecuencia de los diferentes métodos y técnicas de cultivo empleadas en horticultura, las plantas están sometidas a una gran variedad de respuestas fruto de la interacción planta-parásito. El hospedante puede responder de varias formas entre las que se encuentra la producción de fitoalexinas. Las fitoalexinas son compuestos procedentes del metabolismo secundario los cuales son producidos durante un estrés de tipo biótico o abiótico, dejando de sintetizarse cuando éste finaliza. En este estudio, analizamos la producción de fitoalexinas por parte de los frutos de pimiento procedentes de cultivo ecológico y convencional y en dos estados de madurez (verde y rojo). Los resultados fueron evaluados sobre la inhibición que producía las fitoalexinas generadas por el fruto, sobre el hongo Aspergillus sp. Los resultados indican diferencias entre los sistemas de cultivo y estados de madurez. El estudio de los mecanismos de defensa naturales de las plantas representa una alternativa para proponer estrategias que permitan mejorar la resistencia de las mismas ante sus patógenos, disminuyendo o evitando el uso de plaguicidas. Palabras clave: Capsicum annuun L., fitoalexinas, capsidiol, estrés biótico. INTRODUCCION A lo largo de todo su ciclo de vida las plantas enfrentan una gran cantidad de factores ambientales adversos para su desarrollo tales como sequía, deficiencia de nutrientes, temperaturas extremas, así como plagas y ataques por diversos patógenos (hongos, virus y bacterias). Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de potenciales patógenos que podrían comprometer seriamente su desarrollo, las plantas pueden ser capaces de mantenerse sanas debido a las estrategias de defensa que han desarrollado a lo largo de su evolución y les han permitido adaptarse a diferentes ambientes. La susceptibilidad a las enfermedades es la excepción en la naturaleza mientras que la resistencia es la norma (Egea et al., 1996). Estas estrategias de defensa pueden clasificarse en dos tipos: (i) Las físicas, son aquellas relacionadas con la estructura de la planta, que como en el caso de la pared celular proporcionan barreras mecánicas contra la penetración de patógenos y, (ii) las bioquímicas, en las cuales las plantas producen compuestos químicos tóxicos para algunos microorganismos. Entre la respuesta bioquímica se encuentra la producción de metabolitos de bajo peso molecular conocidos como fitoalexinas. Las fitoalexinas están ausentes en los tejidos sanos, siendo sintetizadas y acumuladas en las plantas después de la exposición a elicitores bióticos tales como los microorganismos (Bailey, 1987). El capsidiol es la principal fitoalexina del pimiento, la cual ya ha sido aislada en los frutos de pimiento inoculados con esporas de hongos (Stoessl et al., 1972), así como en hojas y tallos (Molot et al., 1984). España es la primera productora de pimiento a nivel europeo con casi un 50% en 2005 y es la 5ª productora del mundo con casi un 4% de la producción mundial (FAO, 2006). A nivel nacional, Almería es la primera productora, con cerca de un 49% de la producción, mientras que la Comunidad Autónoma de Murcia es la segunda
productora con un 15% de la producción nacional (Mapa, 2004). Esta alta producción hace que sea de gran interés la optimización de los cultivos para obtener un alto rendimiento en la producción, sin emplear compuestos químicos de defensa externos a la planta tales como plaguicidas y fungicidas que podrían afectar a la calidad del producto final. Por otro lado, la capacidad de estas plantas en la producción de fitoalexinas nos sería de valiosa utilidad en el planteamiento de estrategias fitosanitarias en la agricultura ecológica. Para ello, este trabajo de investigación trata de determinar la capacidad de producción de fitoalexinas de frutos de pimiento sometidos a tres tipos de cultivo, ecológico, integrado y convencional. Desde un punto de vista práctico podríamos optimizar el uso de un tipo de tratamiento al cultivo el cual va a favorecer el empleo de defensas naturales, en detrimento de compuestos externos artificiales que pueden alterar la calidad de los productos finales obtenidos. Por otra parte, también se podrían emplear metabolitos asi como otros productos de síntesis quimica que activen o estimulen la producción de las enzimas necesarias para la obtención de los metabolitos secundarios sesquiterpénicos, que como el capsidiol, pueden hacer frente a las posibles infecciones o ataques por parte de agentes bacterianos. MATERIAL Y METODOS Las plantas de pimiento variedad Cabezo, tipo California se trasplantaron a un invernadero comercial el 21 de diciembre de 2004. El invernadero se dividió en 8 lisímetros independientes con los tres tratamientos objeto del estudio. El tratamiento ecológico sólo recibió en fertilización 4 Kg./m 2 de estiércol fermentado de caballo y el tratamiento de acuerdo con las normas de la agricultura integrada recibió la mitad de la dosis del tratamiento convencional. Con respecto al riego, se añadió aproximadamente la misma cantidad de agua a los diferentes tratamientos. La lucha contra las plagas y enfermedades consistió en lucha biológica exclusivamente en el ecológico, biológica + química en el integrado y exclusivamente química en el convencional. De estos cultivos se recolectaron aleatoriamente frutos de pimiento (en 2 estados de madurez-rojo y verde). A los frutos se añadió un elicitor (Sulfato de Cobre) en el cual se mantenían 72 horas a temperatura ambiente para dar lugar a la activación del metabolismo y producción de fitoalexina. Transcurrido ese tiempo se recogió el extracto y se añadíeron 50 ml de cloroformo para proceder a la separación de la fase orgánica de la acuosa. A fase orgánica, la que contiene las fitoalexinas y fue separada de la acuosa, se le añadió sulfato de sodio anhidro para eliminar los restos de agua presentes en la disolución, y se procedió a su filtración al vacío. Una vez obtenido el cloroformo con las fitoalexinas disueltas y sin agua en la mezcla, se extrajo la fitoalexina mediante la evaporación del cloroformo, en el rotavapor a 60ºC y 440 mm de Hg. La muestra extraída se preparó en placas cromatográficas TLC de aluminio con Gel de sílice 60 F 254, a las que se le extendio 1 ml de la disolución extraida (1ml de cloroformo para resuspender y las fotoalexinas). La placa se introdujo en un tanque cromatográfico que contenía acetato de etilo y ciclohexano (Fotografía 1).
Fotografía 1. Placa cromatográfica utilizada para la separación y extracción de la fitoalexina de los frutos de pimiento. A los 60 minutos se observó mediante luz UV a 254 nm. Una de las propiedades de las fitoalexinas es su capacidad de emitir dentro del espectro de luz visible cuando es iluminada con luz ultravioleta, lo cual se empleó para su marcaje en la placa cromatográfica y su posterior aislamiento. El cultivo del hongo junto con los compuestos antifúngicos se llevó a cabo en condiciones estériles para evitar posibles contaminaciones con agentes externos y utilizando como medio Agar Rosa de Bengala (ph 7.2±0.2), también fue utilizado el medio Czapek Dox Agar (ph 7.3±0.2) obteniéndose unos resultados similares. En placas petri se incubaron durante 6 días a 30ºC, la disolución con el capsidiol al que se añadió 0.5 ml de una disolución que contenía esporas del hongo Aspergillus sp., El crecimiento del hongo se midió diariamente, teniendo en cuenta el número de colonias, el diámetro de las mismas, la formación de esporas por parte de las colonias del hongo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos se presentan como el efecto de inhibición del crecimiento del hongo Aspergillus sp. en placas petri a los 6 días después de la inoculación (Figura 1). CONVENCIONAL ECOLÓGICO INTEGRADO CONTROL Figura 1. Esporulación del hongo Aspegillus sp. sobre placas de cultivo que contenían fitoalexina procedentes de frutos de pimiento procedentes de diferentes sistemas de cultivo. Con respecto a los frutos recolectados en verde, se ha observado un mayor efecto inhibidor para aquellos frutos procedentes del cultivo integrado que con respecto al convencional o ecológico. A los 6 días de incubación, los frutos procedentes del cultivo integrado (mínima aplicación de productos químicos en combinación con la lucha biológica) presentaron una inhibición del crecimiento del 68% con respecto al
crecimiento de la placa control, donde la inoculación del hongo en el medio tuvo lugar sin el extracto de pimiento. Los frutos verdes procedentes de cultivo ecológico o convencional presentaron, sin embargo, porcentajes de inhibición muy similares del 45 y 47% respectivamente. Cuando los frutos se recolectaron en rojo, podemos observar en primer lugar la menor inhibición del crecimiento del hongo que cuando éstos se recolectaron en verde. Para este estado de madurez sí se observa una mayor diferencia entre los distintos tratamientos. El fruto del tratamiento convencional sólo presentó una inhibición del 9%, respecto a los frutos del tratamiento integrado 14% o ecológico 29% el cual presentó la mayor inhibición. % inhibicion crecimiento colonias 100 80 60 40 20 Fruto verde Fruto verde Convencional Integrado Ecológico 0 4 5 6 Días de incubación 100 % inhibicion crecimiento colonias 80 60 40 20 Fruto rojo Convencional Integrado Ecológico 0 4 5 6 Días de incubación Figura 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo Aspergillus sp., con respecto al crecimiento del control (sin fitoalexinas). De los resultados de este estudio podemos concluir que los frutos de pimiento en verde poseen una mayor concentración de fitoalexina (evaluada como efecto inhibidor del crecimiento del hongo) que en estados de maduración más avanzados (cuando son recolectados en rojo). El empleo de fauna auxiliar tanto en los cultivos ecológicos como integrados favoreció la producción de fitoalexina en los frutos de pimiento.
AGRADECIMIENTOS Esta investigación ha sido financiada por los proyectos INIA/RTA04-035 y de la Fundación Séneca/554/PI/04. G. Ortuño agradece al Fondo Europeo de Desarrollo Regional la financiación de su beca. BIBLIOGRAFÍA Bailey, J.A. En: Genetics and plant Pathogenesis, pp. 233-244. Blackwell Sci. Publishers, Oxford (1987). Egea, C., García-Pérez, M.D., Candela, M.E. 1996. Capsidiol accumulation in Capsicum annuum stems during the Hypersensitive reaction to Phytophora capsici. J. Plant Physiol. 149: 762-764. FAO. 2006. Statistical Databases. http://www.fao.org/waicent/portal/statistics_en.asp Ministerio de agricultura, pesca y alimentación. 2004. http://www.mapa.es/es/agricultura/agricultura.htm Molot, P.M. Mas, P., Conus, P., Ferrié, H. Ricce, P. 1981. Relations between capsidiol concentration, speed of fungal invasion and level of induced resistance in cultivars of pepper (Capsicum annuum) susceptible or resistant to Phytophthora capsici. Physiol. Plant Sci. 13:77-95. Stoessl, A. Unwin, C.H., Ward, E.W.B. 1972. Postinfectional inhibitors from plants. I. Capsidiiol, an antifungal compound from Capsicum frutescens. Phytopathol. Z. 74: 141-152.