TRANSCRIPCION Mecanismo por el cual la información genética del DNA es copiada en forma de RNA por medio de la acción de la enzi ma RNA polimerasa, que cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre los ribonucleótidos. Requerimientos: Cadena de DNA como matriz RNA polimerasa Ribonucleósidos trifosfatos Región promotora Características: RNA polimerasa diferente en eucariotes y procariotes Inicio colocando purina (A o G) Terminación con estructura stemloop, región rica en A y T ó proteína rho
POLIADENILACION
DOGMA CENTRAL EN PROCARIOTES
DOGMA CENTRAL: flujo de información del DNA a las proteínas
DOGMA CENTRAL EN EUCARIOTES
GEN REGION REGULATORIA ESTRUCTURAL PROMOTOR OPERADOR +1 EXONES FIN TRANSCRIPCION INTRONES
OPERON LAC
GEN AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGTATTATAT ATGTCGAAGACA... Inicio de la transcripción Shine Dalgarno Inicio de la traducción
Ciclo de Transcripción Del ARN
TRANSCRIPCION
TRANSCRIPCION
TRANSCRIPCION
Rho independent termination
TERMINACION DEPENDIENTE DE FACTOR ρ
Rho-Dependent Termination
MADURACION DEL RNA MENSAJERO
Nucleosome Remodeling
Introns in Chicken Ovalbumin Gene
Splicing Overview
Spliceosome Assembly
Self- Splicing RNA
Different Modes of Splicing
LA TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS Pregunta 1: Cómo se inicia y termina la transcripción? RNA polimerasa Factores de iniciación y terminación Pregunta 2: Dónde se inicia y termina la transcripción? Secuencias consenso
Conceptos Básicos de la transcripción Hebra codificante y molde Unidad de transcripción Transcrito primario Las Proteínas reguladoras controlan que genes van a ser transcritos y cuando
Algunos conceptos de la transcripción: Promotor Punto de Inicio Curso arriba Curso abajo Terminador
LA RNA POLIMERASA Un único tipo de RNA polimerasa Holoenzima de 465 kd: α 2 ββ σ Núcleo de la enzima: α 2 ββ (capacidad de sintetizar RNA) ββ el centro catalítico α ensamblaje de la enzima Reconocimiento del promotor Interacción proteínas reguladoras σ reconocimiento del promotores Escasa información de la topología de la enzima: 90 x 95 x 100 Å Canal en superficie 25 Å (vía DNA)
Generalidades de la RNA Polimerasa 40 nt/s @ 37 o C Síntesis 5 3 Controla la entrada de nt: minimiza errores Desenrolla DNA al frente Enrolla DNA en la espalda
Generalidades de la RNA Polimerasa Se mueve como los gusanos Compresión Expansión
Las etapas de la Transcripción de DNA Inicio: Formación burbuja de transcripción Elongación: Incorporación de nt Terminación: Frenar a la Polimerasa
Cómo sabe RNA pol donde iniciar síntesis?: El FACTOR σ Unicamente la holoenzima puede iniciar la transcripción El factor s asegura unión del núcleo enzimatico al promotor Variedad factores: activados por cambios ambientales Formas del complejo Holoenzima: 75-80 pb (-55 a +20) Liberación factor: 60 pb (-55 a 35) Extensión RNA: 15-20 pb (30-40 nt)
INICIO DE LA TRANSCRIPCION Complejo binario cerrado: interacción holoenzima-promotor Desnaturalización DNA: complejo binario abierto Se incrementa la afinidad de la unión Incorporación del primer nt: pppg o pppa Formación del complejo ternario Existen ciclos abortivos de la iniciación: punto crítico de 9 pb Si se supera la síntesis de 9 nt, la iniciación es un éxito y se produce la elongación Frecuencia de la iniciación: 1 iniciación/s
Cómo dirige factor σ a RNA pol? Núcleo enzima tiene afinidad por unirse a DNA loose binding Factor σ: dirige holoenzima específicamente hacia los promotores, previene loose binding Reconocimiento de sitios de unión específicos
Cómo encuentra la RNA Pol el promotor? Tres modelos para encontrar los promotores: Difusión: demasiado lento Unión e intercambio de sitios hasta encontrar promotor Deslizamiento sobre DNA (no hay pruebas)
Cómo está definido el punto de inicio de la transcripción? Anatomía de un Promotor
Cómo desvelar el sitio de unión de la RNA Polimerasa?
Preferencia de la RNA Polimerasa por la hebra copia
Interacción del factor σ con el Promotor
Y donde y como se termina la transcripción
MODOS DE TERMINACION Secuencias de terminación Detiene elongación y libera RNA Controla expresión génica Secuencias de terminación muestran poca similaridad Tipos: Terminadores Intrinsecos Terminación dependiente de Rho (o ro) Rho es un factor esencial en E. Coli
Terminadores Intrínsecos
Terminación Dependiente de la Proteína Rho Aunque hay pocos terminadores dependientes de rho Riqueza en residuos C y pobre en G Rho es una proteína de 46 kd, quizas forme un hexámero Tiene actividad ATPasa que depende de RNA y/o presencia de poli-ribonucleótidos de > 50 nt
Cómo termina rho la elongación?
OTRAS PROTEINAS REGULADORAS DE LA TERMINACION El loci nus en E. Coli: NusA Factor de transcripción general Aumenta terminación Tendencia de RNA pol a deternerse Se une al núcleo de RNA pol α 2 ββ σ Iniciación α 2 ββnusa Terminación
Anti-terminación de la transcripción Mecanismo de control Circuitos reguladores de fagos Operones bacterianos Factor de antiterminación regula positivamente expresión génica Las proteínas pn y pq del fago l
La Anti-terminación del fago I
La elongación del RNA
LA TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS Pregunta 1: Qué inicia la transcripción en eucariotas? Factores accesorios RNA polimerasas Pregunta 2: Cómo se inicia la transcripción? Diseño de promotores Diseño de intensificadores
GENERALIDADES Genes clasificados por sus promotores y transcritos por una polimerasa diferente RNA pol I: rrna RNA pol II: mrna RNA pol III: trnas y snrnas Factores accesorios se requieren para iniciar la transcripción Factores accesorios son los responsables de reconocer los promotores para la transcripción Factores generales: inicio sínteis RNA, forma aparato transcripción basal Factores upstream: incrementan eficacia de la iniciación de la transcripción Factores inducibles: regulan la transcripción Regulación positiva y específica de tejido
PROMOTORES E INTENSIFICADORES CONTRIBUYEN A LA TRANSCRIPCIÓN EUCARIOTA
RNA polimerasa I Promotores localizados upstream del punto de inicio Reconoce un conjunto limitado de promotores Promotor bipartito Núcleo del promotor 45 a +20 Suficiente para iniciar transcripción Elemento de control UCE 180 a 107 Incrementa eficiencia transcripción Factores accesorios
FUNCION DE RNA Pol I UBF1 se une a zona G C en núcleo promotor y UCE SL 1 se une cuando UBF1 esta unida Confiere especificidad de especie Cuatro proteínas: TBP (conservada e interacciona con RNA pol I) Posiciona a RNA pol I en punto de inicio (como el factor s) RNA pol I se une cuando UBF1 y SL 1 están unidas
RNA POL III Dos tipos de promotores Para trna 5S : dowstream +55 a +80 Para snrna: upstream Promotores de RNA pol III pueden estar por upstream y downstream del punto de inicio Como siempre: función del promotor elemento cis acting reconocido por factores de transcripción Tres organizaciones de promotores (bipartitos) identificadas Caja TATA confiere especificidad y elementos upstream (PSE y OCT) eficacia
FUNCION RNA POL III Tres TFIIIX involucrados en el inicio de la transcripción TFIIIA proteína con dominios de dedos de zinc TFIIIB complejo de TBP y 2 proteínas TFIIIC complejo de 500 kd (5 subunidades) Se requiere unión de TFIIIA y TFIIIC (factores de ensamblaje) para que se una TFIIIB en caja TATA seguida de RNA pol III. TFIIIB actua como factor de posicionamiento de la RNA pol III (TBP reconoce caja TATA)
RNA polimerasa II Compuesta de muchas subunidades (500 kd) La subunidad más grande tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) con secuencias consenso repetidas de 7aa El CTD puede ser fosforilado Interacciona con gran variedad de promotores RNA pol purificada puede transcribir plantillas de DNA, pero es incapaz de iniciar la transcripción en promotores específicos RNA pol II depende de factores auxiliares: los factores de transcripción TFIIX (X=A,B,C,D,F,G,.) RNA pol II + TFIIX = Aparato basal de la transcripción Dos regiones esenciales del promotor El iniciador (Inr) Py 2 CAPy 4 ( 3 a +5) La caja TATA centrada en 25 Formada por 8 pb Rodeada de G C
Cómo inicia la transcripción RNA pol II?- Etapa 1: unión de TFIID a la caja TATA Quién es TFIID? Complejo (800 kd) formado por: TBP (30 kd): se une a caja TATA Factor de compromiso Coloca a RNA pol II Permite poner juntos TFIIX y RNA pol II TAFs : reconocimiento promotor?? TAF 250 y TAF 150 interaccionan con DNA en pto inicio: eficacia Etapa 2: unión de TFIIA seguida de TFIIB Etapa 3: unión de TFIIF y RNA pol II RAP74: Función helicasa RAP38: interaccion con RNA pol II Requeridos para liberar promotor y permitir reacción de elongación
Etapa 4: Unión de TFIIE, TFIIH y TFIIJ Etapa 5: TFII H actividad helicasa y quinasa (fosforila CTD de pol II)
VISUALIZACION TRIDIMENSIONAL DEL COMPLEJO EN DNA
Cómo esta organizado un promotor? Tres cuatro regiones claramente identificadas por mutagénesis Caja TATA ( 25) componente menos efectivo! Caja CAAT ( 75) afecta eficacia de la transcripción, no especificidad en promotor Caja GC ( 90) GGGCGG une factor SP1 y afecta eficacia de la transcripción
No hay generalidad en cuanto a la localización de las cajas/elementos. Caja Oct menos conservada, papel regulador (especificidad de especie) Conclusión: las interacciones proteína proteína juegan un papel importante en el inicio de la transcripción en eucariotas Regulación de la localización y de la frecuencia
Y la complejidad aumenta. Los intensificadores Incrementan la actividad de los promotores Conjunto de elementos localizados a distancia variable del promotor (upstream o downstream) No funcionan unidireccionalmente Pueden estimular cualquier promotor situado en su vecindad Preeven parte del circuito regulatorio de la transcripción Cómo estimula el amplificador la iniciación? Aumentar la concentración de TFs cerca del promotor por cambiar la estructura del DNA En realidad, todavia es una???
Mutación de los intensificadores afecta la eficacia de transcripción eucariota
Los factores de transcripción contienen dominios independientes
La integridad de los dominios y las interacciones proteína-proteína son indispensables para la activación génica
Los dominios pueden separarse y mantienen la capacidad de activar la transcripción se se re-establece su interacción EL CONCEPTO DE DOBLE HIBRIDO Activación génica Interacciones proteína-proteína
trna
RNA Editing
16s rrna note 3 end Shine- Dalgarno Recognition Site
Ribosomes I
Ribosomes II