CUARTA PARTE ENSAYO DE LAMINILLA DE CONTACTO LA TECNICA DE LA LAMINILLA en contacto de Cholodny y Rossi es una manera sencilla de cualitativamente evaluar relaciones espaciales entre microorganismos del suelo. Aunque esta técnica no es confiable para enumerar organismos del suelo, es útil para ilustrar la orientación de unos microorganismos con otros en las partículas de suelo. La técnica envuelve el enterramiento de laminillas de cristal en el suelo por un periodo de tiempo definido. Luego de incubada, la laminilla se fija con ácido acético y seguido de una tinción que proveerá suficiente contraste para ser examinadas por microscopía (usualmente los microorganismos no tienen color por lo que no serían visible bajo el microscopio). Bajo el microscopio podrá observar bacterias de suelo, actinomicetos, hongos, algas, y otros. Materiales: Muestras de diferentes tipos de suelo (600 g/suelo) glucosa NH 4 NO 3 Cuatro vasos de foam por suelo 40% (v/v) de ácido acético Laminillas de cristal Medios de TSA Pitetas estériles de 1 ml Tubos de dilución
LAMINILLAS DE CONTACTO 2 Bengal rosado (para 100 ml, 5% de la solución acuasa de fenol añada 1 g de bengal rosado y 0.03 g CaCl 2 ) METODOLOGIA 1. Llene cuatro vasos de foam con aproximadamente 150 g de suelo. Rotule uno como Experimental 1, Experimental 2, Experimental 3 y el cuarto como Control. Modifique cada sistema de la siguiente manera: Suelo (-150 g) Glucosa (1% w/w) NH 4 NO 3 (200 mg) H 2 O (inundado) Exp. I Exp. II Exp. III Control 2. Diluya 1 gramo de suelo en tubo de dilución, resuspenda y diluya en serie hasta una dilución final de 10-7. Transfiera y distribuya una alícuota de 0.1 ml sobre medio de TSA; incube a temperatura ambiente por 48 horas y enumere los diferentes tipos de colonia. Determine el contenido de humedad (ver sección Determinacion del Contenido de Humedad en Suelos). 3. Sumerja tres laminillas en cada envase. Cubra cada sistema con papel de aluminio e incube a temperatura de salón (Figura 1). Figura 1: Preparación y posición de las laminillas en el envase.
LAMINILLAS DE CONTACTO 3 4. Examine una laminilla de cada sistema por las siguientes tres semanas de la siguiente manera: i. remueva una laminilla de cada sistema (Figura 2) Figura 2: Muestreo semanal de las laminillas. Cuidadosamente empuje una laminilla hacia uno de los lados antes de removerla verticalmente. Lado de la laminilla a examinarse ii. Lave y remueva partículas mayores de suelo de la superficie de la laminilla. Sumerja la laminilla en 40% (v/v) de ácido acético por 1-3 minutos. CUIDADO con el ácido acético. Use sus GAFAS PROTEC- TORAS. iii. Tiña la laminilla de 5 a 10 minutos con una solución de Bengal Rosado. No permita que la laminilla se seque completamente durante la tinción. Enjuague lijeramente el exceso de tinte en el lavadero. CUIDADO con el manejo del tinte. iv. Seque la laminilla y observe cuidadosamente bajo el microscopio usuando el objetivo de inmersión en aceite. Anote y compare sus resultados semanalmente. v. Enumere semanalmente de cada sistema en medio de TSA repitiendo PASO #2.
LAMINILLAS DE CONTACTO 4 Datos & Análisis: Observaciones: Tipo de Suelo: Contenido de Humedad: Fecha colección de muestras: Anote los resultados de contos en placas: Tiempo UFC/g de suelo (Semanas) Exp. I Exp. II Exp. III Control 0 1 2 3 *incluya tipos de colonias y su descripción
LAMINILLAS DE CONTACTO 5 Anote las observaciones de las laminillas: Tiempo Descripción cualitativa de cada laminilla (Semanas) Exp. I Exp. II Exp. III Control 1 2 3 *incluya tipos de colonias. PREGUNTAS... 1. Describa la abundancia y tipos de colonia que obutva por enumeración de TSA. Cómo comparan estos organismos con los observados directamente en las laminillas? Qué tipos de morfología colonizan tempranamente las laminillas? Quiénes predominan sobre las laminillas al final del experimento? Cómo comparan los resultados observados en los diferentes tratamientos?