Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit Código K4002 15 ml Código K4003 110 ml Indicaciones de uso Para uso diagnóstico in vitro. These instructions se aplican al sistema Dako EnVision +, Peroxidase (DC EnVision+ System, HRP). Este kit está indicado para su uso con anticuerpos primaries de conejo suministrados por el usuario para la identificación cualitativa de antígenos mediante microscopía optica en tejidos normales y patológicos incluidos en parafina y preparaciones de cortes de tejidos o celulares realizados con cryostat. Pueden utilizarse tejidos procesados con diversos fijadores, entre los que se encuentran el etanol, B-5, Bouin, el formol-zinc y el tampón de formol neutro. Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" o las instrucciones del sistema de detección del procedimiento IHC si desea información respecto a: (1) Principios del procedimiento, (2) Materiales necesarios que no se suministran, (3) Almacenamiento, (4) Preparación del espécimen, (5) Procedimiento de tinción, (6) Control de calidad, (7) Resolución de problemas, (8) Interpretación de la tinción, (9) Limitaciones generales. Resumen y explicación Principio del procedimiento Reactivo suministrado El sistema EnVision+ System, HRP es una técnica de tinción IHC que se realiza en dos pasos. El sistema se basa en un polímero marcado de HRP que está conjugado con anticuerpos secundarios. El polímero marcado no contiene avidina ni biotina. Por ello, la tinción no específica que resulta de la actividad endógena avidinabiotina en hígado, riñón, tejido linfático y en cortes realizadas con cryostat puede eliminarse o reducirse signifcativamente. El reactivo en EnVision+, HRP está listo para su utilización. Este sistema es un método extremadamente sensible y, por ello, las diluciones óptimas de anticuerpo primario son hasta 20 veces superiores comparadas con aquellas que se utilizan en las técnicas PAP más tradicionales y varias veces más alta que la de métodos ABC o LSAB tradicionales. Este protocolo ofrece un sistema de generación de señal potenciada para la detección de antígeno presente a baja concentración, para u aumento de la intensidad de tinción aumentada en compensación por el bajo título del anticuerpo primario. Los anticuerpos primarios de conejo reaccionan bien con el polímero marcado. La interpretación clínica de toda tinción positiva o de su ausencia debe evaluarse en el contexto de la presentación clínica, la morfología y de otros criterios histopatológicos. La actividad de la peroxidasa endógena puede mitigarse procediendo al incubado inicial del espécimen durante cinco minutos en bloqueante de peróxido. A continuación, el espécimen se incuba con un anticuerpo primario de conejo adecuadamente caracterizado y diluido, seguido de la incubación con el polímero marcado, mediante dos incubaciones secuenciales de 30 minutos. Debe mencionarse que para los anticuerpos que precisan digestión enzimática o recuperación de blancos puede ser necesario para aumentar el tiempo de incubación con el anticuerpo primario y marcado con polímero en unos 5 y 10 minutos. La tinción se complete mediante una incubación de 5 a 10 minutos con un sustrato cromógeno adecuado. Código K4002: En este kit se suministran los siguientes materiales, que son suficientes para el procesado de 150 cortes de tejido, basado en 100 µl por corte: Botella N.º. Cantidad Descripción 2 1x15 ml Polímero marcado El polímero marcado con peroxidasa conjugado con inmunoglobulinas de cabra anti anticuerpos de conejo en tampón Tris-HCl que contiene una proteína estabilizadora y un agente antimicrobiano. Código K4003: En este kit se suministran los siguientes materiales, que son suficientes para el procesado de 1100 cortes de tejido, basado en 100 µl por corte: Botella N.º. Cantidad Descripción 1 1x110 ml Polímero marcado El polímero marcado con peroxidasa conjugado con inmunoglobulinas de cabra anti anticuerpos de conejo en tampón Tris-HCl que contiene una proteína estabilizadora y un agente antimicrobiano. (107944-004) 302063ES_003 p. 1/6
Materiales necesarios que no se suministran Paños absorbentes para limpieza Tejido de control, positivo y negativo Agente de contratinción; en solución acuosa, como hematoxilina de Mayers o hematoxilina de Mayers modificada por Lillie (código S3309) Cubreobjetos Agua destilada Reactivo bloqueante de peroxidasa endógena, como Dual Endogenous Enzyme Block (n.º de catálogo S2003) Etanol, absoluto y 95% Microscopio óptico (20x 800x) Medio de montaje, como medio de montaje Glycergel (código C0563) o medio de montaje en solución acuosa Faramount, listo para su utililización (código S3025) o medio de montaje permanente en solución no acuosa, Ultramount (código S1964) Anticuerpos primaries y reactivo de control negativo Portaobjetos, recubiertos de poli-l-lisina o silanizados (código S3003) Recipientes o baños de tinción Solución sustrato-cromógeno como AEC+ Substrate-Chromogen (código K3469, 110 ml, listo para usar) o Liquid DAB+ (código K3468) Temporizador (capaz de cronometrar intervalos de 3 40 minutos) Botellas de lavado Solución Wash Buffer Xilol, tolueno o sustitutos de xilol Materiales opcionales que se necesitan, que no se suministran hidróxido de amonio, 15 mol/l diluido al 0.037 mol/l PAP Pen (código S2002) Precauciones Almacenamiento 1. Para uso por profesionales. 2. No utilice los reactivos después de la fecha de caducidad para el método de almacenamiento prescrito. Si los reactivos se almacenan en condiciones distintas de las especificadas, éstas deben ser verificadas por el usuario. 3. No sustituya los reactivos por los de otro número de lote o por los de kits procedentes de otros fabricantes. 4. Los enzimas y sustrato cromógenos pueden verse afectados si quedan expuestos a niveles de luz demasiados intensos. No almacene los componentes ni realice la tinción bajo una luz demasiado intensa, como la luz solar directa. 5. La aplicación de tiempos o temperaturas de incubación diferentes de los especificados pueden producir resultados; el usuario deberá validar cualquier modificación en este sentido. 6. Como con cualquier producto derivado de fuentes biológicas, deben seguirse los procedimientos de manipulación apropiados. 7. Utilice el equipo de protección personal adecuado para evitar el contacto con los ojos y la piel. 8. Cualquier solución no utilizada debe desecharse con arreglo a las normativas locales, provinciales y nacionales. EnVision+, HRP debe almacenarse a una temperatura entre 2 y 8 C. No se debe congelar. No lo utilice después de la fecha de caducidad impresa en los viales de reactivos y las etiquetas del producto. Cualquier alteración en el aspecto de cualquiera de los reactivos, como la aparición de precipitados puede indicar la inestabilidad o deterioro del kit. En estos casos, el/los reactivo(s) no deben utilizarse. No existen signos claros que indiquen que este producto sea inestable. Por lo tanto, los controles positivos y negativos deben realizarse simultáneamente con las muestras del paciente. Si observa tinciones inesperadas que no puedan atribuirse a las variaciones en los procedimientos de laboratorio y sospecha que existe un problema con el producto, contacte con el servicio de asistencia técnica de Dako. (107944-004) 302063ES_003 p. 2/6
Preparación del reactivo Es conveniente preparar los siguientes reactivos antes de proceder a la tinción. Solución de lavado Se recomienda utilizar la solución TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (código S3006) como solución tampón de lavado en la detección IHC tanto automatizada como manual. Las soluciones TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (código S1968) y PBS 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (código S3024) también son adecuadas como soluciones tampón de lavado en tinciones manuales. No se recomienda el uso de solución de lavado que contenga azida sódica. La presencia de azida sódica inactiva la peroxidasa (HRP, por sus siglas en inglés) lo que supone una tinción negativa. Almacene la solución tampón no utilizada a una temperatura entre 2 y 8 C. Deseche dicha solución si aparecen turbiedades. Puede utilizar agua destilada para aclara el bloqueante de peroxidasa, el sustrato y el agente de contratinción. Anticuerpo primario Los anticuerpos NP-Series Plus listo para su utilización se optimizan y se recomienda su utilización con los sistemas de detección de alta sensibilidad Dako Plus. Dako también suministra anticuerpos concentrados. El usuario final debe optimizar los anticuerpos concentrados. Las diluciones deben prepararse utilizándose diluyente de anticuerpos Antibody Diluent (código S0809) u otro diluyente que contenga 0,05 mol/l tampón Tris con 1% de seroalbúmina bovina (BSA, por sus siglas en inglés). Los anticuerpos Dako N- Series listo para su utilización no están optimizados para su utilización con los sistemas de detección Dako Plus. Con la mayoría de los anticuerpos primarios que se utilizan con este kit, tiempos de incubación de 30 minutos son suficientemente prolongados. Reactivo de control negativo Lo ideal es que el reactivo de control negativo contenga un anticuerpo que muestre una reactividad no específica en tejidos humanos o suero normal/ no immune en la misma matriz/solución que el anticuerpo o primario diluido. El reactivo de control negativo debe ser de la misma subclase y especie animal que el anticuerpo primario, diluido en la misma concentración de inmunoglobulina o proteína que el anticuerpo primario diluido y utilizando el mismo diluyente. El periodo de incubación del reactivo de control negativo debe corresponder a la del anticuerpo primario. Siempre que utilice los anticuerpos Dako NP-Series Plus listos para su utilización, se recomienda utilizar un reactivo de control negativo Universal Negative Control(s)+. Si desea información relativa a la preparación del reactivo de control negativo, consulte la sección de Control de calidad. Agente de contratinción El producto final coloreado de la reacción de tinción es insoluble en alcohol y puede utilizarse con un agente de contratinción como la hematoxilina de Mayer o la hematoxilina de Mayer modificada por Lillie (código S3309). Tras la contratinción con hematoxilina, realice un aclarado abundante en agua destilada y, seguidamente, sumerja los cortes de tejido en un baño de amoníaco 0,037 mol/l o agente azulante similar. El agua de amoniaco 0,037 mol/l se prepara mezclando 2,5 ml de hidróxido de amonio 15 mol/l (concentrado) a un 1 litro de agua. El agua de amoníaco 0,037 mol/l que no se utilice puede conservarse a temperatura ambiente (20 25 C) e n un frasco tapado herméticamente hasta 12 meses. Consulte las indicaciones del fabricante si desea conocer procedimientos de contratinción alternativos. Medio de montaje Se recomienda utilizar medio de montaje Glycergel Mounting Medium (código C0563) o medio Faramount, Aqueous Mounting Medium, listo para utilizar (código S3025) para el montaje en solución acuosa. Glycergel debe calentarse como mínimo a 50 C justo antes de s u utilización. También puede utilizarse el medio de montaje en solución no acuosa (Ultramount, code S1964). Preparación de especímenes Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" o la hoja de especificaciones del anticuerpo. Antes de proceder a la tinción IHC, los tejidos deben estar fijados y procesados. La fijación evita la autólisis y la putrefacción de los tejidos extraídos, mantiene su antigenicidad, potencia el índice de refracción de los constituyentes del tejido y aumenta la resistencia de los elementos celulares al procesado de la muestra. El procesado del tejido supone su deshidratación, la retirada de los agentes deshidratantes, la infiltración del medio de inclusión, y la inclusión y seccionado del tejido. Los fijadores que suelen utilizarse en la preparación de tejidos para IHC se detallan en las instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica. Los datos que se aportan son a título informativo. El procedimiento óptimo debe determinarlo y verificarlo el usuario. (107944-004) 302063ES_003 p. 3/6
Procedimiento de tinción Notas referentes al procedimiento El usuario debe leer estas instrucciones atentamente y familiarizarse con los productos antes de su utilización. Los reactivos y las instrucciones suministrados con este kit están pensados para un rendimiento óptimo. Una nueva dilución de los reactivos o la alteración de las temperaturas de incubación pueden dar lugar a resultados erróneos. Todos los reactivos deben equilibrarse a temperatura ambiente (20 25 C) antes de la inmunotinción. De forma similar, todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente. No deje que los cortes de tejido se sequen durante el procedimiento de tinción. Los cortes de tejido que se hayan secado durante el proceso pueden mostrar una mayor tinción no específica. Cubra los portaobjetos que estén expuestos a corrientes de aire. Si se utilizan incubaciones prolongadas, coloque los tejidos en un ambiente húmedo. La sensibilidad del sistema EnVision+ System, HRP puede aumentarse prolongando los tiempos de incubación de los pasos 2 y 3 entre 5 y 10 minutos. Protocolo de tinción PASO 1 BLOQUEANTE DE PEROXIDASA Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos. Con la ayuda de una tela sin pelusa (como una toallita Kimwipe o una gasa), limpie cuidadosamente alrededor del espécimen para eliminar cualquier líquido presente y conservar los reactivos dentro del área especificada. Aplique suficiente bloqueante de peroxidasa Peroxidase Block de la botella 1 como para cubrir el espécimen. Incúbelo 5 (±1) minutos. Aclárelo suavemente con agua destilada procedente o solución tampón procedente de un frasco de lavado.(no aplique el flujo directamente sobre el tejido) y colóquelo en un baño de tampón recién preparado. PASO 2 ANTICUERPO PRIMARIO O REACTIVO DE CONTROL NEGATIVO Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos y límpielos de la forma indicada anteriormente. Aplique suficiente anticuerpo primario diluido o reactivo de control negativo para cubrir el espécimen. Incúbelo 30 (±1) minutos. Aclárelo suavemente con solución de lavado procedente de la botella de lavado (no aplique el flujo directamente sobre el tejido) y colóquelo en un baño de tampón recién preparado. Si debe interrumpirse el procedimiento de tinción, los portaobjetos pueden guardarse en un baño de tampón después de la incubación del anticuerpo primario (paso 2) como máximo una hora a temperatura ambiente (20 25 C) sin que afecte al rendimiento de la tinci ón. PASO 3 POLÍMERO MARCADO DE PEROXIDASA Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos y límpielos de la forma indicada anteriormente. Aplique suficiente polímero marcado Labelled Polymer de la Botella 2 para cubrir el espécimen. Incúbelo 30 (±1) minutos. Aclare los portaobjetos como en el paso 2. PASO 4 SUSTRATO-CROMÓGENO Limpie los portaobjetos como se indica anteriormente. Aplique suficiente solución sustrato-cromógeno para cubrir el espécimen Incúbelo entre 5 y 10 minutos. Aclárelo suavemente con agua destilada procedente de la botella de lavado (no aplique el flujo directamente sobre el tejido). Recoja los residuos de sustrato-cromógeno n un contenedor para materiales peligrosos para desecharlos de forma apropiada. PASO 5 HEMATOXILINA PARA CONTRATINCIÓN (opcional) Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina en solución acuosa (código S3309). La duración de la incubación depende de la concentración de hematoxilina utilizada. Aclare suavemente en un baño de agua destilada. Sumerja los portaobjetos 10 veces en un baño de 0,037 mol/l de amoníaco o agente azulante similar. Aclare los portaobjetos suavemente en un baño de agua destilada o desionizada entre 2 y 5 minutos. PASO 6 MONTAJE Los especímenes pueden montarse y taparse con cubreobjetos con un medio de montaje acuoso como Glycergel Mouting Medium (código C0563) o Faramount, (código S3025) o en medios de montaje permanentes en solución no acuosa como Ultramount (código S1964). Los portaobjetos también pueden deshidratarse y montarse permanentemente. (107944-004) 302063ES_003 p. 4/6
Control de calidad Las diferencias que pueden darse en el procesado de las muestras o técnicas en el laboratorio del usuario puede suponer una variabilidad significativa de los resultados obtenidos, lo que establece una necesidad de realización de controles propios. Consulte las indicaciones de control de calidad del Programa de certificación de inmunocitoquímica del Colegio de patólogos americanos (CAP, por sus siglas en inglés) y las referencias 1 a 3 si desea información adicional. Consulte los detalles relativos a sensibilidad e inmunorreactividad en el prospecto de cada anticuerpo primario que se utilice. Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" si desea información respecto a los controles positivo y negativo. Interpretación de la tinción Limitaciones específicas del producto Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" si desea indicaciones para la interpretación de la tinción. El resultado de la tinción de tejidos depende de la manipulación y el procesamiento al que someta el tejido antes de su tinción. Una técnica incorrecta en el fijado, congelado, descongelado, lavado, secado, calentado o seccionado, o la contaminación por contacto con otros tejidos o líquidos, puede producir artefactos o resultados falso negativos. La utilización de fiadores antiguos o no tamponados, o la aplicación de calor excesivo durante el procedimiento de inclusión (temperaturas superiores a 60ºC) puede suponer una disminución de la sensibilidad. Puede detectarse actividad de la peroxidasa endógena o pseudoperoxidasa en hemoproteínas como son la hemoglobina, mioglobina, citocromo y catalasa, así como en eosinófilos. 4,5 Esta actividad puede inhibirse incubando los especímenes con el bloqueante de peroxidasa Peroxidase Block durante cinco minutos antes de la aplicación del anticuerpo primario. Las extensiones de sangre y de médula ósea congeladas pueden tratarse con este reactivo. Sin embargo, este procedimiento no anula el pigmento marrón rojizo de las hemoproteínas. También puede utilizarse una solución de metanol y peróxido de hidrógeno, sin embargo. Sin embargo, algunos antígenos puede desnaturalizarse en este proceso. Es posible que los tejidos de las personas infectadas con el virus de la hepatitis B y con antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) muestren tinción no específica con peroxidasa. 6 El suero normal o no inmune de la misma fuente animal que el antisuero secundario utilizado en los pasos bloqueantes puede causar resultados falso negativos o falso-positivos dada la presencia de auto-anticuerpos o anticuerpos naturales. Los reactivos se han diluido de forma óptima. Una nueva dilución puede ocasionar la pérdida de la tinción antigénica. Referencias 1. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 3. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 4. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 5. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 6. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 7. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 8. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 9. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Referencias adicionales Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 (107944-004) 302063ES_003 p. 5/6
Edition 11/12 (107944-004) 302063ES_003 p. 6/6